Nöroinflamasyon ve Nörotoksisiteyi Değerlendirmek için Larva Zebra Balıklarına Lipopolisakkaritin Beyin Ventriküler Mikroenjeksiyonları

Özet

Bu protokol, ortaya çıkan nöroinflamatuar yanıtı ve nörotoksisiteyi incelemek için bir zebra balığı larva modelinde beyin ventriküler bölgesine lipopolisakkaritin mikroenjeksiyonunu göstermektedir.

Özet

Nöroinflamasyon, nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli nörolojik bozukluklarda önemli bir oyuncudur. Bu nedenle, nöroinflamasyonun nörodejenerasyondaki rolünü anlamak için alternatif in vivo nöroinflamasyon modellerinin araştırılması ve geliştirilmesi büyük ilgi görmektedir. Bu çalışmada, immün yanıtı ve nörotoksisiteyi indüklemek için lipopolisakkaritin (LPS) ventriküler mikroenjeksiyonunun aracılık ettiği larva zebra balığı nöroinflamasyon modeli geliştirilmiş ve doğrulanmıştır. Transgenik zebra balığı hatları elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP ve mpo: EGFP, floresan yoğunluk analizi ile entegre floresan canlı görüntüleme ile beyin nöron canlılığının gerçek zamanlı olarak ölçülmesi için kullanılmıştır. Zebra balığı larvalarının lokomotor davranışı, bir video izleme kaydedici kullanılarak otomatik olarak kaydedildi. Larva zebra balığı kafasında LPS-indüklenen immün yanıtı değerlendirmek için nitrik oksit (NO) içeriği ve interlökin-6 (IL-6), interlökin-1β (IL-1β) ve insan tümör nekroz faktör α (TNF-α) dahil olmak üzere inflamatuar sitokinlerin mRNA ekspresyon düzeyleri araştırıldı. LPS'nin beyin ventriküler enjeksiyonundan 24 saat sonra, zebra balığı larvalarında nöron kaybı ve hareket eksikliği gözlendi. Ek olarak, LPS'ye bağlı nöroinflamasyon, döllenme sonrası 6 gün (dpf) zebra balığı larvalarının başında NO salınımını ve IL-6, IL-1β ve TNF-α mRNA ekspresyonunu arttırdı ve zebra balığı beyninde nötrofillerin işe alınmasıyla sonuçlandı. Bu çalışmada, zebra balıklarının LPS ile 5 dpf'de 2.5-5 mg / mL konsantrasyonda enjeksiyonu, bu farmakolojik nöroinflamasyon testi için en uygun koşul olarak belirlenmiştir. Bu protokol, bir zebra balığı larvasında LPS aracılı nöroinflamasyonu ve nörotoksisiteyi indüklemek için LPS'nin beyin ventrikülü mikroenjeksiyonu için yeni, hızlı ve etkili bir metodoloji sunar; bu, nöroinflamasyonu incelemek için yararlıdır ve aynı zamanda yüksek verimli bir in vivo ilaç tarama testi olarak da kullanılabilir.

Giriş

Nöroinflamasyon, merkezi sinir sisteminin (MSS) çeşitli nörodejeneratif hastalıklarının patogenezinde rol oynayan önemli bir anti-nörojenik faktör olarak ^{tanımlanmıştır1}. Patolojik hakaretleri takiben, nöroinflamasyon, nörogenezin inhibisyonu ve nöronal hücre ölümünün indüklenmesi de dahil olmak üzere çeşitli olumsuz sonuçlara yol açabilir ^2,3. Enflamasyon indüksiyonuna yanıtın altında yatan süreçte, çoklu inflamatuar sitokinler (TNF-α, IL-1β ve IL-6 gibi) hücre dışı boşluğa salgılanır ve nörojen ölümünde ve nörogenezin baskılanmasında çok önemli bileşenler olarak işlev görür

Protokol

AB vahşi tip zebra balığı ve transgenik zebra balığı hatları elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP ve mpo: EGFP, Çin Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden (ICMS) elde edilmiştir. Hayvan deneyleri için etik onay (UMARE-030-2017) Makao Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından verilmiş ve protokol kurumsal hayvan bakım kılavuzlarını izlemektedir.

1. Zebra balığı embriyo ve larva yetiştiriciliği

1. Zebra balığı embriyoları (çiftleşme başına 200-300 embriyo) daha önce bildirildiği gibi doğal çift çiftleşme yoluyla üretin²⁸.
2. ddH 2 O'da 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl 2·2H_{2 O ve}

Sonuçlar

Burada açıklanan iş akışı, zebra balığı larvalarında LPS aracılı nöroinflamasyonu ve nörotoksisiteyi indüklemek için yeni, hızlı ve etkili bir metodoloji sunmaktadır. Bu tarif edilen protokolde, 5 dpf zebra balığı, bir mikroenjektör kullanılarak beyin ventriküllerine LPS (Şekil 1) enjekte edildi (Şekil 2A-C). Beyin ventrikül bölgesine başarılı enjeksiyon% 1 Evans mavi lekesi kullanılarak doğrula.......

Tartışmalar

Epidemiyolojik ve deneysel verilerin giderek artan miktarı, kronik bakteriyel ve viral enfeksiyonları nörodejeneratif hastalıklar için olası risk faktörleri olarak göstermektedir³⁶. Enfeksiyon, enflamatuar süreçlerin aktivasyonunu ve konakçı immün yanıtlarını tetikler³⁷. Yanıt bir savunma mekanizması olarak hareket etse bile, aşırı aktive inflamasyon nörogeneze zararlıdır ve enflamatuar ortam yenidoğan nöronlarının hayatta kalmasına izin vermez<.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A6361
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond Scientific	3-000-207
Fluorescence stereo microscopes	Leica	M205 FA
GraphPad Prism software	GraphPad Software	Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4	Sigma-Aldrich	L3024
Manual micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904
Mx3005P qPCR system	Agilent Technologies	Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer	Biochrom	80-2140-46
Nitrite concentration assay kit	Beyotime Biotechnology	S0021M
Phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller	World Precision Instruments	PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
Random primers	Takara	3802
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit	Accurate Biology	AG11701
The 3rd Gen Tgrinder	Tiangen	OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm	World Precision Instruments	TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester)	Sigma-Aldrich	A-5040
TRNzol Universal reagent	Tiangen	DP424
Zebrafish tracking box	ViewPoint Behavior Technology