In Vitro Метод изучения половых различий в бокаловидных клетках конъюнктивы

Резюме

Среда, не содержащая фенола красного/фетального бычьего сыворотки, является лучшим вариантом, чем продвинутый RPMI, для элиминации экзогенных гормонов без изменения нормальной функции бокаловидных клеток конъюнктивы при изучении половых различий.

Аннотация

Синдром сухого глаза является многофакторным заболеванием, влияющим на здоровье глазной поверхности, с гораздо более высокой распространенностью среди женщин. Разрушение гелеобразующего муцина, который секретируется бокаловидными клетками конъюнктивы (CGC) на поверхности глаза, способствует возникновению множественных заболеваний глазной поверхности. Элиминация экзогенных половых гормонов имеет важное значение для получения устойчивых результатов при исследовании in vitro половых различий в CGC. В данной работе описан метод минимизации присутствия экзогенных гормонов при изучении половых различий в CGC при сохранении их физиологической функции. CGC от посмертных доноров обоих полов культивировали из кусочков конъюнктивы в среде RPMI с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (называемой полной средой) до слияния. Примерно за 48 ч до начала экспериментов CGC переводили в среду RPMI без фенолового красного или FBS, но с 1% BSA (так называемая среда без фенол-красного). Нормальную клеточную функцию изучали путем измерения увеличения внутриклеточного [Ca2+] ([^Ca2+]_i) после стимуляции карбахолом (Cch, 1 x ^10-4 M) с помощью фура-2/ацетоксиметиловой (AM) микроскопии. Результат показывает, что CGC сохраняли нормальную функцию в средах, не содержащих фенол-красного, через 48 ч. Не было выявлено существенной разницы в ответе [^Ca2+]_i между средой RPMI, не содержащей фенолового красного, и полной средой при стимуляции Cch. Поэтому мы рекомендуем использовать свободную от фенола красную среду RPMI с 1% БСА для элиминации экзогенных гормонов без изменения нормальной функции CGC при исследовании половых различий.

Введение

Половые различия влияют на множественные процессы глазной поверхности ^1,2,3. Клиническим проявлением этих половых различий является разница в распространенности многих заболеваний глазной поверхности у мужчин и женщин, таких как сухость глаз и конъюнктивит ^4,5,6. Фактические данные свидетельствуют о том, что половые различия возникают на нескольких биологических уровнях, включая различные профили генов на X- и Y-хромосомах⁷ и влияние гормонов⁸. Изучение молекулярных основ половых различий может обеспечить лучшее понимание болезней и, в конечном итоге, улучшить персонализированную медицину.

Глазная поверхность состоит из вышележащей слезной пленки, роговицы и конъюнктивы. Половые различия наблюдаются во многих компонентах глазной поверхности, включая слезную пленку 9,10, роговицу 11, слезную железу 12,13 и мейбомиевые железы^, которые также выделяют слезы ¹². В многочисленных механистических исследованиях изучалось влияние половых гормонов на роговицу и связанные с ней компоненты^14,15; Тем не менее, мало что известно о половых различиях в конъюнктиве и ее бокаловидных клетках. Конъюнктива – это слизистая оболочка, которая покрывает склеру и внутреннюю поверхность века. Эпителий конъюнктивы состоит из неороговевающих, многослойных, слоистых плоскоклеточных клеток¹⁶.

Среди многослойных плоскоклеточных клеток конъюнктивы имеются бокаловидные клетки (CGC), вкрапленные на апикальной поверхности эпителия. Эти бокаловидные клетки характеризуются большим количеством секреторных гранул, расположенных на апикальном полюсе¹⁷. CGC синтезируют и секретируют гелеобразующий муцин MUC5AC для увлажнения глазной поверхности и смазывания ее во время моргания¹⁷. Секреция муцина жестко регулируется внутриклеточным [Ca2+] ([^Ca2+]_i) и активацией Ras-зависимой внеклеточной сигнально-регулируемой киназы (ERK1/2)¹⁸. Неспособность выделять муцин приводит к сухости глазной поверхности и последствиям патологических отклонений. Однако на воспаленной глазной поверхности обширная секреция муцина, стимулируемая медиаторами воспаления, приводит к восприятию липкости и зуда в глазах¹⁹. Эти состояния с нарушенной секрецией муцина в конечном итоге приведут к ухудшению состояния глазной поверхности.

Роль бокаловидных клеток как основного источника глазного муцина давно признана²⁰, однако половые различия в регуляции муцина как при физиологических, так и при патологических состояниях остаются неоткрытыми. Система in vitro была бы полезна для мониторинга функции бокаловидных клеток без гормонального эффекта или с точно контролируемым уровнем половых гормонов. Несмотря на то, что сформировалась клеточная линия эпителия конъюнктивы 21, не существует бокаловидной^{клеточной} линии с функциональной секрецией муцина. Таким образом, мы модифицировали разработанную нами первичную культуру CGC человека, чтобы создать метод анализа половых различий in vitro¹⁶, и представили его следующим образом.

протокол

Вся человеческая ткань была передана в глазной банк с предварительного информированного согласия и разрешения донора для использования в научных исследованиях. Использование тканей конъюнктивы человека было рассмотрено Массачусетским комитетом по изучению глаз и ушей и определено как исключенное и не соответствующее определению исследований с участием людей.

1. Первичная культура бокаловидных клеток человека

1. Из банка глаз получить ткань конъюнктивы человека¹⁶.
2. Приготовьте питательную среду, питательную среду RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ глютамина, 2 мМ заменимых аминокислот (NEAA), 2 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл пенициллина-стрептомицина и 2 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинеэтансульфоновой кислоты (HEPES).
3. Проведите первичную клеточную культуру, как описано ниже.
   1. Стерильным скальпелем измельчите ткань на³ кусочка размером 1 мм и выложите семена на культуральные планшеты в колпаке. Высевают по четыре штуки в каждую лунку 6-луночного планшета в 1 мл полной среды RPMI. Несмотря на то, что ориентация кусочка ткани не влияет на рост клеток, убедитесь, что кусочки прилегают к культуральной пластине, чтобы обеспечить рост с помощью лезвия скальпеля.
   2. Поместите кусочки ткани в инкубатор, содержащий 95% воздуха и 5%_CO2 при температуре 37 °C. Обновляйте одну и ту же питательную среду через день до тех пор, пока бокаловидные клетки не достигнут 70%-80% слияния примерно через 14 дней. Снимите тканевую пробку примерно через 72 часа после посева.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эпителий конъюнктивы человека в основном содержит слоистые плоскоклеточные клетки и бокаловидные клетки. RPMI является селективной средой для бокаловиков. В редких случаях в культуре CGC у человека фибробласты могут расти примерно на 7-й день. Способ очистки культуры был описан в предыдущей публикации ²².
   3. Проверяют чистоту культуры ГХ с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии (ИФМ), нацеленной на цитокератин (КФК)7 и лектин Helix pomatia-1 (HPA-1)²² в соответствии со стандартным методом ИФМ, описанным в¹⁹; Смотрите репрезентативные результаты.

2. Пассаж бокаловидных клеток конъюнктивы человека и экспериментальная подготовка

1. Промойте клетки PBS (pH = 7,4) и отделите клетки с помощью трипсинизации с использованием 0,05% трипсина в 1x ЭДТА. Каждую минуту наблюдайте за клетками под микроскопом. После того, как клетки отделятся от дна, деактивируйте трипсин, используя полную среду RPMI.
2. Центрифугируют клетки при 150 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируйте клеточные гранулы в полной питательной среде RPMI и пересадите в чашки для культивирования со стеклянным дном для измерения [Ca²⁺]_i . Общий объем среды составляет 300 мкл на чашку. Держите носитель в центре стеклянной части блюда.
3. Элиминация гормонов в питательных средах: питательная среда может содержать половые гормоны, особенно FBS. Поскольку феноловый краситель, содержащийся в RPMI-1640, обладает эстрогенной активностью ^23,24, замените среду RPMI на среду RPMI, не содержащую фенолового красного, и отрегулируйте pH до ^7,45 с помощью pH-полосок после приготовления полной среды. HEPES, содержащийся в полной среде, поддерживает pH в относительно небольшом диапазоне.

3. Анализ фура-2/ацетоксимил (АМ) для измерения [Ca2⁺]_i

1. Выполните загрузку Fura-2/AM, как описано ниже.
   1. Инкубируют клетки в чашках со стеклянным дном в течение 1 ч при температуре 37 °C, атмосфере окружающей среды и защищают от света бикарбонатным буфером Кребса-Рингера (KRB; содержащий 119 мМ NaCl, 4,8 мМ KCl, 1,0 мМ CaCl 2, 1,2 мМ MgSO4 и 25 мМ NaHCO₃) с 0,5% HEPES (таблица 1), плюс 0,5% БСА, 0,5 мкМ фура-2/AM, 8 мкМ плуроновой кислоты F127 и 250 мкМ сульфинпиразона.
   2. Перед использованием отрегулируйте pH до 7,45 с помощью pH-метра. После загрузки фура-2/AM промыть ячейки KRB, содержащим 250 мкМ сульфинпиразона, непосредственно перед измерением [^Ca2+]_i .
2. Выполните измерение [Ca²⁺]_i , как описано ниже.
   1. Поместите чашки с клетками, загруженными фурой-2, под микроскоп, найдите репрезентативное поле, содержащее от 20 до 50 клеток, при 200-кратном увеличении и используйте функцию Freehand , чтобы нарисовать контур вокруг каждой ячейки, чтобы указать программному обеспечению, что является фоновой флуоресценцией, а что нет.
   2. Подождите, пока программное обеспечение автоматически вычтет фоновую флуоресценцию из измерения, и нажмите кнопку «Начать эксперимент ».
   3. Затем подождите от 8 до 15 с, чтобы установить базальный уровень кальция в клетках, прежде чем осторожно пипетировать интересующий агонист. Продолжайте измерение в течение не менее 120 с после добавления агониста или до тех пор, пока уровень кальция не вернется к исходному уровню.
3. Выполните анализ данных, как описано ниже.
   1. Используйте изменение пика [^Ca2+]_i для представления действия стимулов. Рассчитайте средний базальный уровень кальция в каждой клетке за первые 8-15 секунд измерений. Если это число равно или превышает 500 нМ, удалите эту клетку из набора данных, так как она подвергается апоптозу или некрозу.
   2. После того, как базальный уровень каждой клетки будет рассчитан, вычтите это количество из максимального измеренного значения [^Ca2+]_i для той же клетки. Усредните изменение пика [^Ca2+]_I для всех клеток в данной чашке.
   3. Чтобы обеспечить согласованность, запишите ответы на каждый стимул в двух экземплярах и вычислите среднее значение изменений пика [^Ca2+]_i , полученное из дубликатов, как одну точку данных из индивидуальной выборки человека. Сравните данные из разных групп, используя соответствующий метод анализа данных, основанный на дизайне исследования.

Результаты

CGC человека в первичной культуре вырастают до 80% слияния примерно за 14 дней. Тип клеток подтверждали иммунофлуоресцентным окрашиванием антителами к маркерам бокаловидных клеток CK7 и HPA-1²⁵ (рис. 1). Несмотря на то, что удаление FBS из среды может устранить половые...

Обсуждение

Изучение половых различий в тканях глаза помогает понять процессы заболеваний, особенно синдрома сухого глаза и аллергического конъюнктивита, которые непропорционально поражают один пол ^4,5,6. Несмотря на то, что для этих исследований ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin with 1x EDTA	Gibco (Grand Island, NY)	25300-054
4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid	Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA)	BP310-500
Advanced RPMI media	Gibco (Grand Island, NY)	12633020
carbachol	Cayman Chemical (Ann Arbor, MI)	144.86
Fetal Bovin Serum	R&D (Minneapolis, MN)	S11150H
Fura-2- acetoxymethyl ester	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	F1221
Human conjunctival tissue	Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI)	N/A
inorganic salt for KRB buffer	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)		Any brand will work
L-glutamine	Lonza Group (Basel, Switzerland)	17-605F
non-essential amino acids	Gibco (Grand Island, NY)	11140-050
penicillin/streptomycin	Gibco (Grand Island, NY)	15140-122
phenol red-free RPMI media	Gibco (Grand Island, NY)	11835055
Pluronic acid F127	MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)	P2443-250G
RPMI-1640 culture medium	Gibco (Grand Island, NY)	21875034
scalpel	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	12460451	Any sterile surgical scalpel can work
sodium pyruvate	Gibco (Grand Island, NY)	11360-070
sulfinpyrazone	MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)	S9509-5G