신경 염증 및 신경 독성을 평가하기 위해 유충 제브라피쉬에 지질 다당류의 뇌실 미세 주입

요약

이 프로토콜은 결과적인 신경 염증 반응과 신경 독성을 연구하기 위해 제브라 피쉬 애벌레 모델에서 뇌실 영역에 지질 다당류를 미세 주입하는 것을 보여줍니다.

초록

신경 염증은 신경 퇴행성 질환을 포함한 다양한 신경 장애의 핵심 요소입니다. 따라서 신경 퇴행에서 신경 염증의 역할을 이해하기 위해 대체 생체 내 신경 염증 모델을 연구하고 개발하는 것이 큰 관심입니다. 이 연구에서는 면역 반응과 신경 독성을 유도하기 위해 지질 다당류 (LPS)의 심실 미세 주입에 의해 매개되는 신경 염증의 유충 제브라 피쉬 모델이 개발되고 검증되었습니다. 트랜스제닉 제브라피쉬 라인 elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP 및 mpo:EGFP는 형광 강도 분석과 통합된 형광 라이브 이미징에 의한 뇌 뉴런 생존력의 실시간 정량화에 사용되었습니다. 제브라 피쉬 유충의 운동 행동은 비디오 추적 레코더를 사용하여 자동으로 기록되었습니다. 유충 제브라피쉬 머리에서 LPS 유도 면역 반응을 평가하기 위해 산화질소(NO)의 함량 및 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-1β(IL-1β) 및 인간 종양 괴사 인자 α(TNF-α)를 포함한 염증성 사이토카인의 mRNA 발현 수준을 조사했습니다. LPS의 뇌실 주사 후 24 시간에 제브라 피쉬 유충에서 뉴런 손실과 운동 결핍이 관찰되었습니다. 또한, LPS 유도 신경염증은 수정 후 6일(dpf) 제브라피쉬 유충의 머리에서 NO 방출 및 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 mRNA 발현을 증가시키고, 제브라피쉬 뇌에서 호중구의 동원을 초래하였다. 이 연구에서는 5dpf에서 2.5-5mg/mL의 농도로 LPS를 제브라피쉬에 주사하는 것이 이 약리학적 신경염증 분석의 최적 조건으로 결정되었습니다. 이 프로토콜은 제브라피쉬 유충에서 LPS 매개 신경염증 및 신경독성을 유도하기 위해 LPS의 뇌실 미세 주입을 위한 새롭고 빠르고 효율적인 방법론을 제시하며, 이는 신경염증 연구에 유용하며 고처리량 생체 내 약물 스크리닝 분석으로도 사용될 수 있습니다.

서문

신경 염증은 중추 신경계 (CNS)의 여러 신경 퇴행성 질환의 발병 기전에 관여하는 중요한 항 신경 인성 인자로 설명되었습니다 ¹. 병리학 적 모욕 후, 신경 염증은 신경 발생의 억제 및 신경 세포 사멸의 유도를 포함하여 다양한 부작용을 초래할 수 있습니다 ^2,3. 염증 유도에 대한 반응의 기초가되는 과정에서 여러 염증성 사이토 카인 (예 : TNF-α, IL-1β 및 IL-6)이 세포 외 공간으로 분비되어 뉴런 사멸 및 신경 발생^억제에 중요한 구성 요소로 작용합니다 ^4,5,6.

염증 매개체 (예 : IL-1β, L- 아르기닌 및 내 독소)를 뇌에 미세 주입하면 신경 세포 감소 및 신경 염증 ^7,8,9가 발생할 수 있습니다. 그람 음성 박테리아의 세포벽에 존재하는 병원성 내독소인 리포폴리사카라이드(LPS, 그림 1)는 신경 염증을 유도하고 신경 퇴행을 악화시키며 동물의 신경 발생을 감소시킬 수 있습니다¹⁰. 마우스 뇌의 CNS에 직접 LPS 주사는 산화 질소, 전염증성 사이토카인 및 기타 조절자의 수준을 증가시켰다¹¹. 더욱이, 국소 뇌 환경으로의 LPS의 정위 주사는 신경 독성 분자의 과도한 생산을 유도하여 신경 기능 장애 및 신경 퇴행성 질환^{10,12,13,14,15}의 후속 발달을 초래할 수있다. 신경 과학 분야에서 살아있는 유기체의 세포 및 생물학적 과정에 대한 실시간 및 시간 경과 현미경 관찰은 병인 및 약리학 적 작용의 기본 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다¹⁶. 그러나, 신경 염증 및 신경 독성의 마우스 모델의 라이브 이미징은 근본적으로 현미경의 제한된 광학 침투 깊이에 의해 제한되며, 이는 기능적 이미징 및 발달 과정^17,18,19의 라이브 관찰을 배제합니다. 따라서 대체 신경 염증 모델의 개발은 라이브 이미징에 의한 병리학 적 발달 및 신경 염증 및 신경 퇴행의 기본 메커니즘에 대한 연구를 용이하게하는 데 큰 관심거리입니다.

Zebrafish (Danio rerio)는 진화 적으로 보존 된 선천적 면역 체계, 광학 투명성, 큰 배아 클러치 크기, 유전 적 다루기 성 및 생체 내 이미징에 대한 적합성으로 인해 신경 염증 및 신경 퇴행을 연구하는 유망한 모델로 부상했습니다. 19,20,21,22,23 . 이전 프로토콜은 기계 론적 평가없이 유충 제브라 피쉬의 난황과 뒷뇌 뇌실에 LPS를 직접 주입하거나 단순히 LPS를 어류 물 (배양 배지)에 추가하여 치명적인 전신 면역 반응을 유도했습니다 ^24,25,26,27. 여기에서 우리는 수정 후 5일(dpf) 제브라피쉬 유충에서 선천성 면역 반응 또는 신경독성을 유발하기 위해 뇌실에 LPS를 미세 주입하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 반응은 신경 세포 손실, 운동 행동 결핍, 아질산염 산화물 방출 증가, 염증 유전자 발현의 활성화 및 주사 후 24 시간에 제브라 피쉬 뇌의 호중구 모집에 의해 입증됩니다.

프로토콜

AB 야생형 제브라피쉬 및 형질전환 제브라피쉬 라인 elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, 및 mpo:EGFP는 중국의학연구소(ICMS)로부터 입수하였다. 동물 실험에 대한 윤리적 승인 (UMARE-030-2017)은 마카오 대학의 동물 연구 윤리위원회에서 부여되었으며 프로토콜은 기관 동물 관리 지침을 따릅니다.

1. 제브라 피쉬 배아와 애벌레 축산

1. 이전에 보고된 대로 자연 쌍 교배에 의해 제브라피쉬 배아(교배당 200-300개의 배아)를 생성합니다²⁸.
2. _ddH2O에 NaCl 34.8g, KCl 1.6g, CaCl2·2H2O 5.8g,_MgCl2·_6H2O9.78g을 용해시켜 계란물(E3) 중간 스톡(60×)을 최종 부피 2L로준비하고 NaOH 및 HCl을 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다. E3 배지(1×)의 작업 농도를 준비하려면 스톡을_ddH2O에 60배 희석하고 사용하지 않을 때는 28.5°C에서 보관하십시오.
3. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 제브라 피쉬 배아를 E3 배지가 들어있는 접시에 옮깁니다. 인큐베이터에서 배아를 28.5 ° C로 올리고 발달과 건강을 모니터링합니다. 죽은 배아를 제거하고 깨끗하지 않은 E3 배지를 매일 신선한 배지로 교체하십시오.
4. 제브라피쉬 이미징 실험의 경우 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 0.003% N-페닐티오우레아(PTU)를 함유한 1× E3 배지 약 15mL에서 수정 후 0-2시간(hpf) 배아(약 200개의 알)를 수집합니다.
   참고: PTU는 배아 발생 동안 멜라노포어의 형성을 억제할 수 있습니다²⁹. 배아 발생 동안 PTU로 배아를 처리하면 현미경 검사 또는 형광³⁰의 발현에서 신호 검출을 향상시킬 수 있습니다.
5. 배아가 원하는 발달 애벌레 단계에 도달 할 때까지 위의 조건에서 제브라 피쉬 배아를 유지하십시오.

2. 미세 주사 준비

1. 유리 모세관 당김에 대한 5단계 프로토콜(표 1)에 따라 마이크로피펫 풀러(재료 표 참조)를 사용하여 유리 모세관을 당겨 주입을 준비합니다.
2. 집게를 사용하여 바늘 끝(필라멘트가 있는 얇은 벽 유리 모세관[3.5인치], OD 1.14mm)을 적절한 크기로 엽니다(그림 2A).
3. 기포가 없는지 확인하기 위해 바늘에 0.1mL의 미네랄 오일을 채 웁니다.
4. 미세 주입 장치의 강철 바늘의 나사 캡을 제거합니다. 유리바늘 구멍을 강철 바늘에 맞춘 다음 나사 캡을 조입니다. 적재 된 바늘 미세 주입 장치를 미세 조작기에 장착하십시오 ( 재료 표 참조).
5. 미세 조작기가 현미경으로 장치를 유연하게 움직일 수 있도록 미세 주입 장치의 위치를 조정하십시오. 일정량의 파라핀 오일을 배출하여 강철 바늘이 모세관 유리관에 들어가도록 합니다.
6. 70 % 에탄올로 멸균 된 유리 슬라이드에 주사 용액 (예 : 1× PBS 또는 5mg / mL LPS)을 떨어 뜨리고 팁이 액체 방울에 삽입되도록 미세 주입 장치를 조정합니다. ~2μL의 주사액을 바늘에 넣습니다.
7. 미세 주입 장치의 바늘 끝이 고배율의 유충과 동일한 시야에 있도록 미세 조작기(위, 아래, 왼쪽 및 오른쪽의 미세 조정 설정)를 설정합니다(그림 2B).

3. 미세 주입을 위한 제브라피쉬 장착

참고: 제브라피쉬의 뇌 발달은 3dpf 내에서 발생하고 잘 발달된 중추신경계^31,32와 함께 5dpf에서 성숙합니다. 따라서 5 개의 dpf 유충은 이미 LPS 매개 신경 손상과 행동 및 염증 반응을 연구하는 데 적합합니다.

1. 주사 타이밍의 일관성을 유지하기 위해 관심 단계에 도달 한 후 약 30 분 이내에 제브라 피쉬 유충을 주입하십시오.
2. 제브라 피쉬 유충을 마취하려면 트리카인을 깨끗한 어항 물 (최종 농도 0.02 % w / v 트리카인)과 결합하십시오.
3. 마이크로파를 사용하여_ddH2O에 2% 아가로오스의 용액을 녹인다. 녹은 아가 로스를 플라스틱 접시에 붓습니다. 2% 아가로스 코팅 플라스틱 접시는 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.
4. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 마취된 유충을 2% 아가로스 코팅 플라스틱 접시의 중앙으로 운반합니다. 장착 된 유충이 바늘에 접근 할 수 있도록 뇌면이 위로 향하도록 향하게하십시오.

4. 뇌실 주입

1. 제브라 피쉬의 뇌실 구조가 시야에 명확하게 표시되도록 현미경의 배율을 조정하십시오 (그림 2B).
2. 바늘을 뇌 텍텀 위에 조심스럽게 놓습니다(그림 2C).
3. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘 끝으로 제브라 피쉬 뇌의 피부를 천천히 뚫습니다.
4. 풋 페달을 밟아 1nL의 1x PBS 또는 다양한 농도의 LPS(1.0, 2.5 및 5.0mg/mL)를 배출합니다( 재료 표 참조). 뇌실에 1 nL의 1 % Evans blue 염료 (PBS로 희석)를 주입 한 성공적인 심실 주입 이미지가 예로서 도시되어있다 (그림 2D). 주입 직후 유충을 깨끗한 E3 배지로 옮깁니다. 24 시간 후, 현미경 영상, 기관차 행동 분석 및 기타 지표 결정을 위해 유충을 수집합니다.

5. 이미징

1. E3 배지에 1.5% 저용융 아가로스 용액을 준비하고 전자레인지에서 가열하여 투명한 액체를 형성합니다.
2. 깨끗한 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 유충을 유리 슬라이드로 옮기고 가능한 한 많은 물을 제거하십시오.
3. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 유충에 1.5 % 저 용융 아가 로스 한 방울을 첨가하십시오.
   알림: 유충을 손상시키지 않도록 추가하기 전에 피펫에서 저융점 아가로스를 잠시 식히십시오.
4. 1mL 주사기 바늘을 사용하여 유충의 방향을 지정합니다. 이미징을 시작하기 전에 아가로스가 식고 응고 될 때까지 기다리십시오.
5. Tg(ETvmat2:EGFP) 및 Tg(elavl3:mCherry) 제브라피쉬의 전체 뇌에서 뉴런 영역과 Tg(mpo:EGFP) 제브라피쉬 뇌의 호중구 모집을 형광 실체 현미경으로 관찰하고 사진을 찍습니다( 재료 표 참조).
   참고: 이미징에 사용되는 형광 현미경 설정은 다음과 같습니다. Tg (ETvmat2 : EGFP) 제브라 피쉬 뇌 (여기 파장 : 450-490 nm, 방출 파장 : 500-550 nm, 시각 배율 : 100x); Tg (elavl3 : mCherry) 제브라 피쉬 뇌 (여기 파장 : 541-551 nm, 방출 파장 : 590 nm, 시각 배율 : 100x); Tg (mpo : EFGP) 제브라 피쉬 뇌 (여기 파장 : 450-490 nm, 방출 파장 : 500-550 nm, 시각 배율 : 63x).
6. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 Tg(ETvmat2:EGFP) 제브라피쉬의 Ra 뉴런 영역의 형광 강도와 길이, Tg(elavl3:mCherry) 제브라피쉬 뇌 뉴런의 형광 강도를 측정하고 분석합니다. Tg (mpo : EFGP) 제브라 피쉬의 뇌 영역에있는 호중구를 수동으로 계산합니다.

6. 유전자 발현 마커의 결정

1. LPS 뇌실 주사 후 24 시간에 유전자 발현 마커의 결정을 진행하십시오. 이렇게하려면 제브라 피쉬 유충을 0.02 % 트리카인으로 마취하십시오 (3.2 단계에서 언급 한 바와 같이).
2. 두 개의 1mL 주사기를 사용하여 눈과 난황낭 영역이 없는 유충(그룹당 40마리의 유충)의 머리 부분을 분리합니다(그림 2E).
3. 애벌레 머리 부분에서 RNA를 추출합니다.
   1. RNA 추출을 위해 조직 분쇄기 (재료 표 참조)를 사용하여 5 초 동안 11,000rpm의 회전 속도로 200μL의 RNA 추출 시약 (재료 표 참조)으로 헤드 부분을 균질화합니다.
   2. 클로로포름-이소프로판올 방법을 사용하여 RNA 추출을 수행하십시오. 이렇게 하려면 클로로포름 40μL를 넣고 튜브를 세게 흔든 다음 실온에서 10분 동안 배양합니다. 샘플을 12,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다.
   3. 수성 상을 새로운 튜브 (약 100 μL)로 옮기고 100 μL의 이소프로판올을 첨가하십시오. 10분 동안 배양한 다음 12,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하십시오.
   4. RNA 펠릿을 세척하기 위해 200 μL의 75% 에탄올을 첨가한다. 샘플을 잠시 와동시킨 다음 7500 x g 에서 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 버리고 RNA 펠릿을 다시 세척하십시오.
   5. RNA 펠릿을 5-10분 동안 자연 건조시킨 다음 RNase가 없는 물 30μL를 추가하여 RNA 펠릿을 용해시킵니다. 마이크로볼륨 분광 광도계를 사용하여 순도(260nm 및 280nm에서의 흡광도 비율)와 RNA의 무결성을 확인합니다( 재료 표 참조).
4. 무작위 프라이머와 함께 역전사효소를 사용하여 단계 6.3에서 추출한 RNA로부터 cDNA를 합성합니다( 재료 표 참조).
   1. 1μL의 무작위 프라이머, 1μL의 dNTP, 1μg의 RNA 및 증류수(총 부피 12μL)를 뉴클레아제가 없는 튜브에 추가합니다. 혼합물을 65 분 동안 5 ° C로 가열하고 얼음에서 빠르게 식힌다.
   2. 1μL의 0.1M DTT, 1μL의 RNase 억제제, 4μL의 5× 첫 번째 가닥 완충액 및 1μL의 M-MLV 역전사효소(총 부피: 20μL)를 튜브에 추가합니다. 부드럽게 혼합하고 튜브를 25 ° C에서 2 분 동안 배양 한 다음 42 ° C에서 50 분 동안 배양합니다. 70°C에서 15분 동안 가열하여 반응을 비활성화합니다.
5. 표적 유전자(IL-1β, IL-6 및 TNF-α)의 발현을 확인하기 위해 상용 RT-qPCR 키트(재료 표 참조)를 사용하여 qPCR 시스템(재료 표 참조)에서 실시간 PCR을 수행합니다. 반응 혼합물 (20 μL)은 10 μL의 SYBR 녹색, 0.4 μL의 ROX 기준 염료, 0.8 μL의 정방향 및 역방향 프라이머, 6 μL의_ddH2O, 및 2 μL의 주형 cDNA (1 μg)를 함유하였다. 조건에서 PCR 증폭을 수행하십시오 : 30 초 동안 95 ° C, 5 초 동안 95 ° C, 34 초 동안 60 ° C의 40 사이클, 15 초 동안 95 ° C, 60 초 동안 60 ° C, 15 초 동안 95 ° C의 해리 단계.
6. 표적 유전자의 mRNA 수준을 하우스키핑 유전자인 신장 인자 1 α(Ef1α)의 mRNA 수준으로 정상화합니다. 2-ΔΔCT 방법³³에 의해 각 표적 유전자에 대한 발현 수준을 계산한다. 각 유전자의 프라이머 서열은 표 2에 기재되어 있다.
7. 산화질소의 측정을 위해, 조직 분쇄기를 사용하여 100 μL의 차가운 PBS에서 헤드 부분(단계 6.2에서 수득됨)을 균질화한다. 생성된 PBS 및 헤드부 현탁액을 4°C에서 15분 동안 12,000 x g 에서 원심분리한다. 용해물을 수집하고 시판되는 키트를 사용하여 아질산염 농도 분석⁽³⁴ )을 수행한다( 재료 표 참조).

7. 제브라피쉬 기관차 행동 분석

1. LPS 뇌실 주사 후 24 시간에 제브라 피쉬 유충을 96 웰 정사각형 마이크로 플레이트의 웰로 개별적으로 옮깁니다. 각 웰에 300μL의 E3 배지를 추가한 다음 유충을 4시간 동안 배양하여 테스트 플레이트에 적응시킵니다.
2. 유충이 로딩된 마이크로플레이트를 제브라피쉬 추적 상자로 옮깁니다( 재료 표 참조). 광원을 켠 다음 환경에 적응하기 위해 테스트 상자에서 유충을 30 분 동안 배양하십시오.
3. 자동 비디오 추적 시스템을 사용하여 제브라 피쉬 행동을 모니터링하고 기록합니다. 각 제브라 피쉬에 대해 12 세션 (각 5 분, 총 1 시간)을 기록하십시오. 총 거리(비활성, 소거리 및 장거리로 구성)를 60분 추적 기간 동안 각 물고기가 이동한 거리(mm)로 정의합니다.

8. 통계 분석

1. 표준 분석 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다( 재료 표 참조).
2. 일반 일원 분산 분석을 사용하여 두 그룹 간의 차이에 대한 통계 분석을 수행합니다. Pearson의 상관 계수를 계산하여 상관 계수의 강도를 평가합니다. P < 0.05는 모든 분석에서 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

여기에 설명 된 워크 플로는 제브라 피쉬 유충에서 LPS 매개 신경 염증 및 신경 독성을 유도하기위한 새롭고 빠르고 효율적인 방법론을 제시합니다. 이 설명된 프로토콜에서 5개의 dpf 제브라피쉬에 LPS(그림 1)를 미세 주입기를 사용하여 뇌실에 주입했습니다(그림 2A-C). 뇌실 부위로의 성공적인 주사는 1% Evans blue 염색을 사용하여...

토론

역학 및 실험 데이터의 증가는 만성 세균 및 바이러스 감염을 신경 퇴행성 질환의 가능한 위험 인자로 암시합니다³⁶. 감염은 염증 과정의 활성화와 숙주 면역 반응을 유발합니다³⁷. 반응이 방어 메카니즘으로서 작용하더라도, 과활성화된 염증은 신경 발생에 해롭고, 염증 환경은 신생아 뉴런(³⁸)의 생존을 허용하지 않는다. 결과적으로, 숙주 뉴?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A6361
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond Scientific	3-000-207
Fluorescence stereo microscopes	Leica	M205 FA
GraphPad Prism software	GraphPad Software	Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4	Sigma-Aldrich	L3024
Manual micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904
Mx3005P qPCR system	Agilent Technologies	Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer	Biochrom	80-2140-46
Nitrite concentration assay kit	Beyotime Biotechnology	S0021M
Phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller	World Precision Instruments	PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
Random primers	Takara	3802
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit	Accurate Biology	AG11701
The 3rd Gen Tgrinder	Tiangen	OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm	World Precision Instruments	TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester)	Sigma-Aldrich	A-5040
TRNzol Universal reagent	Tiangen	DP424
Zebrafish tracking box	ViewPoint Behavior Technology