体外研究 研究结膜杯状细胞中基于性别的差异的方法

摘要

在基于性别的差异研究中，无酚红/无胎牛血清培养基是比晚期 RPMI 更好的选择，可在不改变结膜杯状细胞正常功能的情况下消除外源激素。

摘要

干眼症是一种影响眼表健康的多因素疾病，女性的患病率要高得多。结膜杯状细胞 （CGC） 分泌到眼表的凝胶形成粘蛋白被破坏会导致多种眼表疾病。在CGC基于性别的差异的体外研究期间，消除外源性激素对于获得一致的结果至关重要。本文描述了一种在CGCs基于性别的差异研究中最大限度地减少外源性激素存在的方法，同时保持其生理功能。将来自死后人类供体的CGC在含有10%胎牛血清（FBS）（称为完全培养基）的RPMI培养基中从结膜碎片中培养，直至汇合。在实验开始前近48小时，将CGC转移到不含酚红或FBS但含有1%BSA（称为无酚红培养基）的RPMI培养基中。通过使用呋喃 2/乙酰氧基甲基 （AM） 显微镜测量卡巴酚 （Cch， 1 x ^10-4 M） 刺激后细胞内 [Ca 2⁺] （[Ca²⁺]_i） 的增加来研究正常细胞功能。结果表明，CGCs在无酚红培养基中48 h后仍能维持正常功能。在Cch刺激下，无酚红RPMI培养基和完全培养基之间的[Ca²⁺]_i反应没有显著差异。因此，在基于性别的差异研究中，我们推荐使用含有 1% BSA 的不含酚红的 RPMI 培养基来消除外源激素，而不会改变 CGC 的正常功能。

引言

基于性别的差异影响眼表的多个过程 ^1,2,3。这些基于性别的差异的临床表现是男性和女性之间许多眼表疾病患病率的差异，例如干眼症和结膜炎^4,5,6。有证据表明，基于性别的差异源于多个生物学水平，包括 X 和 Y 染色体⁷ 上基因的不同特征以及激素的影响⁸。研究基于性别的差异的分子基础可以更好地了解疾病，并最终改善个性化医疗。

眼表包括覆盖的泪膜、角膜和结膜。在眼表的多个组成部分中观察到基于性别的差异，包括泪膜 9,10、角膜 11、泪腺^12,13 和也分泌泪液的睑板腺¹²。许多机制研究调查了性激素对角膜及其相关成分的影响^14,15;然而，人们对结膜及其杯状细胞的性别差异知之甚少。结膜是覆盖硬膜和眼睑内表面的粘膜。结膜上皮由非角化、多层、分层的鳞状细胞组成¹⁶。

在结膜的分层鳞状细胞中，有散布在上皮顶端表面的杯状细胞（CGC）。这些杯状细胞的特征在于位于顶极¹⁷的大量分泌颗粒。CGCs合成并分泌凝胶形成粘蛋白MUC5AC，以滋润眼表并在眨眼时润滑眼表¹⁷。粘蛋白分泌受到细胞内 [Ca 2+] （[Ca²⁺]i） 和 Ras 依赖性细胞外信号调节激酶 （ERK1/2）¹⁸ 的激活的严格调节。不能分泌粘蛋白会导致眼表干燥和病理异常的后遗症。然而，在发炎的眼表上，炎症介质刺激的大量粘蛋白分泌导致眼睛的粘稠感和瘙痒感¹⁹.这些粘蛋白分泌紊乱的情况最终会导致眼表恶化。

杯状细胞作为眼粘蛋白主要来源的作用早已得到认可²⁰，然而，生理和病理状态下粘蛋白调节的性别差异仍未被发现。体外系统可用于监测杯状细胞的功能，而没有激素效应或精确控制性激素水平。尽管结膜上皮细胞系已经发育了²¹ 种，但没有具有功能性粘蛋白分泌的杯状细胞系可用。因此，我们修改了我们开发的原代人类CGC培养物，以建立一种分析体外性别差异的方法¹⁶，并呈现如下。

研究方案

所有人体组织均经捐献者事先知情同意和授权捐献至眼库，用于科学研究。马萨诸塞州眼耳人类研究委员会审查了人类结膜组织的使用，并确定为豁免，不符合人类受试者研究的定义。

1. 原代人杯状细胞培养

1. 从眼库中，获得人结膜组织¹⁶.
2. 制备培养基，补充有10%胎牛血清（FBS），2mM谷氨酰胺，2mM非必需氨基酸（NEAA），2mM丙酮酸钠，100μg/ mL青霉素 - 链霉素和2mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）的RPMI-1640培养基。
3. 如下所述进行原代细胞培养。
   1. 用无菌手术刀将组织切成 1 mm³ 块，然后接种到培养罩中的培养板上。在 6 孔板的每个孔中接种 4 块，放入 1 mL 完全 RPMI 培养基中。虽然组织片的方向不会影响细胞生长，但要确保片粘附在培养板上，以确保使用手术刀刀片生长。
   2. 将组织块放入含有95%空气和5%CO₂ 的培养箱中，温度为37°C。 每隔一天刷新一次相同的培养基，直到杯状细胞在大约 14 天内达到 70%-80% 汇合度。接种后约72小时取出组织塞。
      注:人结膜上皮主要含有分层的鳞状细胞和杯状细胞。RPMI是杯状细胞的选择性培养基。在人CGC培养物中，成纤维细胞很少在第7天左右生长。纯化培养物的方法在先前的出版物 ²²中进行了描述。
   3. 按照¹⁹中描述的标准IFM方法，使用靶向细胞角蛋白（CK）7和Helix pomatia lectin-1（HPA-1）²²的免疫荧光显微镜（IFM）验证GC培养物的纯度;查看代表性结果。

2.人结膜杯状细胞传代及实验制备

1. 用PBS（pH = 7.4）冲洗细胞，并使用0.05%胰蛋白酶在1x EDTA中分离细胞。在显微镜下每分钟观察一次细胞。一旦细胞从底部分离，使用完全的RPMI培养基使胰蛋白酶失活。
2. 在室温下以150× g 离心细胞5分钟。将细胞沉淀重悬于完全RPMI培养基中，并重新接种到玻璃底培养皿上进行[Ca^{2 + ]} _i 测量。培养基的总体积为每培养皿 300 μL。将介质放在培养皿玻璃部分的中心。
3. 消除培养基中的激素:培养基中可能含有性激素，尤其是FBS。由于RPMI-1640中所含的酚红具有雌激素活性^23,24，因此在制备完全培养基后，用不含酚红的RPMI培养基代替RPMI培养基，并使用pH条将pH调节至7.45。完全培养基中所含的HEPES将pH值保持在相对较小的范围内。

3. 用于 [Ca²⁺]_i 测量的呋喃-2/乙酰氧基甲基 （AM） 测定

1. 如下所述执行 Fura-2/AM 加载。
   1. 将细胞在玻璃底培养皿中在37°C，环境气氛下孵育1小时，并用Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液（KRB;含有119mM NaCl，4.8mM KCl，1.0mM CaCl 2,1.2mM MgSO₄和25mM NaHCO₃）与0.5%HEPES（表1）加0.5%BSA，0.5μMfura-2 / AM， 8μM噗酸F127和250μM磺胺吡喃酮。
   2. 使用前使用 pH 计将 pH 值调节至 7.45。加载呋喃-2 / AM后，在[Ca^{2 + ]} _i 测量之前立即用含有250μM磺胺吡咪酮的KRB洗涤细胞。
2. 如下所述进行 [Ca²⁺]_i 测量。
   1. 将含有装有 fura-2 的细胞的培养皿置于显微镜下，以 200 倍放大倍率定位包含 20 至 50 个细胞的代表性区域，并使用 手绘 功能在每个细胞周围绘制轮廓，以向软件指示什么是背景荧光，什么不是背景荧光。
   2. 等待软件自动从测量中减去背景荧光，然后单击" 开始实验 "按钮。
   3. 然后，等待 8 秒和 15 秒以建立细胞中的基础钙水平，然后小心地移入感兴趣的激动剂。添加激动剂后继续测量至少 120 秒或直到钙水平恢复到基线。
3. 如下所述执行数据分析。
   1. 使用峰值 [Ca²⁺]_i 的变化来表示刺激的作用。从测量的前 8-15 秒计算每个细胞中的平均基础钙水平。如果该数字等于或高于 500 nM，则从数据集中删除该细胞，因为它正在经历细胞凋亡或坏死。
   2. 计算出每个细胞的基础水平后，从同一细胞的最大测量值 [Ca²⁺]_i 中减去该量。平均给定培养皿中所有细胞的峰 [Ca²⁺]_I 变化。
   3. 为确保一致性，将每个刺激的响应记录一式两份，并计算从重复项获得的峰值 [Ca²⁺]_i 变化的平均值，作为单个人类样本的一个数据点。根据研究设计，使用适当的数据分析方法比较不同组的数据。

结果

原代培养物中的人 CGC 在大约 14 天内增长到 80% 汇合度。通过对杯状细胞标志物CK7和HPA-1²⁵ 的抗体进行免疫荧光染色来确认细胞类型（图1）。尽管从培养基中去除FBS可以消除性激素，但缺乏FBS可能会影响细胞反应。为了验证激素消除方法，使用胆碱能激动剂（卡巴胆碱，Cch 1 × ^10-4 M）作为刺激物，以模拟由杯状细胞周围的不同神经末梢介导的生理性...

讨论

研究眼部组织中基于性别的差异有助于了解疾病的过程，尤其是干眼症和过敏性结膜炎，它们不成比例地影响一种性别 ^4,5,6。尽管动物模型可用于这些研究，但由于与体内人类细胞具有最高的相似性，直接从人体组织获得的数据是必不可少的。当前实验环境中使用的结膜组织来自年龄范围为 70-85 岁（绝经后）的已故供?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin with 1x EDTA	Gibco (Grand Island, NY)	25300-054
4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid	Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA)	BP310-500
Advanced RPMI media	Gibco (Grand Island, NY)	12633020
carbachol	Cayman Chemical (Ann Arbor, MI)	144.86
Fetal Bovin Serum	R&D (Minneapolis, MN)	S11150H
Fura-2- acetoxymethyl ester	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	F1221
Human conjunctival tissue	Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI)	N/A
inorganic salt for KRB buffer	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)		Any brand will work
L-glutamine	Lonza Group (Basel, Switzerland)	17-605F
non-essential amino acids	Gibco (Grand Island, NY)	11140-050
penicillin/streptomycin	Gibco (Grand Island, NY)	15140-122
phenol red-free RPMI media	Gibco (Grand Island, NY)	11835055
Pluronic acid F127	MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)	P2443-250G
RPMI-1640 culture medium	Gibco (Grand Island, NY)	21875034
scalpel	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	12460451	Any sterile surgical scalpel can work
sodium pyruvate	Gibco (Grand Island, NY)	11360-070
sulfinpyrazone	MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)	S9509-5G