JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол демонстрирует микроинъекцию липополисахарида в желудочковую область мозга в модели личинок рыбок данио для изучения результирующей нейровоспалительной реакции и нейротоксичности.

Аннотация

Нейровоспаление является ключевым игроком в различных неврологических расстройствах, включая нейродегенеративные заболевания. Поэтому большой интерес представляют исследования и разработка альтернативных моделей нейрововоспаления in vivo для понимания роли нейровоспаления в нейродегенерации. В этом исследовании была разработана и подтверждена модель нейровоспаления личиночной рыбки данио, опосредованной желудочковой микроинъекцией липополисахарида (ЛПС) для индуцирования иммунного ответа и нейротоксичности. Трансгенные линии рыбок данио elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP и mpo:EGFP использовались для количественной оценки жизнеспособности нейронов мозга в режиме реального времени с помощью флуоресцентной живой визуализации, интегрированной с анализом интенсивности флуоресценции. Локомоторное поведение личинок рыбок данио было записано автоматически с помощью видеорегистратора. Содержание оксида азота (NO) и уровни экспрессии мРНК воспалительных цитокинов, включая интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-1β (IL-1β) и фактор некроза опухоли человека α (TNF-α), были исследованы для оценки вызванного ЛПС иммунного ответа в голове личинок рыбок данио. Через 24 ч после желудочковой инъекции ЛПС в мозг у личинок рыбок данио наблюдалась потеря нейронов и дефицит локомоции. Кроме того, вызванное ЛПС нейровоспаление увеличивало высвобождение NO и экспрессию мРНК IL-6, IL-1β и TNF-α в голове в течение 6 дней после оплодотворения (dpf) личинок рыбок данио и приводило к набору нейтрофилов в мозг рыбок данио. В этом исследовании инъекция рыбок данио с ЛПС в концентрации 2,5-5 мг/мл при 5 dpf была определена как оптимальное условие для этого фармакологического нейровоспаленного анализа. Этот протокол представляет собой новую, быструю и эффективную методологию микроинъекции ЛПС в желудочек головного мозга для индуцирования ЛПС-опосредованного нейровоспаления и нейротоксичности у личинки рыбок данио, которая полезна для изучения нейровоспаления, а также может быть использована в качестве высокопроизводительного анализа лекарств in vivo .

Введение

Нейровоспаление было описано как важнейший антинейрогенный фактор, участвующий в патогенезе ряда нейродегенеративных заболеваний центральной нервной системы (ЦНС)1. После патологических инсультов нейровоспаление может привести к различным неблагоприятным последствиям, включая ингибирование нейрогенеза и индукцию гибели нейрональных клеток 2,3. В процессе, лежащем в основе реакции на индукцию воспаления, множественные воспалительные цитокины (такие как TNF-α, IL-1β и IL-6) секретируются во внеклеточное пространство и действуют как важнейшие компоненты в гибели нейронов и подавлении нейрогенеза 4,5,6.

Микроинъекция медиаторов воспаления (таких как IL-1β, L-аргинин и эндотоксины) в мозг может вызвать сокращение нейрональных клеток и нейровоспаление 7,8,9. Липополисахарид (ЛПС, рисунок 1), патогенный эндотоксин, присутствующий в клеточной стенке грамотрицательных бактерий, может вызывать нейровоспаление, усугублять нейродегенерацию и уменьшать нейрогенез у животных10. Инъекция ЛПС непосредственно в ЦНС мозга мыши повышала уровень оксида азота, провоспалительных цитокинов и других регуляторов11. Кроме того, стереотаксическая инъекция ЛПС в локальную среду мозга может индуцировать чрезмерную выработку нейротоксических молекул, что приводит к нарушению функции нейронов и последующему развитию нейродегенеративных заболеваний 10,12,13,14,15. В области неврологии микроскопические наблюдения за клеточными и биологическими процессами в живых организмах имеют решающее значение для понимания механизмов, лежащих в основе патогенеза и фармакологического действия16. Однако живая визуализация мышиных моделей нейровоспаления и нейротоксичности принципиально ограничена ограниченной глубиной оптического проникновения микроскопии, что исключает функциональную визуализацию и живое наблюдение за процессами развития 17,18,19. Поэтому разработка альтернативных моделей нейровоспаления представляет большой интерес для облегчения изучения патологического развития и механизма, лежащего в основе нейровоспаления и нейродегенерации, с помощью живой визуализации.

