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要約

本プロトコールは、マウスにおいて安定かつ再現可能な脱髄モデルを生成するための定位フレーム を介した リゾホスファチジルコリンの2点注射を記載する。

要約

受容体媒介性リゾリン脂質シグナル伝達は、多様な神経疾患、特に多発性硬化症(MS)の病態生理学に寄与する。リゾホスファチジルコリン(LPC)は、炎症に関連する内因性リゾリン脂質であり、ミエリン脂質に対する毒性を伴う迅速な損傷を誘発し、局所脱髄をもたらす可能性がある。ここでは、重度の脱髄を直接引き起こし、外科的処置によってマウスにおいて実験的脱髄傷害を迅速かつ安定に複製することができる定位2点LPC注射のための詳細なプロトコルが提示される。したがって、このモデルは脱髄疾患、特にMSと非常に関連しており、関連する臨床的に関連する研究の進歩に貢献することができる。また、免疫蛍光法およびルクソール高速青色染色法を用いて、LPCを注射したマウスの脳梁における脱髄の経時変化を描写した。さらに、行動法を用いて、モデリング後のマウスの認知機能を評価した。全体として、定位フレーム を介した リゾホスファチジルコリンの2点注射は、さらなる研究のためにマウスにおいて脱髄モデルを生成するための安定的かつ再現性のある方法である。

概要

受容体媒介性リゾリン脂質シグナル伝達は、ほとんどすべての器官系の多様な生理学的プロセスを伴う1。中枢神経系(CNS)において、このシグナル伝達は、多発性硬化症(MS)などの自己免疫性神経疾患の病原性において重要な役割を果たしている。多発性硬化症は、病理学的脱髄および炎症反応を特徴とする慢性免疫媒介性障害であり、神経学的機能障害および認知障害を引き起こす2,3。初期の疾患の間に連続的な再発および寛解の後、ほとんどの患者は最終的に二次進行期に進行し、脳に不可逆的な損傷およびその結果生じる障害を引き起こす可能性がある4。二次進行性経過の病理学的特徴は、炎症性病変によって引き起こされる脱髄プラークであると考えられている5。MSの既存の治療法は、再発のリスクを大幅に減らすことができます。しかしながら、進行性MS6によって引き起こされる長期脱髄損傷に対する有効な治療法はまだ存在しない。したがって、白質変性に焦点を当てた前臨床治療薬を研究するためには、安定して確立され、容易に再現可能なモデルが必要である。

脱髄および髄鞘再形成は、多発性硬化症を発症する際の2つの主要な病理学的プロセスである。脱髄は、炎症誘発性表現型7を有するミクログリアによって誘発される軸索周囲のミエリン鞘の喪失であり、神経インパルスの遅い伝導をもたらし、ニューロンおよび神経学的障害の喪失をもたらす。髄鞘再形成は希突起膠細胞によって媒介される内因性修復応答であり、障害は神経変性および認知障害につながる可能性がある8。炎症反応は、ミエリン損傷の程度と修復の両方に影響を及ぼし、プロセス全体にとって重要です。

したがって、持続的な炎症性脱髄の安定した動物モデルは、MSの治療戦略のさらなる探求にとって有意義であるMSの複雑さのために、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)、毒性脱髄モデル、クプリゾン(CPZ)、およびリゾホスファチジルコリン(LPC)を含む、インビボで脱髄病変を模倣する様々なタイプの動物モデルが確立されている9。.LPCは炎症に関連する内因性リゾリン脂質であり、ミエリン脂質に対する毒性を伴う急速な損傷を誘発し、局所脱髄をもたらす可能性がある。以前の報告および研究10,11に基づいて、いくつかの修正を加えた2点注入の詳細なプロトコルが提供される。一般に、古典的な一点LPC注射モデルは、注射部位で局所脱髄のみを生じ、しばしば自発的髄鞘再形成を伴う12,13。しかし、2点注射LPCモデルは、LPCがマウス脳梁において脱髄を直接誘導し、ミエリン再生をほとんど伴わずにより、より耐久性のある脱髄を引き起こすことができることを実証することができる。

プロトコル

すべての動物の処置は、中国華中科技大学同済医科大学の動物ケア研究所委員会によって承認されました。C57BL/6雄雌マウス(野生型、WT;20-25g;8-10週齢)を本研究に使用した。マウスを市販の供給源から入手した( 材料表を参照のこと)。マウスを、水および食物を自由に供給した特定の病原体フリー(SPF)動物施設に収容 した。それらは、22°Cの温度および55%〜60%の相対湿度の標準条件下で、明暗サイクルの交互の12時間周期に保持された。

1. LPC溶液調製

  1. LPC粉末25mg( 材料表参照)をクロロホルム250μLとメタノール混合溶液(1:1)で溶解し、10%LPC溶液を作り、500μLの遠沈管に移した。
    注:LPCが完全に溶解していない場合は、遠沈管を超音波洗浄機に入れ、40kHzで〜1時間超音波処理して均一な溶液を得ます。
  2. 溶液を3 μL/チューブに分割し、-80 °Cで保存します。
    注:ソリューションは〜2年間保存できます。
  3. 手術前に、溶液を27μLの0.9%NaCl溶液で希釈し(ステップ1.2)、溶液を37°Cの恒温水槽に保管する。
    注:注射を開始する直前に溶液を準備してください。

2. 手術準備

  1. 32 G、2 インチの針を使用して、5 μL シリンジに接続します( 材料表を参照)。マイクロリットルシリンジが遮られていないことを確認します。注射剤の調製のために5μLのLPC溶液を回収する。
  2. 3%イソフルランと100%酸素を約0.3 L/minの速度で混合したイソフルラン気化器に接続された誘導チャンバ内でマウスを麻酔する。
  3. 呼吸がスムーズな状態でつま先ピンチ反射の欠如によって麻酔の深さを確認します。
  4. 電気シェーバーを使用して耳の間のマウスの頭を剃ります。手順中に角膜の乾燥を防ぐために潤滑点眼剤を適用します。
  5. 次に、マウスを背側を上にした定位フレーム( 材料表を参照)に置き、鼻錐と歯のクランプで頭を固定します。鼻を通して1.2%-1.6%のイソフルランで麻酔を維持します。
    注:イソフルラン濃度は、マウスの呼吸状態に応じて調整することができる。

3. 外科手術

注:動物は、すべての手順の間、加熱パッドの上に置かれます。

  1. マウスを両側イヤーバー付きの定位装置に固定します。イヤーバーが水平で、頭が水平で安定していることを確認します。
  2. ヨードフォアで数回拭き取り、続いてアルコールを円運動させて頭の皮膚を消毒します。次に、メスを使用して頭皮の正中線に沿って約1.5cmの小さな切開部を切断し、頭蓋骨を露出させます。
  3. ブレグマ、ラムダ、および後部フォンタネルが露出するまで、1%過酸化水素に浸した綿棒で頭蓋骨を拭きます。シリンジを定位装置の上に置きます。
    注:過酸化水素は注意して使用し、周囲の組織に触れないでください。
  4. 動物の頭の水平位置(前後と左右の両方)を確認してください。
    1. 定位フレームのZ軸ノブを調整して、針先と頭蓋骨が曲がらずにちょうど触れるようにしてから、Z軸座標を測定します。ブレグマと後部フォンタネルのZ座標を確認してください。
    2. ブレグマと後部フォンタネルのZ座標の差が0.02mm以下になるようにイヤーバーを調整します。そして、同様の方法に従い、正中線の左右両側における対応する位置のZ座標を測定した。イヤーバーを調整して、左右が同じレベルになるようにします。
  5. 脳梁を見つけます。XYZ の原点をブレグマに設定します。
    注:最初の注射部位は、ブレグマの横方向1.0mm、深さ2.4mm、および前方1.1mmである。第2の注射部位は、ブレグマの側方1.0mm、深さ2.1mm、および前部0.6mmである。たとえば、ブレグマの座標は (0,0,0) です。(-1, 1.1, X) および (-1, 0.6, Y) としてマークされた対応する位置の Z 座標を測定します。脳梁の第1の注射部位座標は(-1, 1.1, -[X+2.4])であり、第2の注射部位は(-1, 0.6, -[Y+2.1])であると求めることができる。
  6. 注射部位が決まったら、頭蓋骨に滅菌マーカーで印を付け、座標を記録します。
  7. 頭蓋骨ドリルでマークされた部位を静かに掘削します( 材料表を参照)。出血を避けるように注意してください。
  8. 針を指定された座標までゆっくりと動かし、注射を開始します。脳梁脱髄を誘導するには、LPC溶液2 μLを各注射部位(ステップ3.5)に0.4 μL/minの速度で注入します。
  9. 注射後、針を各部位にさらに10分間保持する。
    注:2回の注射の間隔が20分を超えないようにしてください。
  10. 4-0縫合糸で皮膚を縫合し、動物が10分以内に目を覚ますのを待ちます。鎮痛薬は、施設の動物ケア規則に従って術後に投与する。
    注:安楽死の推奨時間は、実験の目的に応じて決定することができます。

