脑室微注射脂多糖到斑马鱼幼虫中以评估神经炎症和神经毒性

摘要

该协议展示了在斑马鱼幼虫模型中将脂多糖显微注射到脑室区域，以研究由此产生的神经炎症反应和神经毒性。

摘要

神经炎症是各种神经系统疾病的关键因素，包括神经退行性疾病。因此，研究和开发替代 体内 神经炎症模型以了解神经炎症在神经变性中的作用具有极大的意义。本研究开发并验证了通过心室显微注射脂多糖（LPS）介导的神经炎症幼虫斑马鱼模型，以诱导免疫反应和神经毒性。采用转基因斑马鱼品系elavl3:mCherry、ETvmat2:GFP和mpo:EGFP通过荧光实时成像结合荧光强度分析实时定量脑神经元活力。使用视频跟踪记录器自动记录斑马鱼幼虫的运动行为。研究一氧化氮（NO）含量和白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）和人肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎性细胞因子的mRNA表达水平，以评估斑马鱼幼虫头部LPS诱导的免疫应答。脑室注射LPS后24 h，斑马鱼幼虫出现神经元丧失和运动缺陷。此外，LPS诱导的神经炎症增加了受精后6天斑马鱼幼虫头部NO释放和IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA表达，导致斑马鱼脑中中性粒细胞的募集。在这项研究中，注射浓度为2.5-5mg / mL的斑马鱼，浓度为5dpf，是该药理学神经炎症测定的最佳条件。该协议提供了一种新的，快速有效的LPS脑室显微注射方法，以诱导斑马鱼幼虫中LPS介导的神经炎症和神经毒性，这对于研究神经炎症很有用，也可以用作高通量 体内 药物筛选测定。

引言

神经炎症已被描述为参与中枢神经系统（CNS）几种神经退行性疾病发病机制的关键抗神经源性因素¹。病理损伤后，神经炎症可能导致各种不良后果，包括抑制神经发生和诱导神经元细胞死亡^2，3。在炎症诱导反应的基础过程中，多种炎症细胞因子（如TNF-α，IL-1β和IL-6）分泌到细胞外空间，并作为神经元死亡和抑制神经发生的关键成分4^，5，6。

将炎症介质（如IL-1β、L-精氨酸和内毒素）显微注射到脑中可引起神经元细胞减少和神经炎症⁷，^8，9。脂多糖（LPS，图1）是存在于革兰氏阴性细菌细胞壁中的致病性内毒素，可诱导神经炎症，加剧神经变性，并减少动物的神经发生¹⁰。LPS直接注射到小鼠大脑的CNS中，增加了一氧化氮，促炎细胞因子和其他调节剂的水平¹¹。此外，将LPS立体定向注射到局部脑环境中可诱导神经毒性分子的过量产生，导致神经元功能受损并随后发展为神经退行性疾病¹⁰，12，¹³，^14，15。在神经科学领域，对生物体中细胞和生物过程的实时和时程显微镜观察对于理解发病机制和药理作用至关重要¹⁶。然而，神经炎症和神经毒性小鼠模型的实时成像从根本上受到显微镜有限的光学穿透深度的限制，这排除了功能成像和对发育过程的实时观察¹⁷，^18，19。因此，开发替代神经炎症模型对于促进通过活体成像研究病理发展以及神经炎症和神经变性的潜在机制具有重要意义。

斑马鱼（Danio rerio）由于其进化上保守的先天免疫系统，光学透明度，大胚胎离合器尺寸，遗传可追踪性和体内成像的适用性，已成为研究神经炎症和神经变性的有前途的模型¹⁹，20，²¹，^22，23.以前的方案要么在没有机制评估的情况下直接将LPS注射到斑马鱼幼虫的卵黄和后脑室中，要么简单地将LPS添加到鱼水（培养基）中以诱导致命的全身免疫反应²⁴，²⁵，^26，27。在此，我们开发了一种将LPS显微注射到脑室的方案，以在受精后5天（dpf）斑马鱼幼虫中触发先天免疫反应或神经毒性。这种反应通过神经元细胞丢失，运动行为缺陷，亚硝酸盐氧化物释放增加，炎症基因表达的激活以及注射后24小时斑马鱼大脑中嗜中性粒细胞的募集来证明。