Рыбка данио (Danio rerio) стала многообещающей моделью для изучения нейровоспаления и нейродегенерации благодаря своей эволюционно сохраненной врожденной иммунной системе, оптической прозрачности, большому размеру кладки эмбрионов, генетической управляемости и пригодности для визуализации in vivo 19,20,21,22,23 . Предыдущие протоколы либо непосредственно вводили ЛПС в желток и желудочек заднего мозга личинок рыбок данио без механистической оценки, либо просто добавляли ЛПС в рыбью воду (культуральную среду), чтобы вызвать смертельный системный иммунный ответ 24,25,26,27. Здесь мы разработали протокол для микроинъекции ЛПС в желудочки мозга, чтобы вызвать врожденный иммунный ответ или нейротоксичность в течение 5 дней после оплодотворения (dpf) личинок рыбок данио. Эта реакция подтверждается потерей нейрональных клеток, дефицитом локомоторного поведения, повышенным высвобождением оксида нитритов, активацией экспрессии воспалительных генов и набором нейтрофилов в мозг рыбок данио через 24 ч после инъекции.

протокол

Ab диких рыбок данио и трансгенных линий рыбок данио elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP и mpo: EGFP были получены из Института китайских медицинских наук (ICMS). Этическое одобрение (UMARE-030-2017) для экспериментов на животных было предоставлено Комитетом по этике исследований животных Университета Макао, и протокол следует институциональным руководящим принципам ухода за животными.

1. Зародыши рыбок данио и личиночное животноводство

  1. Генерация эмбрионов рыбок данио (200-300 эмбрионов за спаривание) путем естественного парного спаривания, как сообщалось ранее28.
  2. Приготовьте яичную воду (E3) из среднего запаса (60×), растворив 34,8 г NaCl, 1,6 г KCl, 5,8 г CaCl2·2H 2O и 9,78 г MgCl2·6H2Oв ddH2Oдо конечного объема 2 л и отрегулируйте рН до 7,2 с использованием NaOH и HCl. Чтобы получить рабочую концентрацию среды Е3 (1×), разбавьте запас 60 раз в ddH2O. Хранить при 28,5 °C, когда он не используется.
  3. Используйте пластиковую переносную пипетку для переноса эмбрионов рыбок данио в блюдо, содержащее среду E3. Выращивайте эмбрионы при 28,5 °C в инкубаторе и следите за их развитием и здоровьем. Удалите мертвые эмбрионы и замените нечистую среду E3 свежей средой ежедневно.
  4. Для экспериментов по визуализации рыбок данио используйте пластиковую переносную пипетку для сбора эмбрионов 0-2 ч после оплодотворения (hpf) (около 200 яиц) примерно в 15 мл 1× среде E3, содержащей 0,003% N-фенилтемочевины (PTU).
    ПРИМЕЧАНИЕ: ПТУ может ингибировать образование меланофоров во время эмбриогенеза29. Лечение эмбрионов ПТУ во время эмбриогенеза может улучшить обнаружение сигналов в микроскопии или экспрессию флуоресценции30.
  5. Поддерживайте эмбрионы рыбок данио в вышеуказанных условиях до тех пор, пока эмбрионы не достигнут желаемой стадии развития личинок.

2. Подготовка к микроинъекции

  1. Подготовьтесь к инъекции, вытягивая стеклянные капилляры с помощью съемника микропипетки (см. Таблицу материалов), следуя пятиступенчатому протоколу для вытягивания стеклянной капиллярной трубки (таблица 1).
  2. Откройте наконечник иглы (тонкостенные стеклянные капилляры [3,5 дюйма] с нитью накаливания, OD 1,14 мм) до соответствующего размера под углом с помощью щипцов (рисунок 2A).
  3. Наполните иглу 0,1 мл минерального масла, чтобы убедиться, что пузырьков нет.
  4. Снимите винтовой колпачок стальной иглы микроинъекционного аппарата. Совместите отверстие стеклянной иглы со стальной иглой, а затем затяните крышку винта. Установите нагруженный игольчатый микроинъекционный аппарат в микроманипулятор (см. Таблицу материалов).
  5. Отрегулируйте положение микроинъекционного аппарата так, чтобы микроманипулятор мог гибко перемещать аппарат под микроскопом. Выгрузите определенный объем парафинового масла, чтобы стальная игла попала в капиллярную стеклянную трубку.
  6. Опустите раствор для инъекций (например, 1× PBS или 5 мг/мл LPS) на стеклянную горку, стерилизованную 70% этанолом, и отрегулируйте микроинъекционный аппарат так, чтобы наконечник был вставлен в каплю жидкости. Загрузите ~2 мкл инъекционного раствора в иглу.
  7. Настройте микроманипулятор (тонкая регулировка настроек вверх, вниз, влево и вправо) так, чтобы кончик иглы микроинъекционного аппарата находился в том же поле зрения, что и личинки на большом увеличении (рисунок 2B).

