Rickettsia spp.를 Tick 세포주에서 형광 단백질 발현 셔틀 벡터로 형질전환하기 위한 전기천공 방법

요약

전기 천공은 Rickettsia 속에 외인성 DNA를 도입하기 위해 빠르고 광범위하게 채택 된 방법입니다. 이 프로토콜은 Rickettsia 속의 절대 세포 내 박테리아의 형질 전환에 유용한 전기 천공 방법을 제공합니다.

초록

리케차증은 감염된 절지 동물 벡터의 물기를 통해 척추 동물 숙주로 전염 될 수있는 Rickettsia 속에 속하는 광범위한 절대 세포 내 박테리아에 의해 발생합니다. 현재까지 신흥 또는 재출현 유행성 리케차증은 진단 방법이 제한적이고 표준화되거나 보편적으로 접근 할 수 없기 때문에 진단의 어려움으로 인해 공중 보건 위험으로 남아 있습니다. 징후와 증상에 대한 인식 부족으로 인한 오진은 항생제 치료가 지연되고 건강 결과가 좋지 않을 수 있습니다. 리케차 특성에 대한 포괄적 인 이해는 궁극적으로 질병의 통제 및 예방을 개선하여 임상 진단, 평가 및 치료를 향상시킬 것입니다.

리케차 유전자의 기능 연구는 병인에서의 역할을 이해하는 데 중요합니다. 이 논문은 셔틀 벡터 pRAM18dSFA를 사용하여 리케차 파케리 균주 테이트 헬의 전기천공법과 항생제(스펙티노마이신 및 스트렙토마이신)를 사용한 진드기 세포 배양에서 형질전환된 R. 파케리 의 선택을 위한 절차를 설명합니다 . 벡터 세포주에서 형질전환을 확인하는 데 유용한 기술인 공초점 면역형광 현미경을 사용하여 진드기 세포에서 형질전환된 R. parkeri 의 국소화에 대한 방법도 설명합니다. 유사한 접근법이 다른 리케차의 변형에도 적합합니다.

서문

리케차증은 리케차 (Rickettsiaceae 가족, 리케차 시알 레스 주문)에 속하는 광범위한 절대 세포 내 박테리아에 의해 발생합니다. Rickettsia 속은 계통 발생 특성^1,2에 따라 4 개의 주요 그룹으로 분류됩니다 : 가장 심각하고 치명적인 진드기 매개 리케차증을 유발하는 리케차(예: Rickettsia rickettsii, 로키 산 홍반열의 원인균), 발진티푸스 그룹(TG^, 예: Rickettsia prowazekii, 유행성 발진티푸스의 대리인), 과도기 그룹 (TRG, 예 : 리케차 펠리스, 벼룩 매개 홍 반열의 원인균) 및 조상 그룹 (AG, 예 : 리케차 벨리).

가장 오래된 알려진 벡터 매개 질병 중 리케차증은 주로 진드기, 벼룩, 이 및 진드기를 포함한 감염된 절지동물 벡터의 물기를 통해 병원체가 전염된 후 획득됩니다^3,4. 효과적인 항생제의 발견으로 치료 결과가 개선되었지만 새롭게 등장하고 다시 등장하는 전염병 리케차증은 전통적인 예방 및 통제 전략에 계속 도전하고 있습니다. 따라서 리케차/숙주/벡터 상호 작용에 대한 포괄적인 이해는 궁극적으로 이러한 고대 질병을 예방하고 치료하기 위한 새로운 접근 방식을 개발하기 위한 강력한 기반을 구축할 것입니다.

자연에서 박테리아의 수평 유전자 전달 (HGT)은 접합, 형질 도입 및 형질 전환⁵을 통해 발생합니다. 시험관 내 박테리아 형질전환은 이러한 HGT 개념을 활용하지만 리케차의 세포 내 특성에는 몇 가지 문제가 있습니다. 리케차의 다른 종에서 제한된 성장 조건과 잘 이해되지 않은 접합 및 형질 도입 시스템은 리케차 ^6,7,8에서 접합 및 형질 도입 방법의 적용을 방해했습니다. 다른 절대 세포 내 박테리아 속 (예 : 클라미디아, 콕시 엘라, 아나 플라스마 및 에를리키아)과 비교하여 Rickettsia 속은 세포질 내의 성장 및 복제 전략과 관련하여 다르며, 이는 독특한 생활 방식으로 인해 리케차의 유전자 변형에 특정 문제를 부과합니다⁹.

