In vitro Methode zur Untersuchung geschlechtsspezifischer Unterschiede in Bindehautbecherzellen

Zusammenfassung

Phenolrotfreies/fetales Rinderserum-freies Medium ist eine bessere Option als fortschrittliches RPMI, um exogene Hormone zu eliminieren, ohne die normale Funktion der Bindehautbecherzellen bei der Untersuchung von geschlechtsspezifischen Unterschieden zu verändern.

Zusammenfassung

Trockenes Auge ist eine multifaktorielle Erkrankung, die die Gesundheit der Augenoberfläche beeinträchtigt, mit einer deutlich höheren Prävalenz bei Frauen. Die Störung des gelbildenden Mucins, das von Bindehautbecherzellen (CGCs) auf die Augenoberfläche abgesondert wird, trägt zu mehreren Erkrankungen der Augenoberfläche bei. Die Eliminierung exogener Sexualhormone ist unerlässlich, um konsistente Ergebnisse bei der In-vitro-Untersuchung von geschlechtsspezifischen Unterschieden in CGCs zu erhalten. Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Minimierung des Vorhandenseins exogener Hormone bei der Untersuchung geschlechtsspezifischer Unterschiede in CGCs bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer physiologischen Funktion. CGCs von postmortalen menschlichen Spendern beiderlei Geschlechts wurden aus Stücken der Bindehaut in RPMI-Medium mit 10% fötalem Kälberserum (FBS) (als vollständiges Medium bezeichnet) bis zur Konfluenz kultiviert. Knapp 48 Stunden vor Beginn der Versuche wurden CGCs in RPMI-Medium ohne Phenolrot oder FBS, aber mit 1% BSA (als phenolrotfreies Medium bezeichnet) überführt. Die normale zelluläre Funktion wurde untersucht, indem der Anstieg des intrazellulären [Ca 2+] ([Ca²⁺]_i) nach Carbachol-Stimulation (Cch, 1 x ^10-4 M) mittels Fura-2/Acetoxymethyl (AM)-Mikroskopie gemessen wurde. Das Ergebnis zeigt, dass CGCs nach 48 h ihre normale Funktion in den phenolrotfreien Medien aufrechterhielten. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der [Ca²⁺]_i-Reaktion zwischen phenolrotfreiem RPMI-Medium und vollständigem Medium nach Cch-Stimulation beobachtet. Daher empfehlen wir die Verwendung des phenolrotfreien RPMI-Mediums mit 1% BSA, um exogene Hormone zu eliminieren, ohne die normale Funktion von CGCs bei der Untersuchung von geschlechtsspezifischen Unterschieden zu verändern.

Einleitung

Geschlechtsspezifische Unterschiede betreffen mehrere Prozesse der Augenoberfläche ^1,2,3. Die klinische Manifestation dieser geschlechtsspezifischen Unterschiede ist der Unterschied in der Prävalenz vieler Augenoberflächenerkrankungen zwischen Männern und Frauen, wie z. B. trockenes Auge und Bindehautentzündung ^4,5,6. Es gibt Hinweise darauf, dass geschlechtsspezifische Unterschiede auf mehreren biologischen Ebenen entstehen, einschließlich der unterschiedlichen Profile von Genen auf X- und Y-Chromosomen⁷ und der Wirkung von Hormonen⁸. Die Untersuchung der molekularen Grundlagen geschlechtsspezifischer Unterschiede kann zu einem besseren Verständnis von Krankheiten beitragen und letztendlich die personalisierte Medizin verbessern.

Die Augenoberfläche besteht aus dem darüber liegenden Tränenfilm, der Hornhaut und der Bindehaut. Geschlechtsspezifische Unterschiede werden in mehreren Komponenten der Augenoberfläche beobachtet, darunter der Tränenfilm 9,10, die Hornhaut 11, die Tränendrüse ^12,13 und Meibom-Drüsen, die ebenfalls Tränen absondern, ¹². Zahlreiche mechanistische Studien haben die Wirkung von Sexualhormonen auf die Hornhaut und ihre assoziierten Bestandteile untersucht^14,15; Über die geschlechtsspezifischen Unterschiede in der Bindehaut und ihren Becherzellen ist jedoch wenig bekannt. Die Bindehaut ist eine Schleimhaut, die die Sklera und die Innenfläche des Augenlids bedeckt. Das Epithel der Bindehaut besteht aus nicht-keratinisierenden, mehrschichtigen, geschichteten Plattenepithelzellen¹⁶.

Unter den geschichteten Plattenepithelzellen der Bindehaut befinden sich Becherzellen (CGCs), die an der apikalen Oberfläche des Epithels eingestreut sind. Diese Becherzellen zeichnen sich durch die große Anzahl von sekretorischen Granula aus, die sich am apikalen Pol¹⁷ befinden. CGCs synthetisieren und sezernieren das gelbildende Mucin MUC5AC, um die Augenoberfläche zu befeuchten und sie während des Blinzelns zu schmieren¹⁷. Die Mucinsekretion wird durch das intrazelluläre [Ca²+] ([Ca²⁺]_i) und die Aktivierung der Ras-abhängigen extrazellulären signalregulierten Kinase (ERK1/2)¹⁸ stark reguliert. Die Unfähigkeit, Muzin abzusondern, führt zu Trockenheit der Augenoberfläche und zu pathologischen Anomalien. Auf einer entzündeten Augenoberfläche führt jedoch eine durch Entzündungsmediatoren angeregte übermäßige Muzinsekretion zu einer Wahrnehmung von Klebrigkeit und Juckreiz des Auges¹⁹. Diese Zustände mit gestörter Muzinsekretion führen schließlich zu einer Verschlechterung der Augenoberfläche.

Die Rolle von Becherzellen als Hauptquelle für Augenschleim ist seit langem bekannt²⁰, jedoch sind die geschlechtsspezifischen Unterschiede in der Muzinregulation sowohl in physiologischen als auch in pathologischen Zuständen noch unentdeckt. Ein In-vitro-System wäre nützlich, um die Funktion von Becherzellen ohne hormonelle Wirkung oder mit einem genau kontrollierten Spiegel von Sexualhormonen zu überwachen. Obwohl sich eine Bindehautepithelzelllinie entwickelt hat²¹, steht keine Becherzelllinie mit funktioneller Muzinsekretion zur Verfügung. Daher modifizierten wir unsere entwickelte primäre humane CGC-Kultur, um eine Methode zur Analyse des geschlechtsspezifischen Unterschieds in vitro^{zu etablieren 16} und stellen sie wie folgt dar.

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Protokoll

Sämtliches menschliches Gewebe wurde mit vorheriger informierter Zustimmung und Genehmigung des Spenders für die Verwendung in der wissenschaftlichen Forschung an die Augenbank gespendet. Die Verwendung des menschlichen Bindehautgewebes wurde vom Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee überprüft und als ausgenommen eingestuft und nicht der Definition von Forschung mit menschlichen Probanden entsprechend.

1. Primäre menschliche Kelchzellkultur

1. Aus der Augenbank wird menschliches Bindehautgewebe^{entnommen 16}.
2. Bereiten Sie das Nährmedium, RPMI-1640 Nährmedium, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FBS), 2 mM Glutamin, 2 mM nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 2 mM Natriumpyruvat, 100 μg/ml Penicillin-Streptomycin und 2 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) vor.
3. Führen Sie die primäre Zellkultur wie unten beschrieben durch.
   1. Zerkleinern Sie das Gewebe mit einem sterilen Skalpell in 1 mm³ Stücke und säen Sie es auf Kulturplatten in einer Kulturhaube. Säen Sie vier Stücke in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte in 1 ml vollständiges RPMI-Medium. Obwohl die Ausrichtung des Gewebestücks keinen Einfluss auf das Zellwachstum hat, stellen Sie sicher, dass die Stücke an der Kulturplatte haften, um das Wachstum mit der Skalpellklinge zu gewährleisten.
   2. Legen Sie die Gewebestücke in den Inkubator, der 95 % Luft und 5 % CO₂ bei 37 °C enthält. Aktualisieren Sie das gleiche Nährmedium jeden zweiten Tag, bis die Becherzellen in etwa 14 Tagen eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen. Entfernen Sie den Gewebepfropfen ca. 72 h nach der Aussaat.
      HINWEIS: Das menschliche Bindehautepithel enthält hauptsächlich geschichtete Plattenepithelzellen und Becherzellen. RPMI ist ein selektives Medium für Becherzellen. Selten in menschlicher CGC-Kultur können Fibroblasten um den 7. Tag herum wachsen. Das Verfahren zur Reinigung der Kultur wurde in einer früheren Veröffentlichung ²² beschrieben.
   3. Überprüfung der Reinheit der GC-Kultur mittels Immunfluoreszenzmikroskopie (IFM), die auf Zytokeratin (CK)7 und Helix-Pomatia-Lektin-1 (HPA-1)²² abzielt, gemäß der in¹⁹ beschriebenen Standard-IFM-Methode; Siehe repräsentative Ergebnisse.

2. Humane Bindehautkelchzellpassage und experimentelle Vorbereitung

1. Spülen Sie die Zellen mit PBS (pH = 7,4) und lösen Sie die Zellen mit Trypsinisierung unter Verwendung von 0,05% Trypsin in 1x EDTA. Beobachten Sie die Zellen jede Minute unter dem Mikroskop. Sobald sich die Zellen vom Boden lösen, deaktivieren Sie das Trypsin mit vollständigem RPMI-Medium.
2. Die Zellen werden bei 150 × g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Resuspendieren Sie das Zellpellet im vollständigen RPMI-Nährmedium und säen Sie es zur [Ca²⁺]_i-Messung erneut auf Kulturschalen mit Glasboden. Das Gesamtvolumen des Mediums beträgt 300 μL pro Schale. Bewahren Sie das Medium in der Mitte des Glasteils der Schale auf.
3. Ausscheidung von Hormonen in Nährmedien: Das Nährmedium kann Sexualhormone enthalten, insbesondere das FBS. Da das in RPMI-1640 enthaltene Phenolrot die östrogene Aktivität ^23,24 aufweist, ersetzen Sie das RPMI-Medium durch phenolrotfreies RPMI-Medium und stellen Sie den pH-Wert mit pH-Streifen auf 7,45 ein^, nachdem Sie das vollständige Medium hergestellt haben. Das im gesamten Medium enthaltene HEPES hält den pH-Wert in einem relativ kleinen Bereich.

3. Fura-2/Acetoxymethyl (AM)-Assay für die Messung von [Ca2⁺]_i

1. Führen Sie das Laden von Fura-2/AM wie unten beschrieben durch.
   1. Inkubieren Sie die Zellen in Glasbodenschalen für 1 h bei 37 °C Umgebungsatmosphäre und lichtgeschützt mit Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer (KRB; enthält 119 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,0 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4 und 25 mM NaHCO3) mit 0,5 % HEPES (Tabelle 1) plus 0,5 % BSA, 0,5 μM fura-2/_AM, 8 μM Pluronsäure F127 und 250 μM Sulfinpyrazon.
   2. Stellen Sie den pH-Wert vor Gebrauch mit einem pH-Messgerät auf 7,45 ein. Nach dem Beladen mit fura-2/AM werden die Zellen unmittelbar vor der [^Ca2+]_i-Messung mit KRB gewaschen, das 250 μM Sulfinpyrazon enthält.
2. Führen Sie die [Ca²⁺]_i-Messung wie unten beschrieben durch.
   1. Legen Sie die Schalen mit den mit Fura-2 beladenen Zellen unter das Mikroskop, lokalisieren Sie ein repräsentatives Feld, das zwischen 20 und 50 Zellen bei 200-facher Vergrößerung enthält, und verwenden Sie die Freihandfunktion , um einen Umriss um jede Zelle zu zeichnen, um der Software anzuzeigen, was Hintergrundfluoreszenz ist und was nicht.
   2. Warten Sie, bis die Software automatisch die Hintergrundfluoreszenz von der Messung abzieht, und klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment starten .
   3. Warten Sie dann zwischen 8 und 15 Sekunden, um den basalen Kalziumspiegel in den Zellen zu bestimmen, bevor Sie vorsichtig in den interessierenden Agonisten pipettieren. Fahren Sie mit der Messung für mindestens 120 Sekunden nach Zugabe des Agonisten fort oder bis der Kalziumspiegel wieder auf den Ausgangswert zurückgekehrt ist.
3. Führen Sie die Datenanalyse wie unten beschrieben durch.
   1. Verwenden Sie die Änderung des Peaks [Ca²⁺]_i , um die Aktionen der Stimuli darzustellen. Berechnen Sie den mittleren basalen Kalziumspiegel in jeder Zelle aus den ersten 8-15 s der Messungen. Wenn diese Zahl gleich oder größer als 500 nM ist, entfernen Sie diese Zelle aus dem Datensatz, da sie Apoptose oder Nekrose durchläuft.
   2. Sobald der Basalwert jeder Zelle berechnet wurde, subtrahieren Sie diesen Betrag von dem für dieselbe Zelle gemessenen Maximum [Ca²⁺]_i . Mittelwert der Änderung des Peaks [Ca²⁺]_I für alle Zellen in einer bestimmten Schale.
   3. Um die Konsistenz zu gewährleisten, zeichnen Sie die Reaktionen jedes Stimulus in doppelter Ausführung auf und berechnen Sie den Durchschnittswert der Änderungen des Spitzenwerts [Ca²⁺]_i , der aus den Duplikaten als ein Datenpunkt aus der einzelnen menschlichen Probe erhalten wurde. Vergleichen Sie die Daten aus verschiedenen Gruppen mit einer geeigneten Datenanalysemethode, die auf dem Studiendesign basiert.

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Ergebnisse

Humane CGCs in Primärkultur wachsen in etwa 14 Tagen auf 80% Konfluenz. Der Zelltyp wurde durch Immunfluoreszenzfärbung mit Antikörpern gegen die Becherzellmarker CK7 und HPA-1²⁵ bestätigt (Abbildung 1). Auch wenn die Entfernung von FBS aus dem Medium die Sexualhormone eliminieren kann, könnte das Fehlen von FBS möglicherweise die zelluläre Reaktion beeinflussen. Um die Hormoneliminierungsmethode zu verifizieren, wurde ein cholinerger Agonist (Carbachol, Cch 1 ...

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Diskussion

Die Untersuchung der geschlechtsspezifischen Unterschiede im Augengewebe hilft, die Prozesse von Krankheiten zu verstehen, insbesondere des trockenen Auges und der allergischen Bindehautentzündung, von denen ein Geschlecht überproportional betroffen ist ^4,5,6. Auch wenn für diese Studien Tiermodelle verwendet werden können, sind Daten, die direkt aus menschlichem Gewebe gewonnen werden, aufgrund der höchsten Ähnlichkeit mi...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin with 1x EDTA	Gibco (Grand Island, NY)	25300-054
4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid	Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA)	BP310-500
Advanced RPMI media	Gibco (Grand Island, NY)	12633020
carbachol	Cayman Chemical (Ann Arbor, MI)	144.86
Fetal Bovin Serum	R&D (Minneapolis, MN)	S11150H
Fura-2- acetoxymethyl ester	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	F1221
Human conjunctival tissue	Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI)	N/A
inorganic salt for KRB buffer	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)		Any brand will work
L-glutamine	Lonza Group (Basel, Switzerland)	17-605F
non-essential amino acids	Gibco (Grand Island, NY)	11140-050
penicillin/streptomycin	Gibco (Grand Island, NY)	15140-122
phenol red-free RPMI media	Gibco (Grand Island, NY)	11835055
Pluronic acid F127	MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)	P2443-250G
RPMI-1640 culture medium	Gibco (Grand Island, NY)	21875034
scalpel	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	12460451	Any sterile surgical scalpel can work
sodium pyruvate	Gibco (Grand Island, NY)	11360-070
sulfinpyrazone	MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)	S9509-5G