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要約

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ幼虫モデルの脳室領域へのリポ多糖のマイクロインジェクションを実証し、結果として生じる神経炎症反応と神経毒性を研究します。

要約

神経炎症は、神経変性疾患を含むさまざまな神経障害の重要なプレーヤーです。したがって、神経変性における神経炎症の役割を理解するために、代替の in vivo 神経炎症モデルを研究開発することは非常に興味深いことです。この研究では、リポ多糖(LPS)の心室マイクロインジェクションによって免疫応答と神経毒性を誘導する神経炎症の幼生ゼブラフィッシュモデルが開発され、検証されました。トランスジェニックゼブラフィッシュ系統elavl3:mCherry、ETvmat2:GFP、およびmpo:EGFPは、蛍光強度分析と統合された蛍光ライブイメージングによる脳ニューロン生存率のリアルタイム定量に使用されました。ゼブラフィッシュ幼虫の自発運動行動は、ビデオ追跡レコーダーを使用して自動的に記録されました。一酸化窒素(NO)の含有量、およびインターロイキン-6(IL-6)、インターロイキン-1β(IL-1β)、およびヒト腫瘍壊死因子α(TNF-α)を含む炎症性サイトカインのmRNA発現量を調べ、ゼブラフィッシュ幼生の頭部におけるLPS誘発免疫応答を評価しました。LPSの脳室注射後24時間で、ゼブラフィッシュの幼虫でニューロンの喪失と移動障害が観察されました。さらに、LPS誘発性神経炎症は、受精後6日目(dpf)ゼブラフィッシュ幼虫の頭部におけるNO放出およびIL-6、IL-1β、およびTNF-αのmRNA発現を増加させ、ゼブラフィッシュ脳における好中球の動員をもたらした。この研究では、ゼブラフィッシュにLPSを5 dpfで2.5〜5 mg / mLの濃度で注射することが、この薬理学的神経炎症アッセイの最適条件として決定されました。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼虫にLPSを介した神経炎症と神経毒性を誘導するためのLPSの脳室マイクロインジェクションのための新しい、迅速で効率的な方法論を提示し、神経炎症の研究に有用であり、ハイスループット のin vivo 薬物スクリーニングアッセイとしても使用できる可能性があります。

概要

神経炎症は、中枢神経系(CNS)のいくつかの神経変性疾患の病因に関与する重要な抗神経原性因子として説明されています1。病理学的侮辱に続いて、神経炎症は、神経新生の阻害および神経細胞死の誘導を含む様々な有害な結果をもたらす可能性がある2,3。炎症誘導に対する応答の根底にあるプロセスでは、複数の炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-1β、IL-6など)が細胞外空間に分泌され、ニューロン死と神経新生の抑制に重要なコンポーネントとして機能します4,5,6。

炎症メディエーター(IL-1β、L-アルギニン、エンドトキシンなど)を脳にマイクロインジェクションすると、神経細胞の減少と神経炎症を引き起こす可能性があります7,8,9。グラム陰性菌の細胞壁に存在する病原性エンドトキシンであるリポ多糖(LPS、図1)は、動物の神経炎症を誘発し、神経変性を悪化させ、神経新生を低下させる可能性があります10。マウス脳のCNSへのLPS直接注射は、一酸化窒素、炎症誘発性サイトカイン、および他の調節因子のレベルを増加させた11。さらに、局所脳環境へのLPSの定位固定装置注射は、神経毒性分子の過剰産生を誘発し、神経機能障害およびそれに続く神経変性疾患の発症をもたらす可能性がある10、12、13、14、15。神経科学の分野では、生体の細胞および生物学的プロセスのライブおよびタイムコース顕微鏡観察は、病因と薬理作用の根底にあるメカニズムを理解するために重要です16。しかし、神経炎症と神経毒性のマウスモデルのライブイメージングは、顕微鏡の限られた光学的浸透深さによって根本的に制約され、機能イメージングと発生過程のライブ観察が妨げられます17,18,19。したがって、代替の神経炎症モデルの開発は、ライブイメージングによる病理学的発達、および神経炎症および神経変性の根底にあるメカニズムの研究を促進するために非常に興味深いものです。

