In vitro Metodo per studiare le differenze basate sul sesso nelle cellule caliciformi congiuntivali

Riepilogo

Il terreno privo di fenolo rosso/siero fetale bovino è un'opzione migliore rispetto all'RPMI avanzato per eliminare gli ormoni esogeni senza alterare la normale funzione delle cellule caliciformi congiuntivali nello studio delle differenze basate sul sesso.

Abstract

L'occhio secco è una malattia multifattoriale che colpisce la salute della superficie oculare, con una prevalenza profondamente più elevata nelle donne. La rottura della mucina gelificante secreta dalle cellule caliciformi congiuntivali (CGC) sulla superficie oculare contribuisce a molteplici malattie della superficie oculare. L'eliminazione degli ormoni sessuali esogeni è essenziale per ottenere risultati coerenti durante lo studio in vitro delle differenze basate sul sesso nei CGC. Questo articolo descrive un metodo per ridurre al minimo la presenza di ormoni esogeni nello studio delle differenze basate sul sesso nei CGC mantenendo la loro funzione fisiologica. I CGC di donatori umani post-mortem di entrambi i sessi sono stati coltivati da pezzi della congiuntiva in terreno RPMI con il 10% di siero fetale bovino (FBS) (indicato come il terreno completo) fino alla confluenza. Circa 48 ore prima dell'inizio degli esperimenti, i CGC sono stati trasferiti in un terreno RPMI senza rosso fenolo o FBS ma con l'1% di BSA (indicato come mezzo privo di rosso fenolo). La normale funzione cellulare è stata studiata misurando l'aumento della stimolazione intracellulare [Ca²+] ([Ca²⁺]_i) dopo stimolazione con carbacolo (Cch, 1 x ^10-4 M) utilizzando la microscopia fura 2/acetossimetile (AM). Il risultato mostra che i CGC hanno mantenuto la normale funzione nei terreni privi di rosso fenolo dopo 48 ore. Non è stata osservata alcuna differenza significativa nella risposta [Ca²⁺]_i tra il terreno RPMI privo di rosso fenolo e il terreno completo dopo stimolazione Cch. Pertanto, si consiglia di utilizzare il terreno RPMI privo di rosso fenolo con l'1% di BSA per eliminare gli ormoni esogeni senza alterare la normale funzione dei CGC nello studio delle differenze basate sul sesso.

Introduzione

Le differenze basate sul sesso influenzano molteplici processi della superficie oculare ^1,2,3. La manifestazione clinica di queste differenze basate sul sesso è la differenza nella prevalenza di molte malattie della superficie oculare tra uomini e donne, come l'occhio secco e la congiuntivite ^4,5,6. L'evidenza suggerisce che le differenze basate sul sesso derivano da più livelli biologici, compresi i diversi profili dei geni sui cromosomi X e Y⁷ e gli effetti degli ormoni⁸. Studiare le basi molecolari delle differenze basate sul sesso può fornire una migliore comprensione della malattia e, infine, migliorare la medicina personalizzata.

La superficie oculare comprende il film lacrimale sovrastante, la cornea e la congiuntiva. Le differenze basate sul sesso sono osservate in più componenti della superficie oculare, tra cui il film lacrimale 9,10, la cornea 11, la ghiandola lacrimale ^12,13 e le ghiandole di Meibomio che secernono anche lacrime ¹². Numerosi studi meccanicistici hanno indagato l'effetto degli ormoni sessuali sulla cornea e sui suoi componenti associati^14,15; Tuttavia, si sa poco sulle differenze basate sul sesso nella congiuntiva e nelle sue cellule caliciformi. La congiuntiva è una membrana mucosa che ricopre la sclera e la superficie interna della palpebra. L'epitelio della congiuntiva è costituito da cellule squamose stratificate, multistrato e non cheratinizzanti¹⁶.

Tra le cellule squamose stratificate della congiuntiva, ci sono cellule caliciformi (CGC) sparse sulla superficie apicale dell'epitelio. Queste cellule caliciformi sono caratterizzate dal gran numero di granuli secretori situati al polo apicale¹⁷. I CGC sintetizzano e secernono la mucina gelificante MUC5AC per idratare la superficie oculare e lubrificarla durante il battito delle palpebre¹⁷. La secrezione di mucina è strettamente regolata dalla [Ca 2+] intracellulare ([Ca²⁺]i) e dall'attivazione della chinasi regolata dal segnale extracellulare Ras-dipendente (ERK1/2)¹⁸. L'incapacità di secernere mucina provoca secchezza della superficie oculare e sequele di anomalie patologiche. Su una superficie oculare infiammata, tuttavia, un'estesa secrezione di mucina stimolata da mediatori dell'infiammazione porta a una percezione di viscosità e prurito dell'occhio¹⁹. Queste condizioni con una secrezione di mucina disturbata alla fine porteranno al deterioramento della superficie oculare.

Il ruolo delle cellule caliciformi come principale fonte di mucina oculare è stato a lungo riconosciuto²⁰, tuttavia, le differenze basate sul sesso nella regolazione della mucina sia negli stati fisiologici che patologici rimangono sconosciute. Un sistema in vitro sarebbe utile per monitorare la funzione delle cellule caliciformi senza l'effetto ormonale o con un livello di ormoni sessuali controllato con precisione. Anche se una linea cellulare epiteliale congiuntivale ha sviluppato²¹, non esiste una linea cellulare a calici con secrezione funzionale di mucina. Pertanto, abbiamo modificato la nostra coltura CGC umana primaria sviluppata per stabilire un metodo per analizzare la differenza basata sul sesso in vitro¹⁶ e presentarla come di seguito.

Protocollo

Tutti i tessuti umani sono stati donati alla banca degli occhi con il previo consenso informato e l'autorizzazione del donatore per l'uso nella ricerca scientifica. L'uso del tessuto congiuntivale umano è stato esaminato dal Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee ed è risultato esente e non conforme alla definizione di ricerca con soggetti umani.

1. Colture primarie di cellule di calici umani

1. Dalla banca degli occhi, ricavare il tessuto congiuntivale umano¹⁶.
2. Preparare il terreno di coltura, il terreno di coltura RPMI-1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM di glutammina, 2 mM di aminoacidi non essenziali (NEAA), 2 mM di piruvato di sodio, 100 μg/mL di penicillina-streptomicina e 2 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES).
3. Eseguire la coltura cellulare primaria come descritto di seguito.
   1. Tritare il tessuto in³ pezzi di 1 mm con un bisturi sterile e seminare su piastre di coltura in un cappuccio di coltura. Seminare quattro pezzi in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, in 1 mL di terreno RPMI completo. Sebbene l'orientamento del pezzo di tessuto non influisca sulla crescita cellulare, assicurarsi che i pezzi aderiscano alla piastra di coltura per garantire la crescita utilizzando la lama del bisturi.
   2. Introdurre i pezzi di tessuto nell'incubatrice contenente il 95% di aria e il 5% di CO₂ a 37 °C. Rinfrescare lo stesso terreno di coltura ogni due giorni fino a quando le cellule caliciformi raggiungono il 70%-80% di confluenza in circa 14 giorni. Rimuovere il tappo di tessuto circa 72 ore dopo la semina.
      NOTA: L'epitelio congiuntivale umano contiene principalmente cellule squamose stratificate e cellule caliciformi. L'RPMI è un terreno selettivo per le cellule caliciformi. Raramente nella coltura umana di CGC, i fibroblasti possono crescere intorno al giorno 7. Il metodo per purificare la coltura è stato descritto in una precedente pubblicazione ²².
   3. Verificare la purezza della coltura GC utilizzando la microscopia a immunofluorescenza (IFM) mirata alla citocheratina (CK)7 e alla lectina-1 Helix pomatia (HPA-1)²² seguendo il metodo IFM standard descritto in¹⁹; Vedere i risultati rappresentativi.

2. Passaggio delle cellule caliciformi congiuntivali umane e preparazione sperimentale

1. Sciacquare le cellule con PBS (pH = 7,4) e staccare le cellule con tripsinizzazione utilizzando tripsina allo 0,05% in 1x EDTA. Osserva le cellule ogni minuto al microscopio. Una volta che le cellule si staccano dal fondo, disattiva la tripsina utilizzando un terreno RPMI completo.
2. Centrifugare le cellule a 150 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet cellulare nel terreno di coltura RPMI completo e riseminare su piastre di coltura con fondo di vetro per la misurazione [Ca²⁺]_i . Il volume totale del terreno è di 300 μL per piatto. Tenere il supporto al centro della parte in vetro del piatto.
3. Eliminazione degli ormoni nei terreni di coltura: il terreno di coltura può contenere ormoni sessuali, in particolare l'FBS. Poiché il rosso fenolo contenuto in RPMI-1640 ha attività estrogenica ^23,24, sostituire il mezzo RPMI con un terreno RPMI privo di rosso fenolo e regolare il pH a ^7,45 utilizzando strisce di pH dopo aver preparato il terreno completo. L'HEPES contenuto nel terreno completo mantiene il pH in un intervallo relativamente piccolo.

3. Saggio di fura-2/acetossimetile (AM) per la misurazione di [Ca²⁺]_i

1. Eseguire il caricamento di Fura-2/AM come descritto di seguito.
   1. Incubare le cellule in piastre con fondo di vetro per 1 ora a 37 °C, in atmosfera ambiente e al riparo dalla luce con tampone di bicarbonato Krebs-Ringer (KRB; contenente 119 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,0 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO₄ e 25 mM NaHCO₃) con 0,5% HEPES (Tabella 1), più 0,5% BSA, 0,5 μM fura-2/AM, 8 μM di acido pluronico F127 e 250 μM di sulfinpirazone.
   2. Regolare il pH a 7,45 utilizzando un pHmetro prima dell'uso. Dopo il caricamento con fura-2/AM, lavare le celle con KRB contenente 250 μM sulfinpirazone immediatamente prima della misurazione [Ca²⁺]_i .
2. Eseguire la misurazione [Ca²⁺]_i come descritto di seguito.
   1. Posizionare le piastre contenenti le cellule caricate con fura-2 sotto il microscopio, individuare un campo rappresentativo contenente tra 20 e 50 cellule con un ingrandimento di 200x e utilizzare la funzione Freehand per disegnare un contorno attorno a ciascuna cella per indicare al software cosa è e cosa non è fluorescenza di fondo.
   2. Attendi che il software sottragga automaticamente la fluorescenza di fondo dalla misurazione e fai clic sul pulsante Avvia esperimento .
   3. Quindi, attendere tra 8 e 15 secondi per stabilire i livelli basali di calcio nelle cellule prima di pipettare con cura l'agonista di interesse. Continuare a misurare per almeno 120 secondi dopo l'aggiunta dell'agonista o fino a quando i livelli di calcio non sono tornati al basale.
3. Eseguire l'analisi dei dati come descritto di seguito.
   1. Usa la variazione del picco [Ca²⁺]_i per rappresentare le azioni degli stimoli. Calcolare il livello basale medio di calcio in ogni cellula dai primi 8-15 secondi di misurazioni. Se tale numero è uguale o superiore a 500 nM, rimuovere la cella dal set di dati in quanto è in fase di apoptosi o necrosi.
   2. Una volta calcolato il livello basale di ciascuna cella, sottrarre tale quantità dal massimo misurato [Ca²⁺]_i per la stessa cella. Calcola la media della variazione del picco [Ca²⁺]_I per tutte le cellule in un dato piatto.
   3. Per garantire la coerenza, registrare le risposte di ogni stimolo in duplicato e calcolare il valore medio delle variazioni del picco [Ca²⁺]_i ottenute dai duplicati come un punto dati dal singolo campione umano. Confrontare i dati provenienti da diversi gruppi utilizzando un metodo di analisi dei dati appropriato basato sul disegno dello studio.

Risultati

I CGC umani nella coltura primaria crescono fino all'80% di confluenza in circa 14 giorni. Il tipo di cellula è stato confermato mediante colorazione in immunofluorescenza con anticorpi contro i marcatori delle cellule caliciformi CK7 e HPA-1²⁵ (Figura 1). Anche se la rimozione di FBS dal mezzo può eliminare gli ormoni sessuali, la mancanza di FBS potrebbe potenzialmente influenzare la risposta cellulare. Per verificare il metodo di eliminazione ormonale, è stato u...

Discussione

Studiare le differenze basate sul sesso nei tessuti oculari aiuta a comprendere i processi delle malattie, in particolare l'occhio secco e la congiuntivite allergica, che colpiscono in modo sproporzionato un sesso ^4,5,6. Anche se i modelli animali possono essere utilizzati per questi studi, i dati ottenuti direttamente dal tessuto umano sono essenziali a causa della massima somiglianza con le cellule umane in vivo. I te...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin with 1x EDTA	Gibco (Grand Island, NY)	25300-054
4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid	Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA)	BP310-500
Advanced RPMI media	Gibco (Grand Island, NY)	12633020
carbachol	Cayman Chemical (Ann Arbor, MI)	144.86
Fetal Bovin Serum	R&D (Minneapolis, MN)	S11150H
Fura-2- acetoxymethyl ester	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	F1221
Human conjunctival tissue	Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI)	N/A
inorganic salt for KRB buffer	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)		Any brand will work
L-glutamine	Lonza Group (Basel, Switzerland)	17-605F
non-essential amino acids	Gibco (Grand Island, NY)	11140-050
penicillin/streptomycin	Gibco (Grand Island, NY)	15140-122
phenol red-free RPMI media	Gibco (Grand Island, NY)	11835055
Pluronic acid F127	MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)	P2443-250G
RPMI-1640 culture medium	Gibco (Grand Island, NY)	21875034
scalpel	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	12460451	Any sterile surgical scalpel can work
sodium pyruvate	Gibco (Grand Island, NY)	11360-070
sulfinpyrazone	MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)	S9509-5G