3. Крепление рыбок данио для микроинъекций

ПРИМЕЧАНИЕ: Развитие мозга рыбок данио происходит в пределах 3 dpf и созревает при 5 dpf с хорошо развитой центральной нервной системой31,32. Таким образом, личинки 5 dpf уже подходят для изучения Опосредованного ЛПС повреждения нейронов, а также поведенческих и воспалительных реакций.

  1. Введите личинкам рыбок данио в течение примерно 30 минут после достижения стадии интереса, чтобы сохранить постоянство времени инъекции.
  2. Чтобы обезболить личинок рыбок данио, соедините трикаин с чистой водой аквариума (конечная концентрация 0,02% мас./об. трикаина).
  3. Расплавить раствор 2% агарозы в ddH2Oс помощью микроволновой печи. Перелейте расплавленную агарозу в пластиковую посуду. Пластиковая тарелка с 2% покрытием агарозой может храниться при температуре 4 °C до 2 недель.
  4. Используйте пластиковую передаточную пипетку для транспортировки обезболенных личинок к центру пластиковой посуды с 2% покрытием из агарозы. Ориентируйте конных личинок головной стороной вверх для доступа иглы.

4. Инъекция желудочка мозга

  1. Отрегулируйте увеличение микроскопа так, чтобы желудочковая структура мозга рыбок данио четко отображалась в поле зрения (рисунок 2В).
  2. Осторожно поместите иглу над тектумом мозга (рисунок 2C).
  3. Медленно прокалывайте кожу мозга рыбки данио кончиком иглы с помощью микроманипулятора.
  4. Нажмите ножную педаль, чтобы извлечь 1 нл 1x PBS или различные концентрации LPS (1,0, 2,5 и 5,0 мг/мл) (см. Таблицу материалов). В качестве примера показаны успешные инъекционные изображения желудочков, при которых желудочку мозга вводили 1 нл 1% синего красителя Эванса (разбавленного в PBS) (рисунок 2D). Перенесите личинок в чистую среду Е3 сразу после инъекции. Через 24 ч собирают личинок для микроскопической визуализации, анализа поведения локомотивов и определения других показателей.

5. Визуализация

  1. Приготовьте 1,5% низкоплавкий раствор агарозы в среде Е3 и нагрейте его в микроволновой печи с образованием прозрачной жидкости.
  2. Используйте чистую пластиковую передаточную пипетку, чтобы транспортировать личинок на стеклянную горку и удалить как можно больше воды.
  3. Используйте пластиковую переносную пипетку, чтобы добавить каплю 1,5% низкоплавкой агарозы к личинкам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Охладите агарозу с низким расплавом в пипетке на некоторое время перед добавлением, чтобы не травмировать личинок.
  4. Используйте иглу шприца объемом 1 мл для ориентации личинок. Подождите, пока агароза остынет и затвердеет, прежде чем начинать визуализацию.
  5. Наблюдать и фотографировать область нейронов во всем мозге рыбок данио Tg(ETvmat2:EGFP) и Tg(elavl3:mCherry), а также рекрутирование нейтрофилов в мозге рыбок данио Tg(mpo:EGFP) под флуоресцентным стереомикроскопом (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки флуоресцентного микроскопа, используемые для визуализации, показаны ниже. Tg(ETvmat2:EGFP) мозг рыбки данио (длина волны возбуждения: 450-490 нм, длина волны излучения: 500-550 нм, визуальное увеличение: 100x); Tg(elavl3:mCherry) мозг рыбки данио (длина волны возбуждения: 541-551 нм, длина волны излучения: 590 нм, визуальное увеличение: 100x); Tg(mpo:EFGP) мозг рыбки данио (длина волны возбуждения: 450-490 нм, длина волны излучения: 500-550 нм, визуальное увеличение: 63x).
  6. Измерьте и проанализируйте интенсивность флуоресценции и длину области нейрона Ra у рыбок данио Tg(ETvmat2: EGFP) и интенсивность флуоресценции нейронов мозга рыбок данио Tg (elavl3: mCherry) с помощью программного обеспечения ImageJ. Вручную подсчитайте нейтрофилы в области мозга рыбок данио Tg(mpo:EFGP).