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、進化的に保存された自然免疫系、光透過性、大きな胚クラッチサイズ、遺伝的扱いやすさ、およびin vivoイメージングへの適合性により、神経炎症と神経変性を研究するための有望なモデルとして浮上しています19,20,21,22,23.以前のプロトコルでは、メカニズム評価なしにゼブラフィッシュ仔魚の卵黄と後脳室にLPSを直接注入するか、単にLPSを魚の水(培地)に添加して致命的な全身免疫応答を誘導していました24,25,26,27。ここでは、受精後5日目(dpf)ゼブラフィッシュ幼虫に自然免疫応答または神経毒性を引き起こすために、脳室へのLPSのマイクロインジェクションのためのプロトコルを開発しました。この応答は、注射後24時間でのゼブラフィッシュ脳におけるニューロン細胞の喪失、運動行動障害、亜硝酸塩放出の増加、炎症性遺伝子発現の活性化、および好中球の動員によって証明されます。

プロトコル

AB野生型ゼブラフィッシュおよびトランスジェニックゼブラフィッシュ系統elavl3:mCherry、ETvmat2:GFP、およびmpo:EGFPは、中国医学研究所(ICMS)から入手しました。動物実験の倫理的承認(UMARE-030-2017)は、マカオ大学の動物研究倫理委員会によって付与され、プロトコルは施設の動物管理ガイドラインに従います。

1.ゼブラフィッシュの胚と幼虫の飼育

  1. ゼブラフィッシュ胚(交配あたり200〜300胚)を、以前に報告されたように自然ペアワイズ交配によって生成します28。
  2. 34.8 gのNaCl、1.6 gのKCl、5.8 gのCaCl2·2H 2 O、および9.78 gのMgCl 2·6H 2 OをddH 2 Oに溶解して、卵水(E3)培地ストック(60×)を最終容量2 Lに調製し、NaOHおよびHClを使用してpHを7.2に調整します。E3培地(1×)の使用濃度を調製するには、ストックをddH2Oで60倍に希釈し、使用しないときは28.5°Cで保管します。
  3. プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、ゼブラフィッシュの胚をE3培地を含む皿に移します。インキュベーター内で胚を28.5°Cで飼育し、発生と健康状態を監視します。死んだ胚を取り除き、汚れたE3培地を毎日新鮮な培地と交換します。
  4. ゼブラフィッシュイメージング実験では、プラスチック製トランスファーピペットを使用して、0.003%N-フェニルチオ尿素(PTU)を含む約15 mLの1× E3培地で受精後0〜2時間(hpf)胚(約200個の卵)を収集します。
    注:PTUは、胚形成中にメラノフォアの形成を阻害する可能性があります29。胚形成中のPTUによる胚の処理は、顕微鏡観察または蛍光30の発現におけるシグナル検出を改善することができる。
  5. 胚が所望の発生幼虫期に達するまで、上記の条件下でゼブラフィッシュ胚を維持する。

2.マイクロインジェクションの準備

  1. ガラスキャピラリーチューブ引き上げの5段階のプロトコル(表1)に従って、マイクロピペットプラー(材料の表を参照)を使用してガラスキャピラリーを引っ張って注入の準備をします。
  2. 鉗子を使用して、針の先端(フィラメント付きの薄肉ガラスキャピラリー[3.5インチ]、外径1.14 mm)を適切なサイズに斜めに開きます(図2A)。
  3. 針に0.1mLの鉱油を入れて、気泡がないことを確認します。
  4. マイクロインジェクション装置のスチール針のスクリューキャップを取り外します。ガラス針の穴をスチール針に合わせ、ネジキャップを締めます。装填したニードルマイクロインジェクション装置をマイクロマニピュレーターに取り付けます( 材料の表を参照)。
  5. マイクロマニピュレータが顕微鏡下で装置を柔軟に移動できるように、マイクロ注入装置の位置を調整します。一定量のパラフィンオイルを排出して、スチール針を毛細管ガラス管に入れます。
  6. 70%エタノールで滅菌したスライドガラスに注射液(1×PBSや5mg/mLLPSなど)を滴下し、チップが液滴に挿入されるようにマイクロインジェクション装置を調整します。~2 μLの注射液を針にセットします。
  7. マイクロマニピュレーター(上下左右の微調整設定)を、マイクロインジェクション装置の針先が高倍率の幼虫と同じ視野になるように設定します(図2B)。