研究方案

AB野生型斑马鱼和转基因斑马鱼系elavl3:mCherry，ETvmat2:GFP和mpo:EGFP来自中国医学研究所（ICMS）。澳门大学动物研究伦理委员会授予动物实验的伦理批准（UMARE-030-2017），该协议遵循机构动物护理指南。

1. 斑马鱼胚胎和幼虫饲养

1. 通过自然配对交配产生斑马鱼胚胎（每次交配 200-300 个胚胎），如之前报道的那样²⁸.
2. 通过将 34.8 克 NaCl、1.6 克 KCl、5.8 克氯化钙₂·2H O 和 9.78 克 MgCl 2·6H 2 O 溶解在 ddH 2 O 中至最终体积2 L 并用 NaOH 和 HCl 将 pH 值调节至_7.2，制备蛋水 （E3） 培养基汤液 （60×）。为了制备工作浓度的E3培养基（1×），将储备液在ddH₂O中稀释60倍，不使用时储存在28.5°C。
3. 使用塑料移液管将斑马鱼胚胎转移到含有E3培养基的培养皿中。在培养箱中将胚胎置于28.5°C，并监测其发育和健康状况。每天取出死胚胎并用新鲜培养基替换不干净的E3培养基。
4. 对于斑马鱼成像实验，使用塑料移液管在大约 15 mL 含有 0.003% N-苯基硫脲 （PTU） 的 1× E3 培养基中收集受精后 0-2 小时 （hpf） 胚胎（约 200 个卵）。
   注意:PTU可以在胚胎发生过程中抑制黑色素细胞的形成²⁹。在胚胎发生过程中用PTU处理胚胎可以改善显微镜下的信号检测或荧光的表达³⁰。
5. 在上述条件下维持斑马鱼胚胎，直到胚胎达到所需的发育幼虫阶段。

2.准备显微注射

1. 通过使用微量移液器拉动玻璃毛细管（参见 材料表）来准备注射，遵循玻璃毛细管拉动的五步方案（表1）。
2. 使用镊子以一定角度将针尖（带灯丝的薄壁玻璃毛细管[3.5英寸]，外径1.14毫米）打开至适当尺寸（图2A）。
3. 用 0.1 mL 矿物油填充针头，以确保没有气泡。
4. 取下显微注射装置钢针的螺帽。将玻璃针孔与钢针对齐，然后拧紧螺帽。将装载的针头显微注射装置安装在显微操纵器中（见 材料表）。
5. 调整显微注射装置的位置，使显微操纵器可以在显微镜下灵活地移动装置。排出一定体积的石蜡油，使钢针进入毛细管玻璃管。
6. 将注射溶液（如1×PBS或5mg / mL LPS）滴在用70%乙醇灭菌的载玻片上，并调整显微注射装置，使尖端插入液滴中。将~2 μL注射液加载到针中。
7. 设置显微操纵器（向上，向下，向左和向右微调设置），使显微注射装置的针尖与高放大倍率的幼虫处于同一视野（图2B）。

3. 安装斑马鱼进行显微注射

注意:斑马鱼的大脑发育发生在 3 dpf 内，并在 5 dpf 成熟，中枢神经系统发达^31，32。因此，5 dpf幼虫已经适合研究LPS介导的神经元损伤以及行为和炎症反应。

1. 在达到感兴趣的阶段后约30分钟内注射斑马鱼幼虫，以保持注射时间的一致性。
2. 为了麻醉斑马鱼幼虫，将三卡因与干净的鱼缸水（终浓度为0.02%w / v三卡因）混合。
3. 使用微波在ddH 2 O中熔化₂%琼脂糖的溶液。将熔融的琼脂糖倒入塑料盘中。2%琼脂糖包衣塑料培养皿可在4°C下储存长达2周。
4. 使用塑料移液管将麻醉的幼虫运送到2%琼脂糖包被的塑料培养皿的中心。将安装的幼虫定向，大脑一侧朝上以便针头进入。