6. Определение маркеров экспрессии генов

  1. Через 24 ч после ЛПС желудочковой инъекции в мозг приступают к определению маркеров экспрессии генов. Для этого обезболивайте личинок рыбок данио 0,02% трикаина (как упоминалось на этапе 3.2).
  2. Используйте два шприца по 1 мл, чтобы отделить головные части личинок (40 личинок на группу) без областей глаз и желточного мешка (рисунок 2Е).
  3. Извлеките РНК из частей головки личинки.
    1. Для экстракции РНК гомогенизируйте головную часть 200 мкл реагента экстракции РНК (см. Таблицу материалов) с помощью измельчителя тканей (см. Таблицу материалов) со скоростью вращения 11 000 об/мин в течение 5 с.
    2. Выполняют экстракцию РНК методом хлороформ-изопропанол. Для этого добавляют 40 мкл хлороформа, энергично встряхивают пробирки и инкубируют их при комнатной температуре в течение 10 мин. Центрифугируйте образцы при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C.
    3. Переместите водную фазу в свежую трубку (около 100 мкл) и добавьте 100 мкл изопропанола. Инкубировать в течение 10 мин, а затем центрифугу при 12 000 х г в течение 10 мин при 4 °C. Удалите супернатант.
    4. Добавьте 200 мкл 75% этанола для промывки гранулы РНК. Вращайте образцы ненадолго, а затем центрифугируйте при 7500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант и снова промыте гранулу РНК.
    5. Высушите гранулу РНК на воздухе в течение 5-10 мин, затем добавьте 30 мкл рваазной воды для растворения гранулы РНК. Проверить чистоту (соотношение поглощения при 260 нм и 280 нм) и целостность РНК проверяют с помощью микрообъемного спектрофотометра (см. Таблицу материалов).
  4. Синтезируют кДНК из РНК, извлеченной на стадии 6.3, используя обратную транскриптазу со случайными праймерами (см. Таблицу материалов).
    1. Добавьте 1 мкл случайных праймеров, 1 мкл дНТП, 1 мкг РНК и дистиллированную воду (общий объем до 12 мкл) в трубку без нуклеазы. Разогрейте смесь до 65 °C в течение 5 мин и быстро охладите на льду.
    2. Добавьте в пробирку 1 мкл 0,1 М ДТТ, 1 мкл ингибитора РНКАЗЫ, 4 мкл 5× буфера первой цепи и 1 мкл обратной транскриптазы M-MLV (общий объем: 20 мкл). Осторожно перемешать и инкубировать пробирку при 25 °C в течение 2 мин, затем 42 °C в течение 50 мин. Инактивируют реакцию нагреванием при 70 °C в течение 15 мин.
  5. Выполняйте ПЦР в режиме реального времени в системе qPCR (см. Таблицу материалов) с использованием коммерчески доступного набора RT-qPCR (см. Таблицу материалов) для определения экспрессии генов-мишеней (IL-1β, IL-6 и TNF-α). Реакционная смесь (20 мкл) содержала 10 мкл зеленого SYBR, 0,4 мкл эталонного красителя ROX, 0,8 мкл каждого из прямой и обратной праймеров, 6 мкл ddH2O и 2 мкл шаблонной кДНК (1 мкг). Проводят ПЦР-амплификацию в условиях: 95 °С в течение 30 с, затем 40 циклов, 95 °С в течение 5 с и 60 °С в течение 34 с, и со стадией диссоциации 95 °С в течение 15 с, 60 °С в течение 60 с и 95 °С в течение 15 с.
  6. Нормализуйте уровни мРНК генов-мишеней до уровня гена домашнего хозяйства, фактор удлинения 1 α (Ef1α). Рассчитайте уровни экспрессии для каждого гена-мишени методом 2−ΔΔCT33. Праймерные последовательности каждого гена описаны в таблице 2.
  7. Для определения оксида азота гомогенизируют головную часть (полученную на стадии 6.2) в 100 мкл холодного ПБС с помощью тканевой шлифовальной машины. Центрифуга полученной PBS и суспензии головной части при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Соберите лизаты и выполните анализ концентрации нитритов34 с использованием коммерчески доступного набора (см. Таблицу материалов).

