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Neste Artigo

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Resumo

Este protocolo demonstra a microinjeção de lipopolissacarídeo na região ventricular cerebral em um modelo larval de peixe-zebra para estudar a resposta neuroinflamatória e a neurotoxicidade resultantes.

Resumo

A neuroinflamação é um jogador-chave em vários distúrbios neurológicos, incluindo doenças neurodegenerativas. Portanto, é de grande interesse pesquisar e desenvolver modelos alternativos de neuroinflamação in vivo para entender o papel da neuroinflamação na neurodegeneração. Neste estudo, um modelo larval de peixe-zebra de neuroinflamação mediado por microinjeção ventricular de lipopolissacarídeo (LPS) para induzir uma resposta imune e neurotoxicidade foi desenvolvido e validado. As linhagens transgênicas de peixe-zebra elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP e mpo:EGFP foram utilizadas para quantificação em tempo real da viabilidade dos neurônios cerebrais por imagem viva de fluorescência integrada com análise de intensidade de fluorescência. O comportamento locomotor das larvas de peixe-zebra foi registrado automaticamente por meio de um gravador de vídeo-rastreamento. O conteúdo de óxido nítrico (NO) e os níveis de expressão de mRNA de citocinas inflamatórias, incluindo interleucina-6 (IL-6), interleucina-1β (IL-1β) e fator de necrose tumoral humana α (TNF-α) foram investigados para avaliar a resposta imune induzida por LPS na cabeça larval de peixe-zebra. Às 24 h após a injeção ventricular cerebral de LPS, foram observadas perda de neurônios e deficiência de locomoção em larvas de peixe-zebra. Além disso, a neuroinflamação induzida por LPS aumentou a liberação de NO e a expressão de mRNA de IL-6, IL-1β e TNF-α na cabeça de larvas de peixe-zebra após 6 dias de fertilização (dpf) e resultou no recrutamento de neutrófilos no cérebro do peixe-zebra. Neste estudo, a injeção de peixe-zebra com LPS a uma concentração de 2,5-5 mg/mL a 5 dpf foi determinada como a condição ideal para este ensaio de neuroinflamação farmacológica. Este protocolo apresenta uma metodologia nova, rápida e eficiente para a microinjeção de LPS no ventrículo cerebral para induzir neuroinflamação e neurotoxicidade mediadas por LPS em uma larva de peixe-zebra, que é útil para o estudo da neuroinflamação e também pode ser usada como um ensaio de triagem de drogas in vivo de alto rendimento.

Introdução

A neuroinflamação tem sido descrita como um fator antineurogênico crucial envolvido na patogênese de várias doenças neurodegenerativas do sistema nervoso central (SNC)1. Após insultos patológicos, a neuroinflamação pode resultar em várias consequências adversas, incluindo inibição da neurogênese e indução da morte celular neuronal 2,3. No processo subjacente à resposta à indução da inflamação, múltiplas citocinas inflamatórias (como TNF-α, IL-1β e IL-6) são secretadas no espaço extracelular e atuam como componentes cruciais na morte dos neurônios e na supressão da neurogênese 4,5,6.

A microinjeção de mediadores inflamatórios (como IL-1β, L-arginina e endotoxinas) no cérebro pode causar redução das células neuronais e neuroinflamação 7,8,9. O lipopolissacarídeo (LPS, Figura 1), endotoxina patogênica presente na parede celular de bactérias Gram-negativas, pode induzir neuroinflamação, exacerbar a neurodegeneração e reduzir a neurogênese em animais10. A injeção de LPS diretamente no SNC do cérebro de camundongos aumentou os níveis de óxido nítrico, citocinas pró-inflamatórias e outros reguladores11. Além disso, a injeção estereotáxica de LPS no ambiente cerebral local pode induzir a produção excessiva de moléculas neurotóxicas, resultando em comprometimento da função neuronal e subsequente desenvolvimento de doenças neurodegenerativas 10,12,13,14,15. No campo da neurociência, observações microscópicas ao vivo e em curso temporal de processos celulares e biológicos em organismos vivos são cruciais para a compreensão dos mecanismos subjacentes à patogênese e à ação farmacológica16. No entanto, a imagem ao vivo de modelos de neuroinflamação e neurotoxicidade em camundongos é fundamentalmente limitada pela profundidade limitada de penetração óptica da microscopia, o que impede a imagem funcional e a observação ao vivo dos processos de desenvolvimento17,18,19. Portanto, o desenvolvimento de modelos alternativos de neuroinflamação é de grande interesse para facilitar o estudo do desenvolvimento patológico e do mecanismo subjacente à neuroinflamação e neurodegeneração, por meio de imagens ao vivo.

