JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mevcut protokol, farelerde stabil ve tekrarlanabilir bir demiyelinasyon modeli oluşturmak için stereotaksik bir çerçeve yoluyla iki noktalı bir lizofosfatidilkolin enjeksiyonunu tanımlamaktadır.

Özet

Reseptör aracılı lizofosfolipid sinyalizasyonu, başta multipl skleroz (MS) olmak üzere çeşitli nörolojik hastalıkların patofizyolojisine katkıda bulunur. Lizofosfatidilkolin (LPC), inflamasyonla ilişkili endojen bir lizofosfolipiddir ve miyelin lipitlerine toksisite ile hızlı hasara neden olarak fokal demiyelinizasyona yol açabilir. Burada, stereotaktik iki noktalı LPC enjeksiyonu için doğrudan ciddi demiyelinasyona neden olabilecek ve deneysel demiyelinasyon hasarını cerrahi prosedürle farelerde hızlı ve istikrarlı bir şekilde çoğaltabilecek ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu nedenle, bu model demiyelinasyon hastalıkları, özellikle MS ile oldukça ilgilidir ve klinik olarak ilgili araştırmaların ilerlemesine katkıda bulunabilir. Ayrıca, LPC enjekte edilen farelerin korpus kallozumunda demiyelinizasyonun zaman seyrini göstermek için immünofloresan ve Luxol hızlı mavi boyama yöntemleri kullanılmıştır. Ek olarak, modelleme sonrası farelerin bilişsel işlevlerini değerlendirmek için davranışsal yöntem kullanılmıştır. Genel olarak, stereotaksik bir çerçeve yoluyla lizofosfatidilkolinin iki noktalı enjeksiyonu, daha fazla çalışma için farelerde bir demiyelinasyon modeli oluşturmak için kararlı ve tekrarlanabilir bir yöntemdir.

Giriş

Reseptör aracılı lizofosfolipid sinyalizasyonu, hemen hemen tüm organ sistemlerinin çeşitli fizyolojik süreçlerini içerir1. Merkezi sinir sisteminde (MSS), bu sinyal multipl skleroz (MS) gibi otoimmün nörolojik hastalıkların patojenitelerinde kritik bir rol oynar. Multipl skleroz, patolojik demiyelinasyon ve inflamatuar yanıt ile karakterize, nörolojik disfonksiyon ve kognitif bozukluğa neden olan kronik immün aracılı bir hastalıktır 2,3. Erken hastalık sırasında sürekli nüks ve remitting sonrasında, çoğu hasta sonunda beyinde geri dönüşü olmayan hasara ve sonuçta sakatlığa neden olabilecek ikincil-ilerleyici aşamaya ilerler4. İkincil-ilerleyici seyrin patolojik özelliğinin, enflamatuar lezyonların neden olduğu demiyelinizan plaklar olduğuna inanılmaktadır5. MS için mevcut tedaviler nüks riskini önemli ölçüde azaltabilir. Bununla birlikte, ilerleyici MS6'nın neden olduğu uzun süreli demiyelinizan hasar için hala etkili bir tedavi yoktur. Bu nedenle, beyaz cevher dejenerasyonuna odaklanan preklinik terapötikleri incelemek için istikrarlı bir şekilde kurulmuş ve kolayca çoğaltılabilir bir model gereklidir.

Demiyelinasyon ve remiyelinasyon, multipl skleroz gelişiminde iki önemli patolojik süreçtir. Demiyelinasyon, proinflamatuar fenotipler7 ile mikroglia tarafından indüklenen aksonların etrafındaki miyelin kılıfının kaybıdır ve sinir uyarılarının yavaş iletilmesine yol açarak nöron kaybına ve nörolojik bozukluklara neden olur. Remiyelinasyon, oligodendrositlerin aracılık ettiği, bozuklukların nörodejenerasyona ve bilişsel bozulmaya yol açabileceği endojen bir onarım yanıtıdır8. Enflamatuar yanıt, hem miyelin hasarının derecesini hem de onarımını etkileyen tüm süreç için çok önemlidir.

