一种在蜱细胞系中用荧光蛋白表达穿梭载体转化立 克次 体属的电穿孔方法

摘要

电穿孔是一种快速、广泛采用的方法，用于将外源性 DNA 引入 立克次体属。该协议为立 克次体属中专性细胞内细菌的转化提供了一种有用的电穿孔方法。

摘要

立克次体病是由属于 立克次体 属的各种专性细胞内细菌引起的，这些细菌可以通过受感染的节肢动物媒介的叮咬传播给脊椎动物宿主。迄今为止，由于诊断困难，新出现或重新出现的流行性立克次体病仍然是一个公共卫生风险，因为诊断方法有限，没有标准化或普遍可及。由于缺乏对体征和症状的认识而导致的误诊可能导致抗生素治疗延迟和不良的健康结局。全面了解 立克次 体的特征最终将改善临床诊断、评估和治疗，改善疾病的控制和预防。

立克次体基因的功能研究对于理解其在发病机制中的作用至关重要。本文描述了使用穿梭载体pRAM18dSFA电穿孔帕氏立克次氏立 克次 氏菌株泰特地狱的程序，以及用抗生素（大观霉素和链霉素）在蜱细胞培养中选择转化的 帕氏立 克次体菌落的程序。还描述了一种使用共聚焦免疫荧光显微镜定位蜱细胞中转化的 R. parkeri 的方法，这是一种检查载体细胞系转化的有用技术。类似的方法也适用于其他立克次体的转化。

引言

立克次体病是由属于立克次体属（立克次体科，立 克次 体目）的各种专性细胞内细菌引起的。 立克次 体属根据系统发育特征^1，2 分为四大类:斑疹热组 （SFG），其中包含导致最严重和致命的蜱传立克次体病的立克次体（例如，立克次氏体，落基山斑疹热的病原体 ）、 斑疹伤寒组（TG，例如， 普罗瓦泽基立克次体，流行性斑疹伤寒的病原体）， 过渡组（TRG，例如费利立 克次体，跳蚤传播斑疹热的病原体）和祖先组（AG，例如 贝氏立克次体）。

在已知最古老的媒介传播疾病中，立克次体病主要是在病原体通过受感染的节肢动物媒介（包括蜱、跳蚤、虱子和螨虫）叮咬传播病原体后获得^的3^，4。尽管有效抗生素的发现改善了治疗结果，但新出现和重新出现的流行立克次体病继续挑战传统的预防和控制策略。因此，全面了解立克次体/宿主/媒介相互作用最终将为开发预防和治疗这些古老疾病的新方法奠定坚实的基础。

在自然界中，细菌中的水平基因转移（HGT）通过偶联，转导^{和转化发生}5。体外细菌转化利用这些HGT概念，尽管立克次体的细胞内性质提出了一些挑战。不同种类立克次体中受限的生长条件和对共轭和转导系统知之甚少，阻碍了立克次体⁶，^7，8中结合和转导方法的应用。与其他专性细胞内细菌属（例如衣原体、柯克斯体、无形体和埃立克体）相比，立克次体属在细胞质内的生长和复制策略方面有所不同，由于其独特的^{生活方式特征，}这对立克次体的遗传修饰提出了特定的挑战9。

在尝试对立克次体进行基因改造时，要克服的最初障碍是实现成功的转化。因此，设计一种具有高转化效率的可行方法对于开发立克次体遗传工具具有极其有价值的价值。在这里，我们专注于电穿孔，这是一种被广泛认可的转化方法，已被用于将外源性DNA成功引入几种立克次体，包括普罗瓦泽氏立克次体，伤寒立克次氏体，圆锥立克次氏体，帕氏立克次氏体，蒙坦立克次氏体，贝氏立克次体，孔雀立克次体和布氏立克次体10，^11，12，¹³，¹⁴，^15，16.