3.マイクロインジェクション用のゼブラフィッシュの取り付け

注:ゼブラフィッシュの脳の発達は3 dpf以内に起こり、よく発達した中枢神経系で5 dpfで成熟します31,32。したがって、5 dpf幼虫は、LPSを介した神経損傷、ならびに行動および炎症反応の研究にすでに適しています。

  1. ゼブラフィッシュの幼虫は、注入時期の一貫性を維持するために、目的の段階に到達してから約30分以内に注入します。
  2. ゼブラフィッシュの幼虫を麻酔するには、トリカインときれいな水槽の水(最終濃度0.02%w / vトリカイン)を組み合わせます。
  3. マイクロ波を用いてddH 2 O中の2%アガロースの溶液を溶融する。溶融アガロースをプラスチック皿に注ぎます。2%アガロースコーティングされたプラスチック皿は、4°Cで最大2週間保存できます。
  4. プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、麻酔をかけた幼虫を2%アガロースコーティングされたプラスチック皿の中央に輸送します。針がアクセスできるように、マウントされた幼虫を脳側を上にして向きを変えます。

4.脳室を注射する

  1. ゼブラフィッシュの脳室構造が視野にはっきりと表示されるように顕微鏡の倍率を調整します(図2B)。
  2. 針を脳蓋の上に注意深く置きます(図2C)。
  3. ゼブラフィッシュの脳の皮膚を針先でマイクロマニピュレーターを使ってゆっくりと穿刺します。
  4. フットペダルを押して、1 nLの1x PBSまたは異なる濃度のLPS(1.0、2.5、および5.0 mg / mL)を排出します( 材料の表を参照)。脳室に1nLの1%エバンスブルー染料(PBSで希釈)を注入した成功した心室注射画像を例として示す(図2D)。注射直後に幼虫をきれいなE3培地に移す。24時間後、顕微鏡イメージング、機関車の行動アッセイ、および他の指標の決定のために幼虫を収集します。

5. イメージング

  1. E3培地で1.5%低メルトアガロース溶液を調製し、マイクロ波で加熱して透明な液体を形成します。
  2. 清潔なプラスチック製のトランスファーピペットを使用して幼虫をスライドガラスに輸送し、できるだけ多くの水を取り除きます。
  3. プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、幼虫に1.5%低融点アガロースを一滴加えます。
    注:幼虫を傷つけないように添加する前に、ピペットで低溶融アガロースをしばらく冷却します。
  4. 1 mLの注射針を使用して幼虫の向きを変えます。アガロースが冷えて固まるまで待ってから、イメージングを開始します。
  5. Tg(ETvmat2:EGFP)およびTg(elavl3:mCherry)ゼブラフィッシュの全脳のニューロン領域、およびTg(mpo:EGFP)ゼブラフィッシュ脳内の好中球の動員を蛍光実体顕微鏡で観察および撮影します( 資料表を参照)。
    注:イメージングに使用される蛍光顕微鏡の設定を以下に示します。Tg(ETvmat2:EGFP)ゼブラフィッシュ脳 (励起波長: 450-490 nm, 発光波長: 500-550 nm, 視覚倍率: 100倍);Tg(elavl3:mCherry)ゼブラフィッシュ脳(励起波長:541-551 nm、発光波長:590 nm、視覚倍率:100倍);Tg(mpo:EFGP)ゼブラフィッシュ脳(励起波長:450-490 nm、発光波長:500-550 nm、視覚倍率:63倍)。
  6. ImageJソフトウェアを使用して、Tg(ETvmat2:EGFP)ゼブラフィッシュのRaニューロン領域の蛍光強度と長さ、およびTg(elavl3:mCherry)ゼブラフィッシュ脳ニューロンの蛍光強度を測定および分析します。Tg(mpo:EFGP)ゼブラフィッシュの脳領域の好中球を手動でカウントします。