7. Поведенческий анализ локомотива рыбок данио

  1. Через 24 ч после инъекции ЛПС желудочков в мозг переносят личинок рыбок данио в колодцы 96-луночной квадратной микропластины по отдельности. Добавьте 300 мкл среды E3 в каждую лунку, а затем инкубируйте личинки в течение 4 часов для акклиматизации к испытательной пластине.
  2. Перенесите загруженную личинками микропластинку в ящик для отслеживания рыбок данио (см. Таблицу материалов). Включите источник света, а затем высиживайте личинок в испытательной коробке в течение 30 минут, чтобы акклиматизировать окружающую среду.
  3. Отслеживайте и записывайте поведение рыбок данио с помощью автоматизированной системы видеослежения. Запишите 12 сеансов (по 5 мин каждый, всего 1 ч) для каждой рыбки данио. Определите общее расстояние (состоит из неактивных, малых и больших расстояний) как расстояние (в мм), которое каждая рыба преодолела в течение 60-минутного периода отслеживания.

8. Статистический анализ

  1. Выполняйте статистический анализ с помощью стандартного аналитического программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
  2. Выполнить статистический анализ различий между двумя группами с помощью обычной односторонней ANOVA. Рассчитайте коэффициент корреляции Пирсона, чтобы оценить силу корреляций. P < 0,05 было признано значимым во всех анализах.

Результаты

Описанный здесь рабочий процесс представляет собой новую, быструю и эффективную методологию индуцирования ЛПС-опосредованного нейровоспаления и нейротоксичности у личинок рыбок данио. В этом описанном протоколе 5 dpf рыбок данио вводили с ЛПС (рисунок 1) в желудочки моз?...

Обсуждение

Все больше эпидемиологических и экспериментальных данных указывают на хронические бактериальные и вирусные инфекции в качестве возможных факторов риска нейродегенеративных заболеваний36. Инфекция запускает активацию воспалительных процессов и иммунных реакций хозяин?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами Фонда развития науки и техники (FDCT) САР Макао (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 и 0016/2019/AKP), Исследовательский комитет Университета Макао (MYRG2020-00183-ICMS и CPG2022-00023-ICMS) и Национальный фонд естественных наук Китая (No 81803398).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA6361
Agarose, low gelling temperatureSigma-AldrichA9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter InjectorDrummond Scientific3-000-207
Fluorescence stereo microscopesLeicaM205 FA
GraphPad Prism softwareGraphPad SoftwareVer. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4Sigma-AldrichL3024
Manual micromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301
Mineral oilSigma-AldrichM5904
Mx3005P qPCR systemAgilent TechnologiesMx3005P
Nanovue plus spectrophotometerBiochrom80-2140-46
Nitrite concentration assay kitBeyotime BiotechnologyS0021M
Phosphate-buffered salineSigma-AldrichP4417
Programmable Horizontal Pipette PullerWorld Precision InstrumentsPMP-102
PTU (N-Phenylthiourea)Sigma-AldrichP7629
Random primersTakara3802
SuperScript II Reverse TranscriptaseInvitrogen18064014
SYBR Premix Ex Taq II kitAccurate BiologyAG11701
The 3rd Gen TgrinderTiangenOSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mmWorld Precision InstrumentsTW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester)Sigma-AldrichA-5040
TRNzol Universal reagentTiangenDP424
Zebrafish tracking boxViewPoint Behavior Technology

Ссылки

  1. Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
  2. Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
  3. Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42 (2020).
  4. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
  5. Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
  6. Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
  7. Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
  8. Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178 (2014).
  9. Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790 (2019).
  10. Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson's disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060 (2020).
  11. Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
  12. Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
  13. Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
  14. Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
  15. Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson's disease. Parkinson's Disease. 2011, 327089 (2011).
  16. Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
  17. Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002 (2021).
  18. Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002 (2019).
  19. Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer's disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45 (2018).
  20. Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303 (2012).
  21. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
  22. Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371 (2021).
  23. Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568 (2022).
  24. Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
  25. Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978 (2021).
  26. Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
  27. Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9'-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
  28. He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
  29. Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
  30. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
  31. d'Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976 (2018).
  32. Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
  33. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  34. Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325 (2020).
  35. Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
  36. De Chiara, G., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 46 (3), 614-638 (2012).
  37. Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
  38. Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
  39. Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
  40. Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4 (2018).
  41. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
  42. Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
  43. Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O. Inflammatory diseases modelling in zebrafish. World Journal of Experimental Medicine. 6 (1), 9-20 (2016).
  44. Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
  45. Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
  46. Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J. Techniques for brain imaging in vivo. Neuromolecular Medicine. 6 (1), 65-78 (2004).
  47. Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer's disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer's Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
  48. Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17 (2019).
  49. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
  50. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063 (2014).
  51. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
  52. Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
  53. Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862 (2007).
  54. Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены