Um método de eletroporação para transformar Rickettsia spp. com um vetor shuttle fluorescente de expressão de proteínas em linhagens celulares de carrapatos

Resumo

A eletroporação é um método rápido e amplamente adotado para a introdução de DNA exógeno no gênero Rickettsia. Este protocolo fornece um método de eletroporação útil para a transformação de bactérias intracelulares obrigatórias no gênero Rickettsia.

Resumo

As rickettsioses são causadas por uma ampla gama de bactérias intracelulares obrigatórias pertencentes ao gênero Rickettsia que podem ser transmitidas aos hospedeiros vertebrados através da picada de vetores artrópodes infectados. Até o momento, as rickettsioses epidêmicas emergentes ou reemergentes continuam sendo um risco para a saúde pública devido à dificuldade no diagnóstico, pois os métodos diagnósticos são limitados e não padronizados ou universalmente acessíveis. O diagnóstico errôneo resultante da falta de reconhecimento dos sinais e sintomas pode resultar em atraso no tratamento com antibióticos e maus resultados de saúde. Uma compreensão abrangente das características da Rickettsia acabaria por melhorar o diagnóstico clínico, a avaliação e o tratamento com melhor controle e prevenção da doença.

Estudos funcionais de genes rickettsianos são cruciais para a compreensão de seu papel na patogênese. Este trabalho descreve um procedimento para a eletroporação da cepa Tate's Hell de Rickettsia parkeri com o vetor shuttle pRAM18dSFA e a seleção de R. parkeri transformado em cultura de células de carrapatos com antibióticos (espectromicina e estreptomicina). Um método também é descrito para a localização de R. parkeri transformado em células de carrapatos usando microscopia de imunofluorescência confocal, uma técnica útil para verificar a transformação em linhagens celulares vetoriais. Abordagens semelhantes também são adequadas para a transformação de outras rickettsiae.

Introdução

Rickettsioses são causadas por uma ampla gama de bactérias intracelulares obrigatórias que pertencem ao gênero Rickettsia (família Rickettsiaceae, ordem Rickettsiales). O gênero Rickettsia é classificado em quatro grupos principais com base em características filogenéticas^1,2: o grupo da febre maculosa (SFG), que contém as rickettsias que causam as rickettsioses transmitidas por carrapatos mais graves e fatais (por exemplo, Rickettsia rickettsii, o agente causador da febre maculosa das Montanhas Rochosas), o grupo do tifo (TG, por exemplo, Rickettsia prowazekii^, o agente do tifo epidêmico), o grupo de transição (TRG, por exemplo, Rickettsia felis, o agente causador da febre maculosa transmitida por pulgas) e o grupo ancestral (AG, por exemplo, Rickettsia bellii).

Entre as mais antigas doenças transmitidas por vetores conhecidas, as rickettsioses são adquiridas principalmente após a transmissão dos patógenos através das picadas de vetores artrópodes infectados, incluindo carrapatos, pulgas, piolhos e ácaros ^3,4. Embora a descoberta de antibióticos eficazes tenha melhorado os resultados do tratamento, as rickettsioses epidêmicas emergentes e reemergentes continuam a desafiar as estratégias tradicionais de prevenção e controle. Assim, uma compreensão abrangente das interações rickettsia / hospedeiro / vetor acabaria por estabelecer uma base sólida para o desenvolvimento de novas abordagens para prevenir e curar essas doenças antigas.

Na natureza, a transferência horizontal de genes (HGT) em bactérias ocorre por meio de conjugação, transdução e transformação⁵. A transformação bacteriana in vitro utiliza esses conceitos de HGT, embora a natureza intracelular das rickettsias apresente alguns desafios. As condições restritas de crescimento e os sistemas de conjugação e transdução pouco compreendidos em diferentes espécies de rickettsiae têm impedido a aplicação de métodos de conjugação e transdução em rickettsiae ^6,7,8. Comparado com outros gêneros bacterianos intracelulares obrigatórios (por exemplo, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma e Ehrlichia), o gênero Rickettsia difere no que diz respeito às estratégias de crescimento e replicação dentro do citoplasma celular, o que impõe desafios específicos à modificação genética das rickettsias devido às suas características únicas de estilo de vida⁹.

O obstáculo inicial a ser superado ao tentar a modificação genética das rickettsias é alcançar uma transformação bem-sucedida. Assim, projetar uma abordagem viável com alta eficiência de transformação seria extremamente valioso para o desenvolvimento de ferramentas genéticas para rickettsias. Aqui, nos concentramos na eletroporação, um método de transformação amplamente reconhecido que tem sido usado para introduzir DNA exógeno com sucesso em várias espécies de rickettsiae, incluindo Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii e Rickettsia buchneri^10,11,12 ,^13,14,15,16.

Este trabalho descreve um procedimento para a eletroporação da cepa de R. parkeri Tate's Hell (acesso: GCA_000965145.1) com o vetor shuttle pRAM18dSFA derivado do plasmídeo AaR/SC pRAM18 da cepa Rickettsia amblyommatis projetado para codificar mKATE, uma proteína fluorescente de vermelho distante, e aadA, conferindo resistência à espectromicina e estreptomicina^13,15,20. R. parkeri transformados são viáveis e mantidos de forma estável sob seleção de antibióticos em linhagens celulares de carrapatos. Além disso, mostramos que a localização de R. parkeri transformado em células vivas de carrapatos via microscopia confocal pode ser usada para avaliar a qualidade das taxas de transformação em linhagens celulares vetoriais.

Protocolo

1. Propagação e purificação de R. parkeri a partir de cultura de células de carrapatos

NOTA: Todos os procedimentos de cultura de células devem ser realizados em um gabinete de biossegurança de classe II.

1. Preparando R. parkeri-células de carrapatos infectadas
   1. Cultivar células ISE6 em frascos de cultura celular de^{25 cm 2} a 34 °C em 5 mL de L15C300 em meio¹⁷, suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS), caldo de fosfato de triptose a 5% (TPB) e concentrado de lipoproteína a 0,1% (LPC).
      NOTA: O ISE6 (linhagem celular derivada de embriões de Ixodes scapularis) é uma linhagem celular de carrapatos amplamente utilizada em muitos laboratórios e é, portanto, um modelo essencial para estudar as interações carrapato-patógeno^17,18,19. A taxa de crescimento das células ISE6 é mais lenta do que a das células de mamíferos, com um tempo de duplicação populacional de ≥72 h. Por exemplo, as células ISE6 subcultivadas a partir de uma cultura 100% confluente a uma proporção de 1:5 levarão 3-4 semanas para recuperar 100% de confluência. As células ISE6 saudáveis serão geralmente arredondadas com numerosos filamentos aderentes¹⁷.
   2. Conte as células ISE6 com um hemocitômetro sob um microscópio de luz. Use em uma concentração de ~10⁶ células/mL (100% confluente).
      1. Enxaguar suavemente as células do balão com meio e dispersar as células por pipetagem para gerar uma suspensão celular homogénea. Adicione 20 μL de suspensão celular entre o hemocitômetro e cubra o vidro para contar as células usando um hemocitômetro.
   3. Adicionar R. parkeri 20 do tipo selvagem livre de células hospedeiras (número médio: 5 × 10 7-10 × 10⁷) às culturas de células ISE6 em frascos de cultura celular ^{de 25 cm 2}. Incubar culturas de células de R. parkeri infectadas a 34 °C em 5 mL de meio completo consistindo de meio L15C300, FBS a 10%, TPB a 5%, LPC a 0,1%, bicarbonato de sódio a 0,25% (NaHCO₃) e HEPES a 25 mM até que 90%-100% das células estejam infectadas.
      NOTA: A taxa de infecção de R. parkeri em células ISE6 é determinada pela coloração de Giemsa, e o tempo de incubação para atingir 90%-100% de infecção varia de 5 dias a 7 dias em média.
   4. Determine a taxa de infecção através da coloração de Giemsa.
      1. No gabinete de biossegurança, ressuspeite as culturas de células infectadas e transfira 50 μL da suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
      2. Diluir a suspensão com meio completo (diluição 1:5) e centrifugar 100 μL em lâminas de microscópio de vidro utilizando uma centrífuga a 113 × g durante 5 min. Para manter o R. parkeri vivo contido, use uma centrífuga com um rotor selado projetado para ser removido da centrífuga. Isso permite o transporte do rotor selado para dentro e para fora do capô.
         NOTA: Como os R. parkeri ainda estão vivos antes da centrifugação, a amostra precisa ser contida até que a rickettsia seja morta. Assim, a centrífuga usada para girar a cultura de R. parkeri na lâmina deve ter um rotor selado que é projetado para ser levantado da centrífuga. Com o rotor no exaustor de fluxo laminar, carregue as amostras no conjunto de corrediças do funil-microscópio, sele novamente o rotor e coloque o rotor selado de volta na centrífuga. Em seguida, ligue a centrífuga e as amostras serão depositadas nas lâminas do microscópio. Após o término da corrida, remova o rotor selado da centrífuga e coloque-o no exaustor de fluxo laminar. Lá, abra a tampa do rotor e descarregue o conjunto de lâminas funil-microscópio dentro do capô. Uma vez seco, mergulhe as lâminas do microscópio de vidro em metanol absoluto, que mata todos os patógenos. Os funis e os portadores de metal são submersos em DMQ diluído, o que mata R. parkeri.
      3. Seque as lâminas ao ar livre e fixe em metanol absoluto por 5 min à temperatura ambiente (RT).
      4. Manchar as lâminas com a coloração de Giemsa (4% em tampão de Sørenson, pH 6,6) durante 30 min a 37 °C e enxaguar com água durante 5 s.
      5. Determinar a percentagem de infeção (número de células infetadas com rickettsiae/100 células) por microscopia de luz.
         NOTA: A Figura 1 mostra os resultados típicos da coloração de Giemsa.
2. Preparação de R. parkeri sem células
   NOTA: Quando 90%-100% das células da cultura estão infectadas, as rickettsias devem ser isoladas das células ISE6 e a eletroporação deve ser realizada.
   1. Adicione grão de carboneto de silício estéril 60-90 a tubos de microcentrífuga estéreis de 2 mL a um volume de aproximadamente 0,2 mL.
   2. Remover 2 mL de meio de culturas 100% infectadas por R. parkeri (etapa 1.1.3) e ressuspender as células nos 3 mL restantes de meio.
   3. Transferir porções iguais desta suspensão para tubos preparados na fase 1.2.1.
   4. Vórtice cada tubo em alta velocidade por 30 s e, em seguida, coloque os tubos no gelo. Deixe a areia assentar em segundos pela gravidade.
   5. Em um armário de biossegurança de classe II, tenha uma seringa estéril de 5 mL Luer-lock pronta com o êmbolo estendido e a extremidade do êmbolo presa em uma base de poliestireno para tubos cônicos de 15 mL.
   6. Usando uma ponta de pipeta de barreira estéril de 1 mL montada em um pipetador adequado, remova o sobrenadante do lisado de células vórtices do tubo, tomando cuidado para não aspirar nenhum grão. Insira a ponta do pipeta na abertura do cubo da seringa e ejete o conteúdo na seringa com uma pressão suave. Alternativamente, use uma pipeta Pasteur estéril de barreira de 2 mL operada com um bulbo de borracha.
   7. Fixar um filtro esterilizado de 2 μm de tamanho de poro no cubo da seringa e filtrar a cultura de R. parkeri da etapa 1.2.6 em tubos estéreis de 1,5 ml.
   8. Recolher o R. parkeri por centrifugação a 13.600 × g a 4 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante.
   9. Ressuscite o pellet em 1,2 mL de sacarose gelada de 300 mM e centrifugar novamente a 13.600 × g a 4 °C por 5 min. Repetir a ressuspensão e a centrifugação para um total de duas lavagens com sacarose.
   10. Combinar os pellets de R. parkeri em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril, refrigerado, em 50 μL de sacarose gelada de 300 mM por transformação. Como um frasco de 25 cm² de R. parkeri fornece rickettsias suficientes para duas a três transformações, adicione 100-150 μL de sacarose fria de 300 mM.
       NOTA: Se desejado, o número de rickettsiae pode ser calculado usando uma câmara de contagem de Petroff-Hausser. Ao usar uma inoculação inicial de 5 × 10 7 -10 × 10 7 R. parkeri livre de células, levará em média 5-7 dias para atingir 90%-100% de infecção, produzindo aproximadamente 5 × 10^7-10 × 10¹⁰ R. parkeri livre de células.
   11. Ressuspeite suavemente o pellet por pipetagem até que esteja completamente disperso. Divida a amostra em porções de 50 μL em tubos microcentrífugos estéreis e estéreis e refrigerados.
       NOTA: Se desejado, a viabilidade da rickettsia pode ser avaliada por citometria de fluxo após coloração com corante fluorescente ²¹.

2. Transformação de R. parkeri com o plasmídeo pRAM18dSFA

1. No gelo, adicionar 3 μg de DNA plasmídico pRAM18dSFA ^13,15,20 livre de endotoxinas a cada tubo contendo ⁵⁰ μL de suspensão de R. parkeri e agitar a mistura com a ponta do pipeta suave mas completamente.
   NOTA: Ao preparar o DNA plasmídico, use um kit de purificação que inclua uma etapa de remoção de endotoxinas para produzir DNA plasmidial livre de endotoxinas²³. Descobrimos que uma gama de concentrações de plasmídeos entre 1 μg e 3 μg por 50 μL de suspensão de R. parkeri resultou em transformações bem-sucedidas, enquanto o aumento da quantidade de plasmídeo para 10 μg inibiu a transformação.
2. Transfira a mistura acima de DNA e R. parkeri para uma cubeta de eletroporação de 0,1 cm refrigerada e estéril (bata suavemente na cubeta até que a mistura seja distribuída uniformemente) e deixe-a descansar no gelo por 10-30 min.
3. Remover o meio de uma cultura 100% confluente de células ISE6 e ressuspender as camadas celulares em 1,5 mL de meio fresco com NaHCO 3 e tampão HEPES (descrito acima na etapa 1.1.3). Utilizar um balão de células confluentes por transformação.
4. Transferir as células ressuspensas para um tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml (um tubo por balão de^{25 cm 2} de células ISE6).
5. Eletroporate a mistura de R. parkeri/pRAM18dSFA a 1,8 KV, 200 ohms, 25 μF usando um eletroporador.
6. Usando um pipeto de transferência de ponta fina estéril e estendido, transfira uma pequena quantidade da suspensão de células ISE6 (etapa 2.4) para a cubeta e puxe suavemente o líquido para cima e para baixo para lavar a cubeta. Transfira a mistura para o tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo o restante da suspensão de células ISE6 e misture suavemente a mistura de transformação com as células.
7. Centrifugar as amostras transformadas a 700 × g por 2 min no RT e, em seguida, aumentar a velocidade de centrifugação para 13.600 × g por mais 1 min no RT.
   NOTA: As duas velocidades de centrifugação promovem a ligação rickettsial e a entrada nas células: 700 × g são usados para puxar as células ISE6, enquanto 13.600 × g são usados para puxar as rickettsias para baixo.
8. Deixar as amostras a RT ou a 34 °C durante 15 min a 1 h.
9. Ressuspender os transformadores (dois ou três) em células ISE6 com uma ponta de pipeta de barreira estéril de 2 mL ajustada a um pipetador e transferir para dois ou três frascos de cultura celular de^{25 cm 2} contendo 3,5 mL de meio fresco com NaHCO₃ e tampão HEPES. Alternativamente, use uma pipeta Pasteur estéril de barreira de 2 mL operada com um bulbo de borracha.
10. Agitar os balões para espalhar uniformemente a mistura e, em seguida, incubar a 34 °C.
11. Após 16-24 h, adicionar 10 μL de espectinomicina (50 mg/mL) e 10 μL de estreptomicina (50 mg/mL) a cada balão na etapa 2.10.

3. Observação do R. parkeri transformado

NOTA: Utilizar um microscópio de epifluorescência com filtros de rodamina/TRITC para observar os frascos preparados no passo 2.11 após 3-7 dias. Uma vez que as placas são evidentes nas culturas (5-14 dias), pode-se observar R. parkeri transformado que expressa a proteína fluorescente vermelha mKATE, codificada no plasmídeo pRAM18dSFA.

1. Microscopia confocal
   1. Ressuspender as culturas celulares a partir dos frascos de passo 2.11 e misturar 100 μL destas culturas celulares com 5 μL de solução Hoechst 33342 durante 10-30 min a RT no escuro.
      NOTA: A Hoechst 33342 é uma contramancha nuclear permeável a células que se liga ao ADN celular vivo e emite fluorescência azul.
   2. Centrifugar 50 μL da mistura em lâminas de microscópio de vidro utilizando uma centrífuga a 5 × g durante 3 min.
   3. Adicione 3 μL de PBS 1x ao ponto de células depositadas na lâmina, sobreponha com uma folha de cobertura e veja com um microscópio confocal (objetiva de 60x). Utilizar os seguintes parâmetros de excitação e emissão para imagens fluorescentes: para 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), excitação a 350 nm, emissão a 470 nm; para a tetrametilrodamina (TRITC), excitação a 557 nm, emissão a 576 nm.

Resultados

A morfologia de R. parkeri em células ISE6 sob microscópio de luz após coloração de Giemsa é mostrada na Figura 1. Na Figura 2, R. parkeri transformada expressando proteína de fluorescência vermelha em células ISE6 é mostrada usando microscopia confocal. Há um aumento substancial na taxa de infecção de R. parkeri transformado (vermelho) em células ISE6 (azul, corresponde aos núcleos) do (A) dia 7 para (<...

Discussão

Aqui, demonstramos um método para introduzir DNA exógeno codificado no plasmídeo pRAM18dSFA em rickettsias usando eletroporação. Neste procedimento, as rickettsias livres de células foram purificadas a partir de células hospedeiras, transformadas com um vetor de transporte de rickettsias e liberadas em células de carrapatos para infecção. Também é descrito um procedimento de imunofluorescência confocal para detectar R. parkeri que expressa proteína de fluorescência vermelha em células de carrapat...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette	Bio-Rad	1652083
2 μm pore size filter	GE Healthcare Life Sciences Whatman	6783-2520
5 mL Luer-lock syringe	BD	309646
60-90 silicon carbide grit	LORTONE, inc	591-056
absolute methanol	Fisher Scientific	A457-4
Bacto tryptose phosphate broth	BD	260300
Cytospin centrifuge Cytospin4	Thermo Fisher Scientific	A78300003	The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)	QIAGEN	12362	used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet	Perfector Scientific	TP03-5301
fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108	The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS	Bio-Rad	165-2105 & 165-2110
hemocytometer	Thermo Fisher Scientific	267110
HEPES	Millipore-Sigma	H4034
ImageJ Fiji	National Institute of Health		raw image editing
KaryoMAX Giemsa stain	Gibco	2021-10-30
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	41300039
lipoprotein concentrate	MP Biomedicals	191476
Nikon Diaphot	Nikon		epifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent	Thermo Fisher Scientific	R37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope	Olympus
Petroff-Hausser Counting Chamber	Hausser Scientific	Chamber 3900
sodium bicarbonate	Millipore-Sigma	S5761
Vortex	Fisher Vortex Genie 2	12-812