6. 遺伝子発現マーカーの決定

  1. LPS脳室注射の24時間後に、遺伝子発現マーカーの決定を進める。これを行うには、ゼブラフィッシュの幼虫を0.02%のトリカインで麻酔します(ステップ3.2で述べたように)。
  2. 2つの1 mLシリンジを使用して、目と卵黄嚢領域のない幼虫の頭部(グループあたり40匹の幼虫)を分離します(図2E)。
  3. 幼虫の頭部からRNAを抽出する。
    1. RNA抽出の場合は、ヘッド部分を200 μLのRNA抽出試薬( 材料表を参照)で組織グラインダー( 材料表を参照)で回転速度11,000 rpmで5秒間ホモジナイズします。
    2. クロロホルム-イソプロパノール法を用いてRNA抽出を行う。これを行うには、40 μLのクロロホルムを加え、チューブを激しく振って、室温で10分間インキュベートします。サンプルを12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
    3. 水相を新しいチューブ(約100μL)に移し、100μLのイソプロパノールを加える。10分間インキュベートした後、12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を取り除きます。
    4. 200 μLの75%エタノールを加えてRNAペレットを洗浄します。サンプルを短時間ボルテックスした後、7500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨て、RNAペレットを再度洗浄する。
    5. RNAペレットを5〜10分間風乾した後、30μLのRNaseフリー水を加えてRNAペレットを溶解します。マイクロボリューム分光光度計を使用して、RNAの純度(260 nmと280 nmの吸光度の比)と完全性を確認します( 材料の表を参照)。
  4. ランダムプライマーを含む逆転写酵素を使用して、ステップ6.3で抽出したRNAからcDNAを合成します( 材料の表を参照)。
    1. ランダムプライマー1 μL、dNTP1 μL、RNA(1 μg)、蒸留水(総容量12 μL)をヌクレアーゼフリーチューブに加えます。混合物を65°Cに5分間加熱し、氷上ですばやく冷やします。
    2. 1 μLの0.1 M DTT、1 μLのRNase阻害剤、4 μLの5×第一鎖バッファー、および1 μLのM-MLV逆転写酵素(総容量:20 μL)をチューブに加えます。穏やかに混合し、チューブを25°Cで2分間インキュベートし、続いて42°Cで50分間インキュベートします。70°Cで15分間加熱して反応を失活させる。
  5. 市販のRT-qPCRキット(材料表参照)を使用してqPCRシステム(材料表を参照)でリアルタイムPCRを実行し、標的遺伝子(IL-1β、IL-6、およびTNF-α)の発現を測定します。反応混合物(20 μL)には、10 μLのSYBRグリーン、0.4 μLのROX参照色素、フォワードプライマーとリバースプライマーそれぞれ0.8 μL、6 μLのddH 2 O、および2μLのテンプレートcDNA(1 μg)が含まれていました。95°Cで30秒、続いて95°Cで5秒、60°Cで34秒を40サイクル、解離ステージを95°Cで15秒、60°Cで60秒、95°Cで15秒の条件でPCR増幅を行います。
  6. 標的遺伝子のmRNAレベルをハウスキーピング遺伝子、伸長因子1 α(Ef1α)のmRNAレベルに正規化します。2−ΔΔCT法33により各標的遺伝子の発現量を算出する。各遺伝子のプライマー配列を 表2に記載する。
  7. 一酸化窒素の測定のために、組織粉砕機を使用してヘッド部分(ステップ6.2で得られた)を100μLの冷たいPBSで均質化します。得られたPBSとヘッド部分懸濁液を12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 溶解物を回収し、市販のキットを用いて亜硝酸塩濃度アッセイ34 を行う( 材料の表を参照されたい)。