4.注射脑室

1. 调整显微镜的放大倍率，使斑马鱼的脑室结构在视野中清晰显示（图2B）。
2. 小心地将针头放在脑顶盖上方（图2C）。
3. 使用显微操纵器用针尖缓慢刺穿斑马鱼大脑的皮肤。
4. 踩下脚踏板可喷射 1 nL 的 1x PBS 或不同浓度的 LPS（1.0、2.5 和 5.0 mg/mL）（参见 材料表）。以脑室注射1nL 1%埃文斯蓝染料（在PBS中稀释）为例，显示了成功的心室注射图像（图2D）。注射后立即将幼虫转移到清洁的E3培养基中。24小时后，收集幼虫进行显微镜成像，机车行为测定和其他指标的测定。

5. 成像

1. 在E3培养基中制备1.5%低熔点琼脂糖溶液，并在微波炉中加热以形成透明液体。
2. 使用干净的塑料移液管将幼虫运送到载玻片上，并尽可能多地去除水分。
3. 使用塑料移液管向幼虫中加入一滴1.5%低熔点琼脂糖。
   注意:在添加之前，将移液管中的低熔点琼脂糖冷却一段时间，以免伤害幼虫。
4. 使用 1 mL 注射器针头定向幼虫。等到琼脂糖冷却并凝固后再开始成像。
5. 观察和拍摄Tg（ETvmat2:EGFP）和Tg（elavl3:mCherry）斑马鱼整个大脑中的神经元区域，以及在荧光体视显微镜下Tg（mpo:EGFP）斑马鱼大脑中中性粒细胞的募集（见 材料表）。
   注意:用于成像的荧光显微镜设置如下所示。Tg（ETvmat2:EGFP）斑马鱼脑（激发波长:450-490 nm，发射波长:500-550 nm，视觉放大倍率:100x）;Tg（elavl3:mCherry）斑马鱼脑（激发波长:541-551 nm，发射波长:590 nm，视觉放大倍率:100x）;Tg（mpo:EFGP）斑马鱼脑（激发波长:450-490nm，发射波长:500-550nm，视觉放大倍率:63x）。
6. 使用 ImageJ 软件测量和分析 Tg（ETvmat2:EGFP） 斑马鱼中 Ra 神经元区域的荧光强度和长度以及 Tg（elavl3:mCherry） 斑马鱼脑神经元的荧光强度。手动计数Tg（mpo:EFGP）斑马鱼大脑区域中的中性粒细胞。

6. 基因表达标志物的测定

1. 在LPS脑室注射后24小时，继续测定基因表达标志物。为此，用0.02%的三卡因麻醉斑马鱼幼虫（如步骤3.2中所述）。
2. 使用两个1 mL注射器分离幼虫的头部部分（每组40只幼虫），没有眼睛和卵黄囊区域（图2E）。
3. 从幼虫头部部分提取RNA。
   1. 对于 RNA 提取，使用组织研磨机（参见材料表）以 11，000 rpm 的转速将头部与 200 μL RNA 提取试剂（参见材料表）匀浆 5 秒。
   2. 使用氯仿-异丙醇方法进行RNA提取。为此，加入40μL氯仿，剧烈摇动试管，并在室温下孵育10分钟。将样品在4°C下以12，000× g 离心15分钟。
   3. 将水相转移到新管（约100μL）中，并加入100μL异丙醇。孵育10分钟，然后在4°C下以12，000× g 离心10分钟。 除去上清液。
   4. 加入 200 μL 75% 乙醇以洗涤 RNA 沉淀。短暂涡旋样品，然后在4°C下以7500× g 离心5分钟。 弃去上清液并再次洗涤RNA沉淀。
   5. 将RNA沉淀风干5-10分钟，然后加入30μL无RNase的水以溶解RNA沉淀。使用微量分光光度计检查RNA的纯度（260nm和280nm处的吸光度比）和完整性（参见 材料表）。
4. 使用带有随机引物的逆转录酶从步骤6.3中提取的RNA合成cDNA（参见 材料表）。
   1. 向无核酸酶管中加入 1 μL 随机引物、1 μL dNTP、1 μg RNA 和蒸馏水（总体积为 12 μL）。将混合物加热至65°C5分钟，然后在冰上快速冷却。
   2. 向试管中加入 1 μL 0.1 M DTT、1 μL RNase 抑制剂、4 μL 5×第一链缓冲液和 1 μL M-MLV 逆转录酶（总体积:20 μL）。轻轻混合并将管在25°C孵育2分钟，然后在42°C孵育50分钟。通过在70°C下加热15分钟来灭活反应。
5. 使用市售的RT-qPCR试剂盒（见材料表）在qPCR系统上进行实时PCR检测，以确定靶基因（IL-1β、IL-6和TNF-α）的表达。反应混合物 （20 μL） 含有 10 μL SYBR 绿、0.4 μL ROX 参比染料、正向和反向引物各 0.8 μL、6 μL ddH 2 O 和₂μL 模板 cDNA （1 μg）。在以下条件下进行PCR扩增:95°C30秒，然后40个循环，95°C持续5秒，60°C34秒，解离阶段95°C15秒，60°C60秒，95°C解离15秒。
6. 将靶基因的mRNA水平标准化为管家基因的mRNA水平，伸长因子1 α（Ef1α）。通过2−ΔΔCT方法³³计算每个靶基因的表达水平。每个基因的引物序列描述于 表2中。
7. 为了测定一氧化氮，使用组织研磨机在100μL冷PBS中均质化头部部分（在步骤6.2中获得）。将所得PBS和头部悬浮液在4°C下以12，000× g 离心15分钟。 收集裂解物并使用市售试剂盒进行亚硝酸盐浓度测定³⁴ （参见 材料表）。