本文描述了一种电穿孔帕 克利 菌株泰特地狱（加入:GCA_000965145.1）的程序，其穿梭载体pRAM18dSFA源自弱 细胞立克次氏立克次氏 菌株AaR/SC质粒pRAM18，该梭载体被工程化以编码mKATE（一种远红荧光蛋白）和 aadA，赋予壮观霉素和链霉素抗性^13，15，20。转化的 R. parkeri 在蜱细胞系的抗生素选择下是可行的，并且稳定地维持。此外，我们表明，通过共聚焦显微镜在活蜱细胞中转化的 R. parkeri 的定位可用于评估载体细胞系中转化率的质量。

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研究方案

1. 从蜱细胞培养物中繁殖和纯化帕氏螨

注意:所有细胞培养程序均应在II类生物安全柜中进行。

1. 准备 R. parkeri-受感染的蜱细胞
   1. 在 34 °C 的 5 mL L15C300 培养基¹⁷ 中的 25 cm² 细胞培养瓶中培养 ISE6 细胞，并补充有 5% 胎牛血清 （FBS）、5% 色糖磷酸盐肉汤 （TPB） 和 0.1% 脂蛋白浓缩物 （LPC）。
      注意:ISE6（肩突硬蜱胚胎来源细胞系）是许多实验室广泛使用的蜱细胞系，因此是研究蜱 - 病原体相互作用的基本模型¹⁷，^18，19。ISE6细胞的生长速度比哺乳动物细胞慢，群体倍增时间为≥72小时。例如，以1:5的比例从100%融合培养物中传代的ISE6细胞将需要3-4周才能恢复100%汇合。健康的ISE6细胞通常与许多粘附的细丝呈圆形¹⁷。
   2. 在光学显微镜下用血细胞计数器计数ISE6细胞。以~10⁶ 个细胞/mL（100%汇合）的浓度使用。
      1. 用培养基轻轻冲洗烧瓶中的细胞，并通过移液分散细胞以产生均匀的细胞悬液。在血细胞计数器和盖玻片之间加入 20 μL 细胞悬液，以使用血细胞计数器对细胞进行计数。
   3. 将宿主无细胞野生型R. parkeri 20（平均数:5 × 10 7-10 ×^{10 7}）添加到^{25cm 2}细胞培养瓶中的ISE6细胞培养物中。将受感染的帕克利链球菌细胞培养物在 34 °C 下在由 L15C300 培养基、10% FBS、5% TPB、0.1% LPC、0.25% 碳酸氢钠 （NaHCO₃） 和 25 mM HEPES 组成的完全培养基中孵育，直到 90%-100% 的细胞被感染。
      注意: R. parkeri 在ISE6细胞中的感染率由Giemsa染色确定，达到90%-100%感染的孵育时间平均为5天至7天。
   4. 通过吉姆萨染色确定感染率。
      1. 在生物安全柜中，重悬感染的细胞培养物并将 50 μL 悬浮液转移到 1.5 mL 微量离心管中。
      2. 用完全培养基（1:5稀释）稀释悬浮液，并使用113 × g 离心机将100μL离心到玻璃显微镜载玻片上5分钟。为了保持活的 R. parkeri ，请使用带有密封转子的离心机，该转子设计为从离心机中取出。这样就可以将密封转子移入和运出罩。
         注意:由于 R. parkeri 在离心前仍然活着，因此需要容纳样品直到立克次体被杀死。因此，用于将 帕克利R. parkeri 培养物旋转到载玻片上的离心机必须具有设计为从离心机中取出的密封转子。将转子置于层流罩中，将样品装入漏斗显微镜载玻片组件中，重新密封转子，然后将密封的转子放回离心机中。然后，打开离心机，将样品沉积到显微镜载玻片上。运行完成后，从离心机中取出密封转子并将其放入层流罩中。在那里，打开转子盖，并在引擎盖内卸载漏斗显微镜载玻片组件。干燥后，将玻璃显微镜载玻片浸入无水甲醇中，从而杀死所有病原体。漏斗和金属载体浸没在稀释的DMQ中，杀死 R. parkeri。
      3. 风干载玻片并在室温（RT）下在无水甲醇中固定5分钟。
      4. 用吉姆萨染色剂（Sørenson缓冲液中的4%，pH 6.6）在37°C下染色载玻片30分钟，并用水冲洗5秒。
      5. 通过光学显微镜确定感染百分比（感染立克次体/100 个细胞的细胞数）。
         注: 图1 显示了典型的吉姆萨染色结果。
2. 制备无细胞帕 氏菌
   注意:当培养物中90%-100%的细胞被感染时，应从ISE6细胞中分离立克次体并进行电穿孔。
   1. 将无菌 60-90 碳化硅砂砾添加到无菌 2 mL 微量离心管中，体积约为 0.2 mL。
   2. 从 100% R. parkeri 感染的培养物中取出 2 mL 培养基（步骤 1.1.3），并将细胞重悬于剩余的 3 mL 培养基中。
   3. 将该悬浮液的相等部分转移到步骤1.2.1中制备的管中。
   4. 高速涡旋每个管子30秒，然后将管子放在冰上。让砂砾在重力作用下在几秒钟内沉降。
   5. 在 II 类生物安全柜中，准备好无菌 5 mL 鲁尔锁注射器，柱塞伸展，柱塞末端固定在聚苯乙烯基座中，用于 15 mL 锥形管。
   6. 使用安装在合适移液器上的无菌 1 mL 阻隔移液器吸头，从管中取出涡旋细胞裂解物的上清液，注意不要吸入任何砂砾。将移液器吸头插入注射器集线器开口，并以轻柔的压力将内容物弹出注射器。或者，使用无菌的屏障 2 mL 巴斯德移液器，该移液器由橡胶灯泡操作。
   7. 将灭菌的 2 μm 孔径过滤器连接到注射器集线器上，并将步骤 1.2.6 中的 R. parkeri 培养物过滤到无菌 1.5 mL 管中。
   8. 通过在4°C下以13，600×g离心5分钟来收集R. parkeri，并弃去上清液。
   9. 将沉淀重悬于1.2mL冰冷的300mM蔗糖中，并在4°C下以13，600× g 再次离心5分钟。重复重悬和离心，总共两次蔗糖洗涤。
   10. 将 R. parkeri 沉淀合并到一个冷冻的无菌 1.5 mL 微量离心管中，每次转化一次，放入 50 μL 冰冷的 300 mM 蔗糖中。当一个 25 cm 2 烧瓶的 R. parkeri 提供足够的立克次体进行² 到 3 次转化时，加入 100-150 μL 的 300 mM 冷蔗糖。
       注意:如果需要，可以使用彼得罗夫-豪斯计数室计算立克次体的数量。当使用初始接种5 × 10⁷ -10 × 10^{7 无}细胞帕克利 R. 时，平均需要 5-7 天才能达到 90%-100% 感染，产生大约 5 × 10^7-10 × 10¹⁰ 无细胞帕克利。
   11. 通过移液轻轻重悬沉淀，直到其完全分散。将样品在冷藏、无菌的 1.5 mL 微量离心管中分成 50 μL 份。
       注意:如果需要，可以在用荧光染料 ²¹染色后通过流式细胞术评估立克次体活力。