O peixe-zebra (Danio rerio) emergiu como um modelo promissor para estudar a neuroinflamação e a neurodegeneração devido ao seu sistema imunológico inato evolutivamente conservado, transparência óptica, grande tamanho da embreagem embrionária, tratabilidade genética e adequação para imagens in vivo 19,20,21,22,23 . Protocolos prévios injetaram diretamente LPS na gema e no ventrículo rombencéfalo de larvas de peixe-zebra sem avaliação mecanicista, ou simplesmente adicionaram LPS à água de peixes (meio de cultura) para induzir uma resposta imune sistêmica letal24,25,26,27. Neste trabalho, desenvolvemos um protocolo para microinjeção de LPS nos ventrículos cerebrais, para desencadear uma resposta imune inata ou neurotoxicidade nos 5 dias pós-fertilização (dpf) larvas de peixe-zebra. Essa resposta é evidenciada pela perda de células neuronais, déficit de comportamento locomotor, aumento da liberação de óxido de nitrito, ativação da expressão gênica inflamatória e recrutamento de neutrófilos no cérebro do peixe-zebra 24 h após a injeção.

Protocolo

As linhagens AB de zebrafish do tipo selvagem e zebrafish transgênico elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP e mpo:EGFP foram obtidas do Instituto de Ciências Médicas Chinesas (ICMS). A aprovação ética (UMARE-030-2017) para as experiências com animais foi concedida pela Comissão de Ética em Investigação Animal da Universidade de Macau, e o protocolo segue as orientações institucionais de cuidados com os animais.

1. Embrião de peixe-zebra e criação larval

  1. Gerar embriões de peixe-zebra (200-300 embriões por acasalamento) por acasalamento natural em pares, conforme relatado anteriormente28.
  2. Preparar o estoque médio de água do ovo (E3) (60×) dissolvendo 34,8 g de NaCl, 1,6 g de KCl, 5,8 g de CaCl 2·2H 2 O e 9,78 g de MgCl 2·6H 2 O em ddH 2 O para um volume final de 2 L e ajustar o pH para7,2 usando NaOH e HCl. Para preparar a concentração de trabalho do meio E3 (1×), diluir a calção 60 vezes em ddH2O. Armazenar a 28,5 °C quando não estiver a ser utilizado.
  3. Use uma pipeta de transferência de plástico para transferir os embriões de peixe-zebra para um prato contendo meio E3. Criar os embriões a 28,5 °C numa incubadora e monitorizar o seu desenvolvimento e saúde. Remova embriões mortos e substitua o meio E3 impuro por um meio fresco diariamente.
  4. Para experimentos de imagem de peixe-zebra, use uma pipeta de transferência de plástico para coletar embriões de 0-2 h pós-fertilização (hpf) (cerca de 200 ovos) em aproximadamente 15 mL de 1× meio E3 contendo 0,003% de N-feniltioureia (PTU).
    NOTA: A PTU pode inibir a formação de melanóforos durante a embriogênese29. O tratamento de embriões com PTU durante a embriogênese pode melhorar a detecção de sinais em microscopia ou expressão de fluorescência30.
  5. Manter os embriões de peixe-zebra nas condições acima até que os embriões atinjam o estágio larval de desenvolvimento desejado.

2. Preparação para microinjeção

  1. Preparar para a injeção puxando capilares de vidro usando um extrator de micropipeta (ver Tabela de Materiais), seguindo o protocolo de cinco etapas para puxar tubos capilares de vidro (Tabela 1).
  2. Abra a ponta da agulha (capilares de vidro de parede fina [3,5 pol] com filamento, OD 1,14 mm) para o tamanho apropriado em um ângulo usando fórceps (Figura 2A).
  3. Encha a agulha com 0,1 mL de óleo mineral para garantir que não haja bolhas.
  4. Remova a tampa de rosca da agulha de aço do aparelho de microinjeção. Alinhe o orifício da agulha de vidro com a agulha de aço e, em seguida, aperte a tampa de rosca. Monte o aparelho de microinjeção de agulha carregado num micromanipulador (ver Tabela de Materiais).
  5. Ajustar a posição do aparelho de microinjecção de modo a que o micromanipulador possa mover de forma flexível o aparelho ao microscópio. Descarregue um certo volume de óleo de parafina para fazer com que a agulha de aço entre no tubo de vidro capilar.
  6. Solte a solução injetável (como 1× PBS ou 5 mg/mL LPS) em uma lâmina de vidro esterilizada com etanol a 70% e ajuste o aparelho de microinjeção para que a ponta seja inserida na gota líquida. Carregue ~2 μL de solução injetável na agulha.
  7. Configure o micromanipulador (ajustes finos de cima, para baixo, para a esquerda e para a direita) de modo que a ponta da agulha do aparelho de microinjeção esteja no mesmo campo de visão que as larvas em alta ampliação (Figura 2B).

3. Montagem de peixe-zebra para microinjeções

NOTA: O desenvolvimento do cérebro do peixe-zebra ocorre dentro de 3 dpf e amadurece a 5 dpf com um sistema nervoso central bem desenvolvido31,32. Portanto, as larvas de 5 dpf já são adequadas para estudar o dano neuronal mediado por LPS, bem como as respostas comportamentais e inflamatórias.

  1. Injete as larvas de peixe-zebra dentro de aproximadamente 30 minutos de atingir o estágio de interesse, para manter a consistência do tempo de injeção.
  2. Para anestesiar as larvas de peixe-zebra, combine tricaine com água limpa do tanque de peixes (concentração final de 0,02% p/v de tricaína).
  3. Derreter uma solução de agarose a 2% em ddH2O utilizando um micro-ondas. Despeje a agarose derretida em um prato de plástico. O prato de plástico revestido de acarose a 2% pode ser armazenado a 4 °C por até 2 semanas.
  4. Use uma pipeta de transferência de plástico para transportar larvas anestesiadas para o centro do prato de plástico revestido de acarose a 2%. Oriente as larvas montadas com o lado do cérebro para cima para o acesso da agulha.

4. Injetar o ventrículo cerebral

  1. Ajustar a ampliação do microscópio para que a estrutura ventricular cerebral do peixe-zebra seja claramente exibida no campo de visão (Figura 2B).
  2. Coloque a agulha cuidadosamente acima do tecto cerebral (Figura 2C).
  3. Perfure a pele do cérebro do peixe-zebra com a ponta da agulha lentamente usando o micromanipulador.
  4. Pressione o pedal para ejetar 1 nL de 1x PBS ou diferentes concentrações de LPS (1,0, 2,5 e 5,0 mg/mL) (consulte Tabela de Materiais). Imagens bem-sucedidas de injeção de ventrículo nas quais o ventrículo cerebral foi injetado com 1 nL de corante azul de Evans a 1% (diluído em PBS) são mostradas como exemplo (Figura 2D). Transfira as larvas para limpar o meio E3 imediatamente após a injeção. Após 24 h, coletar as larvas para imagens microscópicas, ensaio comportamental locomotor e determinação de outros indicadores.

5. Imagens

  1. Prepare uma solução de agarose de baixa fusão a 1,5% em meio E3 e aqueça-a em um micro-ondas para formar um líquido claro.
  2. Use uma pipeta de transferência de plástico limpa para transportar as larvas para uma lâmina de vidro e remova o máximo de água possível.
  3. Use uma pipeta de transferência de plástico para adicionar uma gota de agarose de baixo derretimento de 1,5% às larvas.
    NOTA: Arrefecer a agarose de baixa fusão na pipeta durante algum tempo antes de adicionar de modo a não ferir as larvas.
  4. Use uma agulha de seringa de 1 mL para orientar as larvas. Espere até que a agarose esfrie e solidifique antes de iniciar a imagem.
  5. Observe e fotografe a região do neurônio em todo o cérebro do peixe-zebra Tg(ETvmat2:EGFP) e Tg(elavl3:mCherry), bem como o recrutamento de neutrófilos no cérebro do peixe-zebra Tg(mpo:EGFP) sob um microscópio estéreo de fluorescência (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: As configurações do microscópio de fluorescência usadas para imagens são mostradas abaixo. Tg (ETvmat2: EGFP) cérebro de peixe-zebra (comprimento de onda de excitação: 450-490 nm, comprimento de onda de emissão: 500-550 nm, ampliação visual: 100x); Tg(elavl3:mCherry) cérebro de peixe-zebra (comprimento de onda de excitação: 541-551 nm, comprimento de onda de emissão: 590 nm, ampliação visual: 100x); Tg (mpo: EFGP) cérebro de peixe-zebra (comprimento de onda de excitação: 450-490 nm, comprimento de onda de emissão: 500-550 nm, ampliação visual: 63x).
  6. Meça e analise a intensidade e o comprimento da fluorescência da região do neurônio Ra no peixe-zebra Tg(ETvmat2:EGFP) e a intensidade de fluorescência dos neurônios cerebrais do peixe-zebra Tg(elavl3:mCherry) usando o software ImageJ. Conte manualmente os neutrófilos na região do cérebro do peixe-zebra Tg(mpo:EFGP).

6. Determinação dos marcadores de expressão gênica

  1. Às 24 h após a injeção ventricular cerebral LPS, prossiga com a determinação dos marcadores de expressão gênica. Para fazer isso, anestesiar larvas de peixe-zebra com tricaína a 0,02% (conforme mencionado na etapa 3.2).
  2. Utilizar duas seringas de 1 mL para separar as porções da cabeça das larvas (40 larvas por grupo) sem as regiões do olho e do saco vitelino (Figura 2E).
  3. Extraia o RNA das porções da cabeça larval.
    1. Para a extração de ARN, homogeneizar a porção da cabeça com 200 μL de reagente de extração de ARN (ver Tabela de Materiais) utilizando um moedor de tecidos (ver Tabela de Materiais) a uma velocidade de rotação de 11.000 rpm durante 5 s.
    2. Realizar a extração de RNA usando o método clorofórmio-isopropanol. Para fazer isso, adicione 40 μL de clorofórmio, agite os tubos vigorosamente e incube-os à temperatura ambiente por 10 min. Centrifugar as amostras a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
    3. Transfira a fase aquosa para um tubo fresco (cerca de 100 μL) e adicione 100 μL de isopropanol. Incubar durante 10 min e, em seguida, centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Remova o sobrenadante.
    4. Adicione 200 μL de etanol a 75% para lavar o pellet de RNA. Vórtice brevemente as amostras e, em seguida, centrifugar a 7500 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e lave o pellet de RNA novamente.
    5. Seque ao ar o pellet de RNA por 5-10 min, em seguida, adicione 30 μL de água livre de RNase para dissolver o pellet de RNA. Verificar a pureza (razão de absorvância a 260 nm e 280 nm) e a integridade do RNA usando um espectrofotômetro de microvolume (ver Tabela de Materiais).
  4. Sintetizar cDNA a partir do RNA extraído na etapa 6.3, usando transcriptase reversa com primers aleatórios (ver Tabela de Materiais).
    1. Adicione 1 μL de primers aleatórios, 1 μL de dNTPs, 1 μg de RNA e água destilada (volume total de 12 μL) a um tubo livre de nuclease. Aqueça a mistura a 65 °C durante 5 min e arrefeça rapidamente no gelo.
    2. Adicione 1 μL de TDT 0,1 M, 1 μL de inibidor de RNase, 4 μL de tampão de primeira fita 5× e 1 μL de transcriptase reversa M-MLV (volume total: 20 μL) ao tubo. Misturar suavemente e incubar o tubo a 25 °C durante 2 min, seguido de 42 °C durante 50 min. Inicie a reacção aquecendo a 70 °C durante 15 min.
  5. Execute PCR em tempo real em um sistema de qPCR (consulte Tabela de Materiais) usando um kit RT-qPCR comercialmente disponível (consulte Tabela de Materiais) para determinar a expressão dos genes-alvo (IL-1β, IL-6 e TNF-α). A mistura de reação (20 μL) continha 10 μL de verde SYBR, 0,4 μL de corante de referência ROX, 0,8 μL cada um dos primers dianteiro e reverso, 6 μL de ddH 2 O e2μL de cDNA molde (1 μg). Realizar amplificação por PCR nas condições: 95 °C por 30 s, seguida por 40 ciclos de 95 °C por 5 s e 60 °C por 34 s, e com um estágio de dissociação de 95 °C por 15 s, 60 °C por 60 s e 95 °C por 15 s.
  6. Normalizar os níveis de mRNA dos genes-alvo para o de um gene de limpeza, fator de alongamento 1 α (Ef1α). Calcular os níveis de expressão para cada gene alvo pelo método 2−ΔΔCT33. As sequências de iniciadores de cada gene estão descritas na Tabela 2.
  7. Para a determinação do óxido nítrico, homogeneizar a porção da cabeça (obtida na etapa 6.2) em 100 μL de PBS frio utilizando um moedor de tecido. Centrifugar o PBS resultante e a suspensão da porção da cabeça a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C. Recolha os lisados e efectue o ensaio de concentração de nitrito34 utilizando um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).

7. Ensaio comportamental da locomotiva peixe-zebra

  1. Às 24 h após a injeção ventricular cerebral LPS, transfira as larvas de peixe-zebra para os poços de uma microplaca quadrada de 96 poços individualmente. Adicionar 300 μL de meio E3 a cada poço e, em seguida, incubar as larvas por 4 h para se aclimatar à placa de teste.
  2. Transfira a microplaca carregada de larvas para a caixa de rastreamento de peixe-zebra (consulte Tabela de Materiais). Ligue a fonte de luz e, em seguida, incube as larvas na caixa de teste por 30 minutos para aclimatar o ambiente.
  3. Monitore e registre o comportamento do peixe-zebra usando um sistema automatizado de rastreamento de vídeo. Registre 12 sessões (5 min cada, total de 1 h) para cada peixe-zebra. Defina a distância total (consiste em distâncias inativas, pequenas e grandes) como a distância (em mm) que cada peixe se moveu durante um período de rastreamento de 60 minutos.

8. Análise estatística

  1. Realizar análises estatísticas usando um software de análise padrão (consulte Tabela de Materiais).
  2. Realizar análise estatística das diferenças entre dois grupos usando ANOVA unidirecional comum. Calcule o coeficiente de correlação de Pearson para avaliar a força das correlações. P < 0,05 foi considerado significativo em todas as análises.

Resultados

O fluxo de trabalho descrito aqui apresenta uma metodologia nova, rápida e eficiente para induzir neuroinflamação e neurotoxicidade mediadas por LPS em larvas de peixe-zebra. Neste protocolo descrito, 5 peixes-zebra dpf foram injetados com LPS (Figura 1) nos ventrículos cerebrais utilizando um microinjetor (Figura 2A-C). A injeção bem-sucedida no local do ventrículo cerebral foi verificada usando a coloração azul de Eva...

Discussão

Uma quantidade crescente de dados epidemiológicos e experimentais implica infecções bacterianas e virais crônicas como possíveis fatores de risco para doenças neurodegenerativas36. A infecção desencadeia a ativação de processos inflamatórios e respostas imunes do hospedeiro37. Mesmo que a resposta atue como um mecanismo de defesa, a inflamação superativada é prejudicial à neurogênese, e o ambiente inflamatório não permite a sobrevivência dos neurônios re...

Divulgações

Os autores declaram não haver interesse financeiro concorrente.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por subvenções do Fundo de Desenvolvimento da Ciência e Tecnologia (FDCT) da RAEM (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 e 0016/2019/AKP), Comissão de Investigação da Universidade de Macau (MYRG2020-00183-ICMS e CPG2022-00023-ICMS) e Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (n.º 81803398).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA6361
Agarose, low gelling temperatureSigma-AldrichA9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter InjectorDrummond Scientific3-000-207
Fluorescence stereo microscopesLeicaM205 FA
GraphPad Prism softwareGraphPad SoftwareVer. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4Sigma-AldrichL3024
Manual micromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301
Mineral oilSigma-AldrichM5904
Mx3005P qPCR systemAgilent TechnologiesMx3005P
Nanovue plus spectrophotometerBiochrom80-2140-46
Nitrite concentration assay kitBeyotime BiotechnologyS0021M
Phosphate-buffered salineSigma-AldrichP4417
Programmable Horizontal Pipette PullerWorld Precision InstrumentsPMP-102
PTU (N-Phenylthiourea)Sigma-AldrichP7629
Random primersTakara3802
SuperScript II Reverse TranscriptaseInvitrogen18064014
SYBR Premix Ex Taq II kitAccurate BiologyAG11701
The 3rd Gen TgrinderTiangenOSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mmWorld Precision InstrumentsTW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester)Sigma-AldrichA-5040
TRNzol Universal reagentTiangenDP424
Zebrafish tracking boxViewPoint Behavior Technology

Referências

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