7. 斑马鱼机车行为测定

1. 在LPS脑室注射后24小时，将斑马鱼幼虫分别转移到96孔方形微孔板的孔中。向每个孔中加入 300 μL E3 培养基，然后将幼虫孵育 4 小时以适应测试板。
2. 将装载幼虫的微孔板转移到斑马鱼跟踪盒中（见 材料表）。打开光源，然后将幼虫在测试箱中孵育30分钟以适应环境。
3. 使用自动视频跟踪系统监控和记录斑马鱼的行为。为每条斑马鱼记录 12 次会话（每次 5 分钟，共 1 小时）。将总距离（由非活动距离、小距离和大距离组成）定义为每条鱼在 60 分钟跟踪期间移动的距离（以毫米为单位）。

8. 统计分析

1. 使用标准分析软件进行统计分析（参见 材料表）。
2. 使用普通单因子方差分析对两组之间的差异进行统计分析。计算皮尔逊相关系数以评估相关性的强度。P < 0.05在所有分析中均被认为显著。

结果

这里描述的工作流程提供了一种新的、快速的、有效的方法，用于诱导斑马鱼幼虫中LPS介导的神经炎症和神经毒性。在该描述的方案中，使用显微注射器将5 dpf斑马鱼用LPS（图1）注射到脑室中（图2A-C）。使用1%埃文斯蓝色染色剂验证成功注射到脑室部位（图2D）。使用注射器将斑马鱼头与其眼睛和身体分?...

讨论

越来越多的流行病学和实验数据表明，慢性细菌和病毒感染是神经退行性疾病的可能危险因素³⁶.感染触发炎症过程和宿主免疫反应的激活³⁷。即使反应作为一种防御机制，过度激活的炎症也不利于神经发生，炎症环境不允许新生神经元存活³⁸。结果，它会损害宿主神经元的功能和活力。研究表明，炎症在神经变性的病理生理学中起重要作用

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A6361
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond Scientific	3-000-207
Fluorescence stereo microscopes	Leica	M205 FA
GraphPad Prism software	GraphPad Software	Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4	Sigma-Aldrich	L3024
Manual micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904
Mx3005P qPCR system	Agilent Technologies	Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer	Biochrom	80-2140-46
Nitrite concentration assay kit	Beyotime Biotechnology	S0021M
Phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller	World Precision Instruments	PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
Random primers	Takara	3802
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit	Accurate Biology	AG11701
The 3rd Gen Tgrinder	Tiangen	OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm	World Precision Instruments	TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester)	Sigma-Aldrich	A-5040
TRNzol Universal reagent	Tiangen	DP424
Zebrafish tracking box	ViewPoint Behavior Technology