Bu nedenle, MS'in karmaşıklığı nedeniyle, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), toksik-demiyelinizan modeller, cuprizon (CPZ) ve lizofosfatidilkolin (LPC)9 dahil olmak üzere in vivo demiyelinizan lezyonları taklit etmek için çeşitli hayvan modelleri oluşturulmuştur. . LPC, inflamasyonla ilişkili endojen bir lizofosfolipiddir ve miyelin lipitlerine toksisite ile hızlı hasara neden olabilir ve fokal demiyelinizasyona yol açabilir. Önceki raporlara ve araştırmalara dayanarak10,11, bazı modifikasyonlarla birlikte iki noktalı enjeksiyonun ayrıntılı bir protokolü sağlanmıştır. Genel olarak, klasik tek noktalı LPC enjeksiyon modeli sadece enjeksiyon bölgesinde lokal demiyelinasyon üretir ve sıklıkla spontan remiyelinasyon12,13 eşlik eder. Bununla birlikte, iki noktalı enjeksiyon LPC modeli, LPC'nin fare korpus kallozumunda doğrudan demiyelinasyonu indükleyebileceğini ve az miktarda miyelin rejenerasyonu ile daha dayanıklı demiyelinizasyona neden olabileceğini gösterebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Çin'deki Huazhong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi, Tongji Tıp Koleji Hayvan Bakım Komitesi Enstitüsü tarafından onaylandı. Bu çalışmada yetişkin C57BL/6 erkek ve dişi fareler (vahşi tip, WT; 20-25 g; 8-10 haftalık) kullanılmıştır. Fareler ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). Fareler, su ve gıda ile sağlanan ad libitum ile spesifik bir patojen içermeyen (SPF) hayvan tesisinde barındırıldı. 22 °C sıcaklık ve %55-%60 bağıl nem standart koşullarında alternatif 12 saatlik aydınlık ve karanlık döngü periyodunda tutuldular.

1. LPC çözeltisi hazırlama

  1. % 10'luk bir LPC çözeltisi oluşturmak ve 500 μL'lik bir santrifüj tüpüne aktarmak için 25 mg LPC tozunu (Malzeme Tablosuna bakınız) 250 μL kloroform ve metanol karışık çözelti (1: 1) ile çözün.
    NOT: LPC tamamen çözülmemişse, santrifüj tüpünü ultrasonik bir temizleyiciye yerleştirin ve düzgün bir çözelti elde etmek için ~ 1 saat boyunca 40 kHz'de ultrasonikte yapın.
  2. Çözeltiyi 3 μL / tüpe bölün ve -80 ° C'de saklayın.
    NOT: Çözelti ~ 2 yıl saklanabilir.
  3. Ameliyattan önce, çözeltiyi (adım 1.2.) 27 μL% 0.9 NaCl çözeltisi ile seyreltin ve çözeltiyi 37 ° C'de sabit sıcaklıkta bir su banyosunda tutun.
    NOT: Enjeksiyona başlamadan hemen önce çözeltiyi hazırlayın.

2. Cerrahi hazırlık

  1. 5 μL'lik bir şırıngaya bağlanmak için 32 G, 2 iğne içinde bir iğne kullanın (bkz. Mikrolitre şırınganın engelsiz olduğundan emin olun. Enjeksiyonun hazırlanması için 5 μL LPC çözeltisi çekin.
  2. Fareyi, yaklaşık 0.3 L / dak hızında% 100 oksijen ile karıştırılmış% 3 izofluran buharlaştırıcısına bağlı bir indüksiyon odasında anestezi yapın.
  3. Solunum pürüzsüzken ayak parmağını sıkıştırma refleksinin eksikliği ile anestezi derinliğini onaylayın.
  4. Elektrikli tıraş makinesi kullanarak farenin başını kulaklar arasında tıraş edin. İşlem sırasında kornea kuruluğunu önlemek için yağlayıcı göz damlası uygulayın.
  5. Ardından, fareyi sırt tarafı yukarı bakacak şekilde stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve kafayı bir burun konisi ve diş kelepçesi ile sabitleyin. Anesteziyi burnundan %1.2-%1.6 izofluran ile sürdürün.
    NOT: İzofluran konsantrasyonu, farelerin solunum durumuna göre ayarlanabilir.

3. Cerrahi prosedür

NOT: Hayvanlar tüm prosedürler sırasında bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirilir.

  1. Fareyi iki taraflı kulak çubuklarıyla stereotaksik aparata sabitleyin. Kulak çubuklarının düz olduğundan ve başın yatay ve sabit olduğundan emin olun.
  2. İyodofor ve ardından dairesel harekette alkol ile birkaç kez silerek kafadaki cildi dezenfekte edin. Ardından, kafatasını ortaya çıkarmak için kafa derisinin orta çizgisi boyunca yaklaşık 1,5 cm'lik küçük bir kesiyi kesmek için bir neşter kullanın.
  3. Kafatasını bregma, lambda ve posterior fontanelle açığa çıkana kadar% 1 hidrojen peroksit içine batırılmış bir pamuklu çubukla silin. Şırıngayı stereotaksik aparata yerleştirin.
    NOT: Hidrojen peroksiti dikkatli kullanın ve çevre dokulara dokunmaktan kaçının.
  4. Hayvanın başının yatay olarak konumlandırılmasını sağlayın (hem ön hem de arka ve sol ve sağ).
    1. Stereotaksik çerçevenin Z ekseni düğmesini, iğne ucu ve kafatası bükülmeden sadece temas edecek şekilde ayarlayın, ardından Z ekseni koordinatını ölçün. Bregma ve posterior fontanelle'nin Z koordinatlarını kontrol edin.
    2. Kulak çubuğunu, bregma ve posterior fontanelle'nin Z koordinatları arasındaki fark 0,02 mm'den fazla olmayacak şekilde ayarlayın. Ardından, orta hattın sol ve sağ taraflarındaki karşılık gelen konumların Z koordinatlarını ölçmek için aynı yöntemi izleyin. Sol ve sağın aynı seviyede olduğundan emin olmak için kulak çubuğunu ayarlayın.
  5. Korpus kallozumu bulun. XYZ kaynağını bregma olarak ayarlayın.
    NOT: İlk enjeksiyon bölgesi bregmaya 1,0 mm yanal, 2,4 mm derinlikte ve 1,1 mm öndür. İkinci enjeksiyon bölgesi bregmaya 1.0 mm yanal, 2.1 mm derinlikte ve 0.6 mm öndür. Örneğin, bregmanın koordinatı (0,0,0) şeklindedir. (-1, 1.1, X) ve (-1, 0.6, Y) olarak işaretlenmiş karşılık gelen konumun Z koordinatını ölçün. Korpus kallozumun ilk enjeksiyon bölgesi koordinatının (-1, 1.1, -[X + 2.4]) ve ikinci enjeksiyon bölgesinin (-1, 0.6, -[Y + 2.1]) olduğu belirlenebilir.
  6. Enjeksiyon bölgesi belirlendikten sonra, kafatası üzerinde steril bir işaretleyici ile bir işaret yapın ve koordinatları kaydedin.
  7. İşaretli bölgeyi kafatası matkabıyla nazikçe delin (bkz. Herhangi bir kanamayı önlemeye özen gösterin.
  8. İğneyi yavaşça verilen koordinatlara hareket ettirin ve enjeksiyona başlayın. Korpus kallozum demiyelinizasyonunu indüklemek için, her enjeksiyon bölgesine (adım 3.5.) 0.4 μL / dak hızında 2 μL LPC çözeltisi (adım 1.) enjekte edin.
  9. Enjeksiyondan sonra, iğneyi her bölgede 10 dakika daha tutun.
    NOT: İki enjeksiyon aralığının 20 dakikadan fazla olmadığından emin olun.
  10. Cildi 4-0 dikişle dikin ve hayvanın 10 dakika içinde uyanmasını bekleyin. Analjezikleri postoperatif olarak kurumsal hayvan bakım yönetmeliklerine uygun olarak uygular.
    NOT: Ötanazi için önerilen süre, deneyin amacına göre belirlenebilir.

4. Fokal demiyelinizasyon için numune ekstraksiyonu

NOT: Bu adımla ilgili ayrıntılar için lütfen daha önce yayınlanmış olan14 numaralı rapora bakın.

  1. Nötr kırmızı boyayı (bakınız Malzeme Tablosu) fosfat tamponlu salin (PBS) içinde %1'lik bir çözelti içinde çözün.
  2. fareleri feda etmeden saatler önce (ayrıntılar için önceki referans 10'a bakın), her fare için intraperitoneal enjeksiyonla PBS'ye500 μL% 1 nötr kırmızı boya enjekte edin.
  3. Kardiyak perfüzyon12'yi, 4 °C'de önceden soğutulmuş 30 mL% 0.1 PBS ile gerçekleştirin.
  4. Beyni bir beyin kalıbı ile 1 mm'ye dilimleyin (bkz.
  5. Mikroskop altında nötr kırmızı ile boyanmış lezyonu görselleştirin ve lezyonu ayırın.
    NOT: Sonraki analizlerin doğruluğunu artırmak için çevredeki normal dokuyu mümkün olduğunca çıkarın. Lezyon dokusu RT-PCR, elektron mikroskobu ve western blot analizleri ile incelenebilir.

5. Histolojik boyama ve immünofloresan

  1. Histolojik boyama ve immünofloresan12 için, kardiyak perfüzyondan sonra (adım 4.3.), beyin 10'unu çıkarın, gece boyunca% 4 PFA'da (4 ° C'de) sabitleyin ve%30 sakarozda tamamen dehidratasyon.
  2. Sabit sıcaklıkta (-20 ° C) dondurulmuş bir dilimleyici10 kullanarak 20 mm koronal beyin bölümlerine kesin.
  3. Luxol hızlı mavi (LFB) boyama, immünofloresan ve batı lekesi10 için dilimleri kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

LPC'nin iki noktalı enjeksiyonu daha dayanıklı bir demiyelinizasyon ile sonuçlandı
LPC esas olarak miyelin toksisitesi ve akson bütünlüğünün bölünmesi ile hızlı hasara yol açar15. Enjeksiyon günü 0. gün olarak kabul edildi. Fareler 10-28 günlük bir süre boyunca tutuldu (10 dpi ve 28 dpi). Luxol hızlı mavi (LFB) boyama10, bu zaman noktalarında farelerde demiyelinizasyon alanını değerlendirmek için kullanıldı. İki noktalı e...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

MSS'nin kronik demiyelinizan bir hastalığı olan MS, genç erişkinlerde nörolojik disfonksiyonun en yaygın nedenlerinden biridir20. Klinik olarak, MS hastalarının yaklaşık% 60-80'i, sekonder-ilerleyici bir MS 21,22 gelişmeden önce nüks ve remisyon döngüsünü yaşar ve sonunda kümülatif hareket bozukluklarına ve zamanla bilişsel eksikliklere yol açar23. Şu anda, tek bir deneysel model, hastalığ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından desteklenmiştir (Hibeler: 82071380, 81873743).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolkSigma-AldrichL4129-25MG
32 gauge NeedleHAMILTON7762-05
10 μl syringeHAMILTON80014
high speed skull drillstrong,koreastrong204
drillHager & Meisinger, Germany REF 500 104 001 001 005
Matrx Animal Aneathesia VentilatorMIDMARKVMR
Portable Stereotaxic Instrument for MouseReward68507
Micro syringeRewardKDS LEGATO 130
Isoflurane VETEASY
ParaformaldehydeServicebioG1101
Phosphate bufferBOSTERPYG0021
LuxoL fast bLueServicebioG1030-100ML
SutureFUSUNPHARMA20152021225
Brain moldReward68707
Electron microscope fixativeServicebioG1102-100ML
Neutral red (C.I. 50040), for microscopy CertistainSigma-Aldrich1.01376
Anti-Myelin Basic Protein Antibody Millipore#AB5864
Anti-GST-P pAbMBL#311
Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15)Thermo Fisher Scientific14-5698-95
Beta Actin Monoclonal AntibodyProteintech66009-1-Ig 
Myelin Basic Protein Polyclonal AntibodyProteintech10458-1-AP
OLIG2 Polyclonal AntibodyProteintech13999-1-AP
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)YEASEN34206ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) YEASEN34412ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) YEASEN34212ES60
HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)abclonalAS014
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) abclonalAS003
Adult C57BL/6 male and female miceHunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd

Referanslar

  1. Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864(2021).
  2. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  3. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  4. Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).
  5. Filippi, M., et al. Multiple sclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43(2018).
  6. Villoslada, P., Steinman, L. New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis. Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).
  7. Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936(2018).
  8. Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. Remyelination in the CNS: From biology to therapy. Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).
  9. Gentile, A., et al. Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2197(2019).
  10. Chen, M., et al. Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333(2020).
  11. Luo, Q., et al. A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination. Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).
  12. Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).
  13. Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis. Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).
  14. Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
  15. Plemel, J. R., et al. Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy. Glia. 66 (2), 327-347 (2018).
  16. Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
  17. Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).
  18. Kassis, H., et al. Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke. Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).
  19. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
  20. Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).
  21. Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
  22. Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45(2022).
  23. Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128, Pt 11 2705-2712 (2005).
  24. Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality). Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
  25. Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum. Journal of Neuroimmunology. 334, 576995(2019).
  26. Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. The cuprizone model for demyelination. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).
  27. Zhan, J., et al. The cuprizone model: Dos and do nots. Cells. 9 (4), 843(2020).
  28. Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).
  29. Merkler, D., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions. Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).
  30. Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 183Demiyelinasyonlizofosfatidilkolinkorpus kallozummiyelinmultipl sklerozbeyaz cevher hasar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır