In vitro Méthode d’étude des différences fondées sur le sexe dans les cellules caliciformes conjonctivales

Résumé

Le milieu sans sérum de veau fœtal sans rouge de phénol est une meilleure option que le RPMI avancé pour éliminer les hormones exogènes sans altérer la fonction normale des cellules caliciformes conjonctivales dans l’étude des différences basées sur le sexe.

Résumé

La sécheresse oculaire est une maladie multifactorielle affectant la santé de la surface oculaire, avec une prévalence profondément plus élevée chez les femmes. La perturbation de la mucine gélifiante qui est sécrétée par les cellules caliciformes conjonctivales (CGC) sur la surface oculaire contribue à de multiples maladies de la surface oculaire. L’élimination des hormones sexuelles exogènes est essentielle pour obtenir des résultats cohérents lors de l’étude in vitro des différences entre les sexes dans les CCG. Cet article décrit une méthode permettant de minimiser la présence d’hormones exogènes dans l’étude des différences fondées sur le sexe dans les CGC tout en maintenant leur fonction physiologique. Des CGC provenant de donneurs humains post-mortem des deux sexes ont été cultivés à partir de morceaux de conjonctive dans un milieu RPMI avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) (appelé milieu complet) jusqu’à la confluence. Près de 48 h avant le début des expériences, les CCG ont été transférés dans un milieu RPMI sans rouge de phénol ni FBS, mais avec 1 % de BSA (appelé milieu sans rouge de phénol). La fonction cellulaire normale a été étudiée en mesurant l’augmentation de la stimulation intracellulaire [Ca²+] ([Ca²⁺]_i) après stimulation par carbachol (Cch, 1 x ^10-4 M) à l’aide de la microscopie fura 2/acétoxyméthyle (AM). Le résultat montre que les CCG ont maintenu un fonctionnement normal dans le milieu sans rouge de phénol après 48 h. Aucune différence significative dans la réponse [Ca²⁺]_i n’a été observée entre le milieu RPMI sans rouge de phénol et le milieu complet lors de la stimulation de Cch. Par conséquent, nous recommandons d’utiliser le milieu RPMI sans phénol avec 1% de BSA pour éliminer les hormones exogènes sans altérer le fonctionnement normal des CGC dans l’étude des différences basées sur le sexe.

Introduction

Les différences fondées sur le sexe affectent de multiples processus de la surface oculaire ^1,2,3. La manifestation clinique de ces différences fondées sur le sexe est la différence de prévalence de nombreuses maladies de la surface oculaire entre les hommes et les femmes, telles que la sécheresse oculaire et la conjonctivite ^4,5,6. Les preuves suggèrent que les différences fondées sur le sexe proviennent de plusieurs niveaux biologiques, y compris les différents profils de gènes sur....

Protocole

Tous les tissus humains ont été donnés à la banque d’yeux avec le consentement éclairé préalable et l’autorisation du donneur pour utilisation dans la recherche scientifique. L’utilisation du tissu conjonctival humain a été examinée par le Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee et a été jugée exemptée et ne répondant pas à la définition de la recherche sur des sujets humains.

1. Culture primaire de cellules caliciformes humaines

1. À partir de la banque d’yeux, prélever du tissu conjonctival humain¹⁶.
2. Préparer le milieu de culture, le milieu de culture RPMI-1640 complété p....

Résultats

Les CCG humains en culture primaire atteignent 80 % de confluence en environ 14 jours. Le type de cellule a été confirmé par coloration par immunofluorescence avec des anticorps dirigés contre les marqueurs cellulaires caliciformes CK7 et HPA-1²⁵ (Figure 1). Même si l’élimination du FBS du milieu peut éliminer les hormones sexuelles, l’absence de FBS pourrait potentiellement affecter la réponse cellulaire. Pour vérifier la méthode d’élimination hormon.......

Discussion

L’étude des différences entre les sexes dans les tissus oculaires aide à comprendre les processus des maladies, en particulier la sécheresse oculaire et la conjonctivite allergique, qui affectent de manière disproportionnée un sexe ^4,5,6. Même si des modèles animaux peuvent être utilisés pour ces études, les données obtenues directement à partir de tissus humains sont essentielles en raison de la plus grande simil.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin with 1x EDTA	Gibco (Grand Island, NY)	25300-054
4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid	Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA)	BP310-500
Advanced RPMI media	Gibco (Grand Island, NY)	12633020
carbachol	Cayman Chemical (Ann Arbor, MI)	144.86
Fetal Bovin Serum	R&D (Minneapolis, MN)	S11150H
Fura-2- acetoxymethyl ester	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	F1221
Human conjunctival tissue	Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI)	N/A
inorganic salt for KRB buffer	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)		Any brand will work
L-glutamine	Lonza Group (Basel, Switzerland)	17-605F
non-essential amino acids	Gibco (Grand Island, NY)	11140-050
penicillin/streptomycin	Gibco (Grand Island, NY)	15140-122
phenol red-free RPMI media	Gibco (Grand Island, NY)	11835055
Pluronic acid F127	MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)	P2443-250G
RPMI-1640 culture medium	Gibco (Grand Island, NY)	21875034
scalpel	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	12460451	Any sterile surgical scalpel can work
sodium pyruvate	Gibco (Grand Island, NY)	11360-070
sulfinpyrazone	MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)	S9509-5G