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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole démontre la micro-injection de lipopolysaccharide dans la région ventriculaire du cerveau dans un modèle larvaire de poisson zèbre pour étudier la réponse neuroinflammatoire et la neurotoxicité qui en résultent.

Résumé

La neuroinflammation est un acteur clé dans divers troubles neurologiques, y compris les maladies neurodégénératives. Par conséquent, il est d’un grand intérêt de rechercher et de développer des modèles alternatifs de neuroinflammation in vivo pour comprendre le rôle de la neuroinflammation dans la neurodégénérescence. Dans cette étude, un modèle larvaire de poisson zèbre de neuroinflammation médiée par microinjection ventriculaire de lipopolysaccharide (LPS) pour induire une réponse immunitaire et une neurotoxicité a été développé et validé. Les lignées de poisson-zèbre transgénique elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP et mpo:EGFP ont été utilisées pour la quantification en temps réel de la viabilité des neurones cérébraux par imagerie en direct par fluorescence intégrée à l’analyse de l’intensité de fluorescence. Le comportement locomoteur des larves de poisson-zèbre a été enregistré automatiquement à l’aide d’un enregistreur de suivi vidéo. La teneur en oxyde nitrique (NO) et les niveaux d’expression de l’ARNm des cytokines inflammatoires, y compris l’interleukine-6 (IL-6), l’interleukine-1β (IL-1β) et le facteur de nécrose tumorale humaine α (TNF-α) ont été étudiés pour évaluer la réponse immunitaire induite par le LPS dans la tête larvaire du poisson zèbre. 24 h après l’injection ventriculaire cérébrale de LPS, une perte de neurones et un déficit de locomotion ont été observés chez les larves de poisson zèbre. De plus, la neuroinflammation induite par le LPS a augmenté la libération de NO et l’expression de l’ARNm de l’IL-6, de l’IL-1β et du TNF-α dans la tête des larves de poisson-zèbre 6 jours après la fécondation (dpf), et a entraîné le recrutement de neutrophiles dans le cerveau du poisson zèbre. Dans cette étude, l’injection de LPS chez le poisson zèbre à une concentration de 2,5 à 5 mg/mL à 5 dpf a été déterminée comme la condition optimale pour ce test pharmacologique de neuroinflammation. Ce protocole présente une nouvelle méthodologie rapide et efficace pour la microinjection de LPS dans le ventricule cérébral afin d’induire une neuroinflammation et une neurotoxicité médiées par le LPS chez une larve de poisson zèbre, ce qui est utile pour étudier la neuroinflammation et pourrait également être utilisé comme test de dépistage de médicaments in vivo à haut débit.

Introduction

La neuroinflammation a été décrite comme un facteur antineurogène crucial impliqué dans la pathogenèse de plusieurs maladies neurodégénératives du système nerveux central (SNC)1. Suite à des agressions pathologiques, la neuroinflammation peut entraîner diverses conséquences néfastes, notamment l’inhibition de la neurogenèse et l’induction de la mort cellulaire neuronale 2,3. Dans le processus sous-jacent à la réponse à l’induction de l’inflammation, de multiples cytokines inflammatoires (telles que le TNF-α, l’IL-1β et l’IL-6) sont sécrétées dans l’espace extracellulaire et agissent comme des composants cruciaux dans la mort des neurones et la suppression de la neurogenèse 4,5,6.

La micro-injection de médiateurs de l’inflammation (tels que l’IL-1β, la L-arginine et les endotoxines) dans le cerveau peut provoquer une réduction des cellules neuronales et une neuroinflammation 7,8,9. Le lipopolysaccharide (LPS, Figure 1), une endotoxine pathogène présente dans la paroi cellulaire des bactéries à Gram négatif, peut induire une neuroinflammation, exacerber la neurodégénérescence et réduire la neurogenèse chez les animaux10. L’injection de LPS directement dans le SNC du cerveau de la souris a augmenté les niveaux d’oxyde nitrique, de cytokines pro-inflammatoires et d’autres régulateurs11. De plus, l’injection stéréotaxique de LPS dans l’environnement cérébral local peut induire une production excessive de molécules neurotoxiques, entraînant une altération de la fonction neuronale et le développement ultérieur de maladies neurodégénératives 10,12,13,14,15. Dans le domaine des neurosciences, les observations microscopiques en direct et dans le temps des processus cellulaires et biologiques dans les organismes vivants sont cruciales pour comprendre les mécanismes sous-jacents à la pathogenèse et à l’action pharmacologique16. Cependant, l’imagerie en direct de modèles murins de neuroinflammation et de neurotoxicité est fondamentalement limitée par la profondeur de pénétration optique limitée de la microscopie, qui empêche l’imagerie fonctionnelle et l’observation en direct des processus de développement17,18,19. Par conséquent, le développement de modèles alternatifs de neuroinflammation est d’un grand intérêt pour faciliter l’étude du développement pathologique et du mécanisme sous-jacent à la neuroinflammation et à la neurodégénérescence par imagerie en direct.

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est apparu comme un modèle prometteur pour étudier la neuroinflammation et la neurodégénérescence en raison de son système immunitaire inné conservé au cours de l’évolution, de sa transparence optique, de sa grande taille d’embrayage embryonnaire, de sa traçabilité génétique et de son aptitude à l’imagerie in vivo 19,20,21,22,23 . Les protocoles précédents ont soit injecté directement du LPS dans le ventricule vitellin et cerveau postérieur des larves de poissons-zèbres sans évaluation mécaniste, soit simplement ajouté du LPS à l’eau de poisson (milieu de culture) pour induire une réponse immunitaire systémique mortelle24,25,26,27. Ici, nous avons développé un protocole de micro-injection de LPS dans les ventricules cérébraux, pour déclencher une réponse immunitaire innée ou une neurotoxicité chez les larves de poisson-zèbre 5 jours après la fécondation (dpf). Cette réponse est mise en évidence par la perte de cellules neuronales, le déficit du comportement locomoteur, l’augmentation de la libération d’oxyde de nitrite, l’activation de l’expression génique inflammatoire et le recrutement de neutrophiles dans le cerveau du poisson zèbre 24 h après l’injection.

Protocole

Les lignées de poissons-zèbres de type sauvage AB et de poissons-zèbres transgéniques elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP et mpo:EGFP ont été obtenues auprès de l’Institut des sciences médicales chinoises (ICMS). L’approbation éthique (UMARE-030-2017) pour les expériences sur les animaux a été accordée par le Comité d’éthique de la recherche animale de l’Université de Macao, et le protocole suit les directives institutionnelles en matière de soins aux animaux.

1. Élevage d’embryons et de larves de poisson zèbre

  1. Générer des embryons de poisson-zèbre (200-300 embryons par accouplement) par accouplement naturel par paires, comme indiqué précédemment28.
  2. Préparer l’eau d’œuf (E3) de moyenne souche (60×) en dissolvant 34,8 g de NaCl, 1,6 g de KCl, 5,8 g de CaCl 2·2H2O et 9,78 g de MgCl 2·6H2Odans ddH 2O jusqu’à unvolume final de 2 L et ajuster le pH à 7,2 en utilisant NaOH et HCl. Pour préparer la concentration utile du milieu E3 (1×), diluer le stock 60 fois dans ddH2O. Conserver à 28,5 °C lorsqu’il n’est pas utilisé.
  3. Utilisez une pipette de transfert en plastique pour transférer les embryons de poisson zèbre dans une boîte contenant un milieu E3. Élever les embryons à 28,5 °C dans un incubateur et surveiller leur développement et leur santé. Retirez quotidiennement les embryons morts et remplacez quotidiennement le milieu E3 impur par un milieu frais.
  4. Pour les expériences d’imagerie du poisson zèbre, utiliser une pipette de transfert en plastique pour recueillir des embryons post-fécondation (HPF) de 0 à 2 heures (environ 200 œufs) dans environ 15 ml de milieu E3 1× contenant 0,003% de N-phénylthiourée (PTU).
    NOTE: PTU peut inhiber la formation de mélanophores au cours de l’embryogenèse29. Le traitement des embryons avec PTU pendant l’embryogenèse peut améliorer la détection du signal en microscopie ou l’expression de la fluorescence30.
  5. Maintenir les embryons de poisson-zèbre dans les conditions ci-dessus jusqu’à ce que les embryons atteignent le stade larvaire de développement souhaité.

2. Préparation à la micro-injection

  1. Préparez-vous à l’injection en tirant les capillaires en verre à l’aide d’un extracteur de micropipettes (voir le tableau des matériaux), en suivant le protocole en cinq étapes pour l’extraction du tube capillaire en verre (tableau 1).
  2. Ouvrir la pointe de l’aiguille (capillaires de verre à paroi mince [3,5 po] avec filament, OD 1,14 mm) à la taille appropriée à un angle à l’aide d’une pince (figure 2A).
  3. Remplissez l’aiguille avec 0,1 mL d’huile minérale pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles.
  4. Retirez le bouchon à vis de l’aiguille en acier de l’appareil de micro-injection. Alignez le trou de l’aiguille en verre avec l’aiguille en acier, puis serrez le bouchon à vis. Montez l’appareil de microinjection à aiguille chargée dans un micromanipulateur (voir le tableau des matériaux).
  5. Ajustez la position de l’appareil de micro-injection afin que le micromanipulateur puisse déplacer l’appareil de manière flexible sous le microscope. Déchargez un certain volume d’huile de paraffine pour faire entrer l’aiguille en acier dans le tube de verre capillaire.
  6. Déposez la solution d’injection (telle que 1× PBS ou 5 mg/mL de LPS) sur une lame de verre stérilisée à l’éthanol à 70 % et ajustez l’appareil de micro-injection de manière à ce que l’embout soit inséré dans la goutte liquide. Charger ~2 μL de solution injectable dans l’aiguille.
  7. Réglez le micromanipulateur (réglages fins de haut, bas, gauche et droite) de sorte que l’extrémité de l’aiguille de l’appareil de microinjection soit dans le même champ de vision que les larves à fort grossissement (figure 2B).

3. Montage du poisson-zèbre pour les micro-injections

REMARQUE: Le développement du cerveau du poisson zèbre se produit dans les 3 dpf et mûrit à 5 dpf avec un système nerveux central bien développé31,32. Par conséquent, 5 larves de dpf conviennent déjà à l’étude des dommages neuronaux médiés par le LPS ainsi que des réponses comportementales et inflammatoires.

  1. Injecter les larves de poisson-zèbre dans les 30 minutes suivant environ le stade d’intérêt, afin de maintenir la cohérence du moment de l’injection.
  2. Pour anesthésier les larves de poisson zèbre, combiner la tricaïne avec de l’eau propre de l’aquarium (concentration finale de 0,02% p/v de tricaïne).
  3. Faire fondre une solution d’agarose à 2% dans duddH2Oau micro-ondes. Versez l’agarose fondue dans un plat en plastique. Le plat en plastique recouvert d’agarose à 2 % peut être conservé à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
  4. Utilisez une pipette de transfert en plastique pour transporter les larves anesthésiées au centre de la capsule en plastique recouverte d’agarose à 2 %. Orientez les larves montées avec le côté cerveau vers le haut pour l’accès à l’aiguille.

4. Injection du ventricule cérébral

  1. Ajustez le grossissement du microscope de manière à ce que la structure ventriculaire cérébrale du poisson zèbre soit clairement affichée dans le champ de vision (Figure 2B).
  2. Placez soigneusement l’aiguille au-dessus du tectum cérébral (figure 2C).
  3. Percez lentement la peau du cerveau du poisson zèbre avec la pointe de l’aiguille à l’aide du micromanipulateur.
  4. Appuyez sur la pédale pour éjecter 1 nL de 1x PBS ou différentes concentrations de LPS (1,0, 2,5 et 5,0 mg/mL) (voir le tableau des matériaux). Des images réussies d’injection ventriculaire auxquelles le ventricule cérébral a été injecté avec 1 nL de colorant bleu Evans à 1% (dilué dans du PBS) sont présentées à titre d’exemple (Figure 2D). Transférer les larves dans le milieu E3 propre immédiatement après l’injection. Après 24 h, prélever les larves pour l’imagerie microscopique, l’essai comportemental de la locomotive et la détermination d’autres indicateurs.

5. Imagerie

  1. Préparer une solution d’agarose à faible point de fusion à 1,5 % dans un milieu E3 et la chauffer au micro-ondes pour former un liquide clair.
  2. Utilisez une pipette de transfert en plastique propre pour transporter les larves vers une lame de verre et éliminer autant d’eau que possible.
  3. Utilisez une pipette de transfert en plastique pour ajouter une goutte d’agarose à bas point de fusion à 1,5 % aux larves.
    NOTE: Refroidir l’agarose à bas point de fusion dans la pipette pendant un certain temps avant de l’ajouter afin de ne pas blesser les larves.
  4. Utilisez une aiguille de seringue de 1 mL pour orienter les larves. Attendez que l’agarose refroidisse et se solidifie avant de commencer l’imagerie.
  5. Observez et photographiez la région neuronale dans tout le cerveau du poisson-zèbre Tg(ETvmat2:EGFP) et Tg(elavl3:mCherry), ainsi que le recrutement des neutrophiles dans le cerveau du poisson-zèbre Tg(mpo:EGFP) au microscope stéréoscopique à fluorescence (voir Tableau des matériaux).
    REMARQUE: Les paramètres du microscope à fluorescence utilisés pour l’imagerie sont indiqués ci-dessous. Tg(ETvmat2:EGFP) cerveau de poisson zèbre (longueur d’onde d’excitation: 450-490 nm, longueur d’onde d’émission: 500-550 nm, grossissement visuel: 100x); Tg(elavl3:mCherry) cerveau de poisson zèbre (longueur d’onde d’excitation: 541-551 nm, longueur d’onde d’émission: 590 nm, grossissement visuel: 100x); Tg (mpo: EFGP) cerveau de poisson zèbre (longueur d’onde d’excitation: 450-490 nm, longueur d’onde d’émission: 500-550 nm, grossissement visuel: 63x).
  6. Mesurez et analysez l’intensité de fluorescence et la longueur de la région du neurone Ra dans le poisson zèbre Tg(ETvmat2:EGFP) et l’intensité de fluorescence des neurones cérébraux du poisson zèbre Tg(elavl3:mCherry) à l’aide du logiciel ImageJ. Comptez manuellement les neutrophiles dans la région du cerveau du poisson zèbre Tg(mpo:EFGP).

6. Détermination des marqueurs d’expression génique

  1. 24 h après l’injection ventriculaire cérébrale LPS, procéder à la détermination des marqueurs d’expression génique. Pour ce faire, anesthésiez les larves de poisson zèbre avec 0,02% de tricaïne (comme mentionné à l’étape 3.2).
  2. Utilisez deux seringues de 1 mL pour séparer les parties de la tête des larves (40 larves par groupe) sans les régions de l’œil et du sac vitellin (figure 2E).
  3. Extraire l’ARN des parties de la tête larvaire.
    1. Pour l’extraction de l’ARN, homogénéiser la partie de la tête avec 200 μL de réactif d’extraction d’ARN (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un broyeur de tissus (voir le tableau des matériaux) à une vitesse de rotation de 11 000 tr/min pendant 5 s.
    2. Effectuer l’extraction de l’ARN en utilisant la méthode chloroforme-isopropanol. Pour ce faire, ajoutez 40 μL de chloroforme, agitez vigoureusement les tubes et incuberez-les à température ambiante pendant 10 min. Centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
    3. Transférer la phase aqueuse dans un tube frais (environ 100 μL) et ajouter 100 μL d’isopropanol. Incuber pendant 10 min puis centrifuger à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Retirez le surnageant.
    4. Ajouter 200 μL d’éthanol à 75 % pour laver la pastille d’ARN. Tourbillonner brièvement les échantillons puis centrifuger à 7500 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et laver à nouveau la pastille d’ARN.
    5. Sécher à l’air la pastille d’ARN pendant 5-10 min, puis ajouter 30 μL d’eau sans RNase pour dissoudre la pastille d’ARN. Vérifier la pureté (rapport d’absorbance à 260 nm et 280 nm) et l’intégrité de l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume (voir le tableau des matériaux).
  4. Synthétiser l’ADNc de l’ARN extrait à l’étape 6.3, en utilisant la transcriptase inverse avec des amorces aléatoires (voir le tableau des matériaux).
    1. Ajouter 1 μL d’amorces aléatoires, 1 μL de dNTP, 1 μg d’ARN et de l’eau distillée (volume total à 12 μL) dans un tube sans nucléase. Chauffer le mélange à 65 °C pendant 5 min et refroidir rapidement sur de la glace.
    2. Ajouter 1 μL de DTT 0,1 M, 1 μL d’inhibiteur de la RNase, 4 μL de tampon premier brin 5× et 1 μL de transcriptase inverse M-MLV (volume total : 20 μL) dans le tube. Mélanger délicatement et incuber le tube à 25 °C pendant 2 min, puis à 42 °C pendant 50 min. Désactiver la réaction en chauffant à 70 °C pendant 15 min.
  5. Effectuer une PCR en temps réel sur un système qPCR (voir Tableau des matériaux) à l’aide d’un kit RT-qPCR disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux) pour déterminer l’expression des gènes cibles (IL-1β, IL-6 et TNF-α). Le mélange réactionnel (20 μL) contenait 10 μL de vert SYBR, 0,4 μL de colorant de référence ROX, 0,8 μL chacun des amorces avant et arrière, 6 μL deddH2Oet 2 μL d’ADNc matriciel (1 μg). Effectuer une amplification par PCR dans les conditions suivantes : 95 °C pendant 30 s, suivie de 40 cycles de 95 °C pendant 5 s et de 60 °C pendant 34 s, et avec un étage de dissociation de 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 60 s et 95 °C pendant 15 s.
  6. Normaliser les niveaux d’ARNm des gènes cibles à ceux d’un gène d’entretien, facteur d’élongation 1 α (Ef1α). Calculer les niveaux d’expression pour chaque gène cible par la méthode 2−ΔΔCT33. Les séquences d’amorce de chaque gène sont décrites dans le tableau 2.
  7. Pour la détermination de l’oxyde nitrique, homogénéiser la partie de la tête (obtenue à l’étape 6.2) dans 100 μL de PBS froid à l’aide d’un broyeur de tissus. Centrifuger le PBS résultant et la suspension de la partie de la tête à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Prélever les lysats et effectuer l’essai de concentration en nitrite34 à l’aide d’une trousse disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).

7. Essai comportemental de la locomotive du poisson zèbre

  1. 24 h après l’injection ventriculaire cérébrale LPS, transférer individuellement les larves de poisson-zèbre dans les puits d’une microplaque carrée de 96 puits. Ajouter 300 μL de milieu E3 à chaque puits, puis incuber les larves pendant 4 h pour les acclimater à la plaque d’essai.
  2. Transférer la microplaque chargée de larves dans le boîtier de suivi du poisson zèbre (voir le tableau des matériaux). Allumez la source lumineuse, puis incuber les larves dans la boîte d’essai pendant 30 minutes pour acclimater l’environnement.
  3. Surveillez et enregistrez le comportement du poisson zèbre à l’aide d’un système de suivi vidéo automatisé. Enregistrer 12 séances (5 min chacune, total 1 h) pour chaque poisson zèbre. Définissez la distance totale (composée de distances inactives, petites et grandes) comme la distance (en mm) que chaque poisson a parcourue au cours d’une période de suivi de 60 minutes.

8. Analyse statistique

  1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide d’un logiciel d’analyse standard (voir le tableau des matières).
  2. Effectuer une analyse statistique des différences entre deux groupes à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle ordinaire. Calculez le coefficient de corrélation de Pearson pour évaluer la force des corrélations. P < 0,05 a été jugé significatif dans toutes les analyses.

Résultats

Le flux de travail décrit ici présente une nouvelle méthodologie rapide et efficace pour induire une neuroinflammation et une neurotoxicité médiées par le LPS chez les larves de poisson zèbre. Dans ce protocole décrit, 5 poissons-zèbres dpf ont été injectés avec du LPS (Figure 1) dans les ventricules cérébraux à l’aide d’un micro-injecteur (Figure 2A-C). La réussite de l’injection dans le site ventricule c?...

Discussion

Un nombre croissant de données épidémiologiques et expérimentales impliquent des infections bactériennes et virales chroniques comme facteurs de risque possibles de maladies neurodégénératives36. L’infection déclenche l’activation des processus inflammatoires et des réponses immunitaires de l’hôte37. Même si la réponse agit comme un mécanisme de défense, l’inflammation suractivée est préjudiciable à la neurogenèse, et l’environnement inflammatoi...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Cette étude a été financée par des subventions du Fonds de développement scientifique et technologique (FDCT) de la RAS de Macao (réf. No. FDCT0058/2019/A1 et 0016/2019/AKP), Comité de recherche, Université de Macao (MYRG2020-00183-ICMS et CPG2022-00023-ICMS) et Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81803398).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA6361
Agarose, low gelling temperatureSigma-AldrichA9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter InjectorDrummond Scientific3-000-207
Fluorescence stereo microscopesLeicaM205 FA
GraphPad Prism softwareGraphPad SoftwareVer. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4Sigma-AldrichL3024
Manual micromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301
Mineral oilSigma-AldrichM5904
Mx3005P qPCR systemAgilent TechnologiesMx3005P
Nanovue plus spectrophotometerBiochrom80-2140-46
Nitrite concentration assay kitBeyotime BiotechnologyS0021M
Phosphate-buffered salineSigma-AldrichP4417
Programmable Horizontal Pipette PullerWorld Precision InstrumentsPMP-102
PTU (N-Phenylthiourea)Sigma-AldrichP7629
Random primersTakara3802
SuperScript II Reverse TranscriptaseInvitrogen18064014
SYBR Premix Ex Taq II kitAccurate BiologyAG11701
The 3rd Gen TgrinderTiangenOSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mmWorld Precision InstrumentsTW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester)Sigma-AldrichA-5040
TRNzol Universal reagentTiangenDP424
Zebrafish tracking boxViewPoint Behavior Technology

Références

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