7.ゼブラフィッシュ機関車行動アッセイ

  1. LPS脳室注射の24時間後に、ゼブラフィッシュの幼虫を96ウェルの正方形のマイクロプレートのウェルに個別に移します。300 μLのE3培地を各ウェルに加え、幼虫を4時間インキュベートして試験プレートに順応させます。
  2. 幼虫が装填したマイクロプレートをゼブラフィッシュ追跡ボックスに移します( 材料の表を参照)。光源をオンにしてから、テストボックスで幼虫を30分間インキュベートして、環境を順応させます。
  3. 自動ビデオ追跡システムを使用してゼブラフィッシュの行動を監視および記録します。ゼブラフィッシュごとに12セッション(各5分、合計1時間)を記録します。合計距離(非アクティブ距離、小距離、大距離で構成される)を、60分間の追跡期間中に各魚が移動した距離(mm単位)として定義します。

8.統計分析

  1. 標準の解析ソフトウェアを使用して統計解析を実行します(材料表を参照)。
  2. 通常の一元配置分散分析を使用して、2つのグループ間の差の統計分析を実行します。ピアソンの相関係数を計算して、相関の強さを評価します。P < 0.05は、すべての分析で有意であると考えられた。

結果

ここで説明するワークフローは、ゼブラフィッシュ幼虫にLPSを介した神経炎症と神経毒性を誘導するための新しい、迅速で効率的な方法論を提示します。この記載されたプロトコルでは、5 dpfゼブラフィッシュをマイクロインジェクター(図2A-C)を使用して脳室にLPS(図1)を注射しました。脳室部位への注射の成功は、1%エバ?...

ディスカッション

ますます多くの疫学的および実験的データが、神経変性疾患の可能性のある危険因子として慢性細菌およびウイルス感染に関係しています36。感染は炎症過程の活性化と宿主免疫応答を引き起こします37。応答が防御機構として作用したとしても、過剰活性化された炎症は神経新生に有害であり、炎症環境は新生児ニューロンの生存を可能にしない

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益を宣言していない。

謝辞

この研究は、マカオ特別行政区の科学技術開発基金(FDCT)からの助成金によって支援されました(文献番号。FDCT0058/2019/A1および0016/2019/AKP)、マカオ大学研究委員会(MYRG2020-00183-ICMSおよびCPG2022-00023-ICMS)、および中国国家自然科学基金会(第81803398号)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA6361
Agarose, low gelling temperatureSigma-AldrichA9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter InjectorDrummond Scientific3-000-207
Fluorescence stereo microscopesLeicaM205 FA
GraphPad Prism softwareGraphPad SoftwareVer. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4Sigma-AldrichL3024
Manual micromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301
Mineral oilSigma-AldrichM5904
Mx3005P qPCR systemAgilent TechnologiesMx3005P
Nanovue plus spectrophotometerBiochrom80-2140-46
Nitrite concentration assay kitBeyotime BiotechnologyS0021M
Phosphate-buffered salineSigma-AldrichP4417
Programmable Horizontal Pipette PullerWorld Precision InstrumentsPMP-102
PTU (N-Phenylthiourea)Sigma-AldrichP7629
Random primersTakara3802
SuperScript II Reverse TranscriptaseInvitrogen18064014
SYBR Premix Ex Taq II kitAccurate BiologyAG11701
The 3rd Gen TgrinderTiangenOSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mmWorld Precision InstrumentsTW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester)Sigma-AldrichA-5040
TRNzol Universal reagentTiangenDP424
Zebrafish tracking boxViewPoint Behavior Technology

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