4. 局所脱髄のためのサンプル抽出

注: この手順の詳細については、以前に発行されたレポート14 を参照してください。

  1. 中性赤色染料( 材料表を参照)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の1%溶液に溶解する。
  2. マウスを犠牲にする数時間前(詳しくは、前の参考文献10を参照のこと)に、各マウスの腹腔内注射によりPBS中の1%中性赤色色素500μLを注射する。
  3. 心臓灌流12 を4°Cで予冷した30mLの0.1% PBSで行う。
  4. 脳型で脳を1mmにスライスします( 材料表を参照)。
  5. ニュートラルレッドに染色された病変部を顕微鏡下で可視化し、病変部を解離させる。
    注:その後の分析の精度を向上させるために、周囲の正常組織をできるだけ取り除きます。病変組織は、RT-PCR、電子顕微鏡、およびウェスタンブロット分析で検査することができます。

5. 組織学的染色と免疫蛍光

  1. 組織学的染色および免疫蛍光12の場合、心臓灌流後(ステップ4.3)、脳10を取り出し、4%PFA中で一晩(4°Cで)固定し、30%スクロース中で完全に脱水した。
  2. 凍結スライサー10を用いて一定温度(−20°C)で20mm 冠状脳切片に切断した。
  3. スライスをルクソールファストブルー(LFB)染色、免疫蛍光、およびウェスタンブロット10に使用します。

結果

LPCの2点注射は、より耐久性のある脱髄をもたらした
LPCは主に、ミエリンに対する毒性および軸索完全性の切断を伴う急速な損傷をもたらす15。注射の日を0日目とした。マウスを10〜28日間(10dpiおよび28dpi)の期間保存した。ルクソールファストブルー(LFB)染色10を用いて、これらの時点におけるマウスにおける脱髄の面積を評価した。2点注射モ...

ディスカッション

中枢神経系の慢性脱髄疾患であるMSは、若年成人20における神経機能障害の最も一般的な原因の1つです。臨床的には、MS患者の約60%〜80%が、二次進行性MSを発症する前に再発および寛解のサイクルを経験し21,22、そしてそれは最終的に時間の経過とともに累積的な運動障害および認知障害をもたらす23。現在、疾患?...

開示事項

著者らには開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学財団(助成金:82071380、81873743)の支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolkSigma-AldrichL4129-25MG
32 gauge NeedleHAMILTON7762-05
10 μl syringeHAMILTON80014
high speed skull drillstrong,koreastrong204
drillHager & Meisinger, Germany REF 500 104 001 001 005
Matrx Animal Aneathesia VentilatorMIDMARKVMR
Portable Stereotaxic Instrument for MouseReward68507
Micro syringeRewardKDS LEGATO 130
Isoflurane VETEASY
ParaformaldehydeServicebioG1101
Phosphate bufferBOSTERPYG0021
LuxoL fast bLueServicebioG1030-100ML
SutureFUSUNPHARMA20152021225
Brain moldReward68707
Electron microscope fixativeServicebioG1102-100ML
Neutral red (C.I. 50040), for microscopy CertistainSigma-Aldrich1.01376
Anti-Myelin Basic Protein Antibody Millipore#AB5864
Anti-GST-P pAbMBL#311
Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15)Thermo Fisher Scientific14-5698-95
Beta Actin Monoclonal AntibodyProteintech66009-1-Ig 
Myelin Basic Protein Polyclonal AntibodyProteintech10458-1-AP
OLIG2 Polyclonal AntibodyProteintech13999-1-AP
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)YEASEN34206ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) YEASEN34412ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) YEASEN34212ES60
HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)abclonalAS014
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) abclonalAS003
Adult C57BL/6 male and female miceHunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd

参考文献

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