2. 帕氏鼠 与pRAM18dSFA质粒的转化

1. 在冰上，向含有 50 μL R. parkeri 悬浮液的每个试管中加入 3 μg 无内毒素的 pRAM18dSFA 质粒 DNA¹³、^15、20，并用移液管尖端轻轻但彻底地搅拌混合物。
   注意:制备质粒DNA时，请使用包含内毒素去除步骤的纯化试剂盒，以产生无内毒素质粒DNA²³。我们发现，每50μL 帕克瑞鼠 悬液中质粒浓度在1μg至3μg之间会导致成功的转化，而将质粒的量增加到10μg会抑制转化。
2. 将上述DNA和R. parkeri混合物转移到冷却的无菌 0.1cm 间隙电穿孔比色皿中（轻轻敲击比色皿，直到混合物均匀分布），并将其放在冰上10-30分钟。
3. 从 ISE6 细胞的 100% 汇合培养物中取出培养基，并将细胞层重悬于 1.5 mL 的新鲜培养基中，并用 NaHCO 3 和 HEPES 缓冲液（如上文步骤 1.1.3 所述）。每次转化使用一瓶融合细胞。
4. 将重悬的细胞转移到无菌的2 mL微量离心管中（每25cm² 瓶ISE6细胞一个管）。
5. 使用电穿孔器在 1.8 KV、200 欧姆、25 μF 下电穿孔 R. parkeri/pRAM18dSFA 混合物。
6. 使用无菌的加长细尖移液管，将少量ISE6细胞悬液（步骤2.4）转移到比色皿中，轻轻上下拉动液体以冲洗出比色皿。将混合物转移到含有剩余ISE6细胞悬液的2 mL微量离心管中，并将转化混合物与细胞轻轻混合。
7. 在室温下以 700 × g 离心转化后的样品 2 分钟，然后在室温下将离心速度增加到 13，600 × g ，再旋转 1 分钟。
   注意:两种离心速度促进立克次体结合和进入细胞:700 × g 用于拉下ISE6细胞，而13，600 × g 用于拉下立克次体。
8. 让样品在室温或34°C下静置15分钟至1小时。
9. 使用安装在移液器上的无菌 2 mL 阻隔移液器吸头将转化体（两个或三个）重悬于 ISE6 细胞中，并转移到含有 3.5 mL 新鲜培养基的两个或三个 25 cm² 细胞培养瓶中，其中包含 NaHCO₃ 和 HEPES 缓冲液。或者，使用无菌的屏障 2 mL 巴斯德移液器，该移液器由橡胶灯泡操作。
10. 摇动烧瓶以使混合物均匀分布，然后在34°C下孵育。
11. 16-24小时后，在步骤2.10中向每个烧瓶中加入10μL大观霉素（50mg / mL）和10μL链霉素（50mg / mL）。

3. 对转化后的R. parkeri的观察

注意:使用带有罗丹明/ TRITC滤光片的落射荧光显微镜在3-7天后观察步骤2.11中制备的烧瓶。一旦斑块在培养物中明显（5-14天），就可以看到转化的 R. parkeri 表达编码在pRAM18dSFA质粒上的红色荧光蛋白mKATE。

1. 共聚焦显微镜
   1. 重悬步骤2.11烧瓶中的细胞培养物，并将100μL这些细胞培养物与5μLHoechst 33342溶液在室温下在黑暗中混合10-30分钟。
      注意:Hoechst 33342 是一种细胞渗透性核复染剂，可与活蜱细胞 DNA 结合并发出蓝色荧光。
   2. 使用5 × g 离心机将 50 μL 混合物离心到玻璃显微镜载玻片上 3 分钟。
   3. 将 3 μL 1x PBS 添加到沉积在载玻片上的细胞点上，用盖玻片覆盖，并用共聚焦显微镜（60 倍物镜）观察。使用以下激发和发射参数进行荧光成像:对于4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），激发波长为350 nm，发射波长为470 nm;对于四甲基罗丹明（TRITC），激发波长为557 nm，发射波长为576 nm。

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结果

吉姆萨染色后在光学显微镜下ISE6细胞中帕克里R. parkeri的形态如图1所示。在图2中，使用共聚焦显微镜显示了在ISE6细胞中表达红色荧光蛋白的转化R. parkeri。从孵育的第7天到（B）第10天，ISE6细胞（蓝色，对应于细胞核）中转化的R. parkeri（红色）的感染率显着增加。

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讨论

在这里，我们展示了一种使用电穿孔将穿梭质粒pRAM18dSFA上编码的外源性DNA引入立克次体的方法。在此过程中，从宿主细胞中纯化游离立克次体，用立克次体穿梭载体转化，并释放到蜱细胞上进行感染。还描述了一种共聚焦免疫荧光程序，用于检测蜱细胞中表达红色荧光蛋白的 R. parkeri 。类似的方法适用于其他 立克次体 物种，并且通过进一步的修改可能适用于能够维持质粒的其他专?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette	Bio-Rad	1652083
2 μm pore size filter	GE Healthcare Life Sciences Whatman	6783-2520
5 mL Luer-lock syringe	BD	309646
60-90 silicon carbide grit	LORTONE, inc	591-056
absolute methanol	Fisher Scientific	A457-4
Bacto tryptose phosphate broth	BD	260300
Cytospin centrifuge Cytospin4	Thermo Fisher Scientific	A78300003	The rotor is detachable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)	QIAGEN	12362	used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet	Perfector Scientific	TP03-5301
fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108	The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS	Bio-Rad	165-2105 & 165-2110
hemocytometer	Thermo Fisher Scientific	267110
HEPES	Millipore-Sigma	H4034
ImageJ Fiji	National Institute of Health		raw image editing
KaryoMAX Giemsa stain	Gibco	2021-10-30
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	41300039
lipoprotein concentrate	MP Biomedicals	191476
Nikon Diaphot	Nikon		epifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent	Thermo Fisher Scientific	R37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope	Olympus
Petroff-Hausser Counting Chamber	Hausser Scientific	Chamber 3900
sodium bicarbonate	Millipore-Sigma	S5761
Vortex	Fisher Vortex Genie 2	12-812