In Vitro Konjonktival Goblet Hücrelerinde Cinsiyete Dayalı Farklılıkları İnceleme Yöntemi

Özet

Fenol kırmızısı içermeyen/fetal sığır serumu içermeyen ortam, cinsiyete dayalı farklılıkların incelenmesinde konjonktival goblet hücrelerinin normal işlevini değiştirmeden eksojen hormonları ortadan kaldırmak için gelişmiş RPMI'den daha iyi bir seçenektir.

Özet

Kuru göz, oküler yüzey sağlığını etkileyen çok faktörlü bir hastalıktır ve kadınlarda görülme sıklığı çok yüksektir. Konjonktival goblet hücreleri (CGC'ler) tarafından oküler yüzeye salgılanan jel oluşturan müsinin bozulması, çoklu oküler yüzey hastalıklarına katkıda bulunur. Ekzojen seks hormonlarının eliminasyonu, CGC'lerdeki cinsiyete dayalı farklılıkların in vitro çalışması sırasında tutarlı sonuçlar elde etmek için gereklidir. Bu makale, fizyolojik işlevlerini korurken CGC'lerdeki cinsiyete dayalı farklılıkların incelenmesinde eksojen hormonların varlığını en aza indirmek için bir yöntemi açıklamaktadır. Her iki cinsiyetten postmortem insan donörlerinden alınan CGC'ler, RPMI ortamındaki konjonktiva parçalarından% 10 fetal sığır serumu (FBS) (tam ortam olarak adlandırılır) ile birleşene kadar kültürlendi. Deneylerin başlamasından yaklaşık 48 saat önce, CGC'ler fenol kırmızısı veya FBS olmadan,% 1 BSA (fenol-kırmızı içermeyen ortam olarak adlandırılır) ile RPMI ortamına aktarıldı. Normal hücresel fonksiyon, fura 2 / asetoksimetil () mikroskobu kullanılarak karbakol (Cch, 1 x ^10-4 M) stimülasyonundan sonra hücre içi [Ca 2⁺] ([Ca^{2 +}] _i) artışı ölçülerek incelenmiştir. Sonuç, CGC'lerin 48 saat sonra fenol kırmızısı içermeyen ortamda normal işlevini sürdürdüğünü göstermektedir. Cch stimülasyonu üzerine fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamı ile tam ortam arasında [^Ca2+] _i yanıtında anlamlı bir fark gözlenmedi. Bu nedenle, cinsiyete dayalı farklılıkların incelenmesinde CGC'lerin normal işlevini değiştirmeden eksojen hormonları ortadan kaldırmak için% 1 BSA ile fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamının kullanılmasını öneririz.

Giriş

Cinsiyete dayalı farklılıklar oküler yüzeyin çoklu süreçlerini etkiler ^1,2,3. Bu cinsiyete dayalı farklılıkların klinik tezahürü, kuru göz ve konjonktivit gibi birçok oküler yüzey hastalığının erkekler ve kadınlar arasındaki prevalansındaki farklılıktır ^4,5,6. Kanıtlar, cinsiyete dayalı farklılıkların, X ve Y kromozomları⁷ üzerindeki farklı gen profilleri ve hormonların⁸ etkileri dahil olmak üzere çoklu biyolojik seviyelerden kaynaklandığını göstermektedir. Cinsiyete dayalı farklılıkların moleküler temelini incelemek, hastalığın daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir ve nihayetinde kişiselleştirilmiş tıbbı geliştirebilir.

Oküler yüzey, üstteki gözyaşı filmi, kornea ve konjonktivadan oluşur. Gözyaşı filmi 9,10, kornea¹¹, gözyaşı bezi ^12,13 ve gözyaşı salgılayan meibomian bezleri ¹² dahil olmak üzere oküler yüzeyin birçok bileşeninde cinsiyete dayalı farklılıklar gözlenir. Çok sayıda mekanik çalışma, seks hormonlarının kornea ve ilişkili bileşenleri üzerindeki etkisini araştırmıştır^14,15; Bununla birlikte, konjonktiva ve kadeh hücrelerindeki cinsiyete dayalı farklılıklar hakkında çok az şey bilinmektedir. Konjonktiva, sklerayı ve göz kapağının iç yüzeyini kaplayan bir mukoza zarıdır. Konjonktiva epiteli, keratinize olmayan, çok katmanlı, tabakalı skuamöz hücrelerden^{oluşur 16}.

Konjonktivanın tabakalı skuamöz hücreleri arasında, epitelin apikal yüzeyine serpiştirilmiş goblet hücreleri (CGC'ler) vardır. Bu goblet hücreleri, apikal kutup^17'de bulunan çok sayıda salgı granülü ile karakterize edilir. CGC'ler, oküler yüzeyi nemlendirmek ve yanıp sönme sırasında yağlamak için jel oluşturan müsin MUC5AC'yi sentezler ve salgılar¹⁷. Müsin sekresyonu, hücre içi [Ca 2 +] ([Ca 2⁺] _i) ve Ras'a bağımlı hücre dışı sinyal regüle kinazın (ERK1 /²) aktivasyonu tarafından sıkı bir şekilde ^{düzenlenir18}. Müsin salgılanamaması, oküler yüzeyin kuruluğuna ve patolojik anormalliklerin sekellerine neden olur. Bununla birlikte, iltihaplı bir oküler yüzeyde, enflamatuar mediatörler tarafından uyarılan geniş müsin salgısı, gözün yapışkanlığı ve kaşıntısı algısına yol açar¹⁹. Müsin salgısının bozulduğu bu koşullar sonunda oküler yüzeyin bozulmasına yol açacaktır.

Goblet hücrelerinin oküler müsinin ana kaynağı olarak rolü uzun zamandır bilinmektedir²⁰, ancak hem fizyolojik hem de patolojik durumlarda müsin regülasyonundaki cinsiyete dayalı farklılıklar keşfedilmemiştir. Bir in vitro sistem, kadeh hücrelerinin işlevini hormonal etki olmadan veya hassas bir şekilde kontrol edilen bir seks hormonu seviyesiyle izlemek için yararlı olacaktır. Konjonktival epitel hücre hattı²¹ gelişmiş olmasına rağmen, fonksiyonel müsin sekresyonu olan goblet hücre hattı mevcut değildir. Bu nedenle, in vitro^16'da cinsiyete dayalı farkı analiz etmek için bir yöntem oluşturmak için geliştirdiğimiz birincil insan CGC kültürümüzü değiştirdik ve aşağıdaki gibi sunduk.

Protokol

Tüm insan dokusu, bilimsel araştırmalarda kullanılmak üzere bağışçının önceden bilgilendirilmiş onayı ve izni ile göz bankasına bağışlandı. İnsan konjonktival dokusunun kullanımı Massachusetts Göz ve Kulak İnsan Çalışmaları Komitesi tarafından gözden geçirildi ve muaf olduğu ve insan deneklerle yapılan araştırma tanımına uymadığı belirlendi.

1. Birincil insan kadeh hücre kültürü

1. Göz bankasından insan konjonktival dokusu^{elde edin 16}.
2. % 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM glutamin, 2 mM esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 2 mM sodyum piruvat, 100 μg / mL penisilin-streptomisin ve 2 mM 4- (2-hidroksietil) -1- piperazineetansülfonik asit (HEPES) ile desteklenmiş kültür ortamı, RPMI-1640 kültür ortamını hazırlayın.
3. Birincil hücre kültürünü aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
   1. Dokuyu steril bir neşter ile^{1 mm 3} parçaya bölün ve bir kültür başlığındaki kültür plakalarına tohumlayın. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dört parça tohumlayın, 1 mL tam RPMI ortamında. Doku parçasının oryantasyonu hücre büyümesini etkilemese de, neşter bıçağını kullanarak büyümeyi sağlamak için parçaların kültür plakasına yapıştığından emin olun.
   2. Doku parçalarını 37 °C'de %95 hava ve %5_CO2 içeren inkübatöre yerleştirin. Goblet hücreleri yaklaşık 14 gün içinde% 70 -% 80 birleşmeye ulaşana kadar aynı kültür ortamını her iki günde bir yenileyin. Tohumlamadan yaklaşık 72 saat sonra doku tıkacını çıkarın.
      NOT: İnsan konjonktival epiteli esas olarak tabakalı skuamöz hücreler ve goblet hücreleri içerir. RPMI, goblet hücreleri için seçici bir ortamdır. Nadiren insan CGC kültüründe, fibroblastlar 7. gün civarında büyüyebilir. Kültürü saflaştırma yöntemi önceki bir yayında ^{açıklanmıştır 22}.
   3. Sitokeratin (CK)7 ve Helix pomatia lektin-1 (HPA-1)^22'yi hedefleyen immünofloresan mikroskobu (IFM) kullanarak GC kültürünün saflığını,^19'da açıklanan standart IFM yöntemini izleyerek doğrulayın; Temsili sonuçlara bakın.

2. İnsan konjonktival goblet hücre geçişi ve deneysel hazırlık

1. Hücreleri PBS (pH = 7.4) ile durulayın ve 1x EDTA'da% 0.05 tripsin kullanarak hücreleri tripsinizasyon ile ayırın. Hücreleri her dakika mikroskop altında gözlemleyin. Hücreler alttan ayrıldıktan sonra, tam RPMI ortamını kullanarak tripsini devre dışı bırakın.
2. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 150 × g'da santrifüjleyin. Hücre peletini tam RPMI kültür ortamında yeniden süspanse edin ve [Ca^{2 +}] _i ölçümü için cam tabanlı kültür kaplarına yeniden tohumlayın. Ortamın toplam hacmi çanak başına 300 μL'dir. Ortamı yemeğin cam kısmının ortasında tutun.
3. Kültür ortamındaki hormonların eliminasyonu: Kültür ortamı, özellikle FBS olmak üzere seks hormonları içerebilir. RPMI-1640'ta bulunan fenol kırmızısı östrojenik aktiviteye ^23,24 sahip olduğundan^, RPMI ortamını fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamıyla değiştirin ve tüm ortamı hazırladıktan sonra pH şeritleri kullanarak pH'ı 7.45'e ayarlayın. Komple ortamda bulunan HEPES, pH'ı nispeten küçük bir aralıkta tutar.

3. [^Ca2+]_i ölçümü için fura-2/asetoksimetil () testi

1. Fura-2/yüklemesini aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
   1. Hücreleri cam alt tabaklarda 37 ° C'de, ortam atmosferinde 1 saat inkübe edin ve Krebs-Ringer bikarbonat tamponu (KRB; 119 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.0 mM CaCl 2, 1.2 mM_MgSO4 ve 25 mM NaHCO₃ içeren) ile ışıktan korunarak %0.5 HEPES (Tablo 1) artı %0.5 BSA, 0.5 μM fura-2/, 8 μM pluronik asit F127 ve 250 μM sülfinpirazon.
   2. Kullanmadan önce bir pH metre kullanarak pH'ı 7.45'e ayarlayın. Fura-2/ile yükledikten sonra, hücreleri [Ca 2+]_i ölçümünden hemen önce²⁵⁰ μM sülfinpirazon içeren KRB ile yıkayın.
2. Aşağıda açıklandığı gibi [Ca²⁺]_i ölçümü gerçekleştirin.
   1. Fura-2 yüklü hücreleri içeren tabakları mikroskop altına yerleştirin, 20x büyütmede 20 hücre ile 50 hücre arasında temsili bir alan bulun ve yazılıma arka plan floresansının ne olduğunu ve ne olmadığını belirtmek için her hücrenin etrafına bir taslak çizmek için Freehand işlevini kullanın.
   2. Yazılımın arka plan floresansını ölçümden otomatik olarak çıkarmasını bekleyin ve Deneyi Başlat düğmesine tıklayın.
   3. Ardından, ilgilenilen agonisti dikkatlice pipetlemeden önce hücrelerdeki bazal kalsiyum seviyelerini belirlemek için 8 saniye ile 15 saniye arasında bekleyin. Agonisti ekledikten sonra veya kalsiyum seviyeleri taban çizgisine dönene kadar en az 120 saniye boyunca ölçmeye devam edin.
3. Aşağıda açıklandığı gibi veri analizi gerçekleştirin.
   1. Uyaranların eylemlerini temsil etmek için tepe [Ca²⁺]_i'deki değişikliği kullanın. Ölçümlerin ilk 8-15 saniyesinden itibaren her hücredeki ortalama bazal kalsiyum seviyesini hesaplayın. Bu sayı 500 nM'ye eşit veya üzerindeyse, apoptoz veya nekroz geçiren bu hücreyi veri kümesinden çıkarın.
   2. Her hücrenin bazal seviyesi hesaplandıktan sonra, bu miktarı aynı hücre için ölçülen maksimum [Ca^{2 +}] _i'den çıkarın. Belirli bir tabaktaki tüm hücreler için tepe [Ca²⁺] _I'deki değişimin ortalamasını alın.
   3. Tutarlılığı sağlamak için, her bir uyaranın yanıtlarını iki kopya olarak kaydedin ve kopyalardan elde edilen tepe [Ca^{2 +}] _i'deki değişikliklerin ortalama değerini, bireysel insan örneğinden tek bir veri noktası olarak hesaplayın. Çalışma tasarımına dayalı olarak uygun bir veri analizi yöntemi kullanarak farklı gruplardan elde edilen verileri karşılaştırın.

Sonuçlar

Birincil kültürdeki insan CGC'leri yaklaşık 14 gün içinde %80 birleşmeye ulaşır. Hücre tipi, goblet hücre belirteçleri CK7 ve^{HPA-1 25'e} karşı antikorlarla immünofloresan boyama ile doğrulandı (Şekil 1). FBS'nin ortamdan çıkarılması seks hormonlarını ortadan kaldırabilse de, FBS eksikliği potansiyel olarak hücresel yanıtı etkileyebilir. Hormon eliminasyon yöntemini doğrulamak için, goblet hücrelerini çevreleyen farklı sinir uçların?...

Tartışmalar

Oküler dokulardaki cinsiyete dayalı farklılıkların araştırılması, bir cinsiyeti orantısız bir şekilde etkileyen hastalıkların, özellikle kuru göz ve alerjik konjonktivitin süreçlerini anlamaya yardımcı olur ^4,5,6. Bu çalışmalar için hayvan modelleri kullanılabilse de, doğrudan insan dokusundan elde edilen veriler, in vivo insan hücrelerine en yüksek benzerlik nedeniyle önemlidir. Mevcut dene...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin with 1x EDTA	Gibco (Grand Island, NY)	25300-054
4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid	Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA)	BP310-500
Advanced RPMI media	Gibco (Grand Island, NY)	12633020
carbachol	Cayman Chemical (Ann Arbor, MI)	144.86
Fetal Bovin Serum	R&D (Minneapolis, MN)	S11150H
Fura-2- acetoxymethyl ester	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	F1221
Human conjunctival tissue	Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI)	N/A
inorganic salt for KRB buffer	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)		Any brand will work
L-glutamine	Lonza Group (Basel, Switzerland)	17-605F
non-essential amino acids	Gibco (Grand Island, NY)	11140-050
penicillin/streptomycin	Gibco (Grand Island, NY)	15140-122
phenol red-free RPMI media	Gibco (Grand Island, NY)	11835055
Pluronic acid F127	MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)	P2443-250G
RPMI-1640 culture medium	Gibco (Grand Island, NY)	21875034
scalpel	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	12460451	Any sterile surgical scalpel can work
sodium pyruvate	Gibco (Grand Island, NY)	11360-070
sulfinpyrazone	MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)	S9509-5G