리케차의 유전자 변형을 시도 할 때 극복해야 할 초기 장애물은 성공적인 형질 전환을 달성하는 것입니다. 따라서 높은 형질 전환 효율로 실현 가능한 접근법을 설계하는 것은 리케차에 대한 유전 도구를 개발하는 데 매우 중요합니다. 여기에서는 리케차 프로와제키, 리케차 티피, 리케차 코노리, 리케차 파케리, 리케차 몬타넨시스, 리케차 벨리, 리케차 공작, 리케차 부흐네리를 포함한 여러 종의 리케차에 외인성 DNA를 성공적으로 도입하는 데 사용된 널리 알려진 형질전환 방법인 전기천공에 중점을 둡니다. ^10,11,12 ,^13,14,15,16.

이 논문은 원적색 형광 단백질인 mKATE와 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신 내성^13,15,20을 부여하도록 설계된 리케차 약시 균주 AaR/SC 플라스미드 pRAM18에서 파생된 셔틀 벡터 pRAM18dSFA를 사용하여 R. parkeri 균주 Tate's Hell(기탁: GCA_000965145.1)의 전기천공 절차를 설명합니다. 형질전환된 R. 파케리는 진드기 세포주에서 항생제 선택 하에 생존 가능하고 안정적으로 유지된다. 또한 컨포칼 현미경을 통해 살아있는 진드기 세포에서 형질전환된 R. parkeri의 국소화를 사용하여 벡터 세포주의 형질전환 속도를 평가할 수 있음을 보여줍니다.

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프로토콜

1. 진드기 세포 배양에서 R. parkeri 의 번식 및 정제

참고: 모든 세포 배양 절차는 클래스 II 생물안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.

1. 준비 R. parkeri-감염된 진드기 세포
   1. 5% 소 태아 혈청(FBS), 5% 트립토스 인산염 액체(TPB) 및 0.1% 지단백질 농축액(LPC)이 보충된 L15C300 배지¹⁷ 5mL에서 34°C의^25cm2 세포 배양 플라스크에서 ISE6 세포를 성장시킵니다.
      참고: ISE6(Ixodes scapularis 배아 유래 세포주)는 많은 실험실에서 광범위하게 사용되는 진드기 세포주이므로 진드기-병원체 상호 작용을 연구하는 데 필수적인 모델입니다^17,18,19. ISE6 세포의 성장 속도는 포유류 세포보다 느리며 개체군 배가 시간은 ≥72 시간입니다. 예를 들어, 100% 컨플루언트 배양에서 1:5의 비율로 재배양된 ISE6 세포는 100% 컨플루언스를 회복하는 데 3-4주가 걸립니다. 건강한 ISE6 세포는 일반적으로 다수의 부착 필라멘트(¹⁷)로 둥글게 될 것이다.
   2. 광학 현미경으로 혈구계로 ISE6 세포를 계수합니다. ~10⁶ cells/mL(100% 합류)의 농도로 사용하십시오.
      1. 플라스크에서 세포를 배지로 부드럽게 헹구고 피펫팅으로 세포를 분산시켜 균질한 세포 현탁액을 생성합니다. 혈구계와 커버 글라스 사이에 20μL의 세포 현탁액을 추가하여 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
   3. 숙주 무세포 야생형 R. 파케리 20(평균수: 5 × 10^7-10 × 10 7)을 ^{25 cm2} 세포 배양 플라스크에서 ISE6 세포 배양물에 첨가한다. 감염된 R. parkeri 세포 배양물을 L15C300 배지, 10% FBS, 5% TPB, 0.1% LPC, 0.25% 중탄산나트륨(NaHCO3) 및 25mM hepes로 구성된 완전한 배지 5mL에서 세포의 90%-100%가 감염될 때까지 34°C에서 배양합니다.
      참고: ISE6 세포에서 R. parkeri 의 감염률은 Giemsa 염색에 의해 결정되며 90%-100% 감염에 도달하는 배양 시간은 평균 5일에서 7일 사이입니다.
   4. Giemsa 염색을 통해 감염률을 결정하십시오.
      1. 생물안전 캐비닛에서 감염된 세포 배양액을 재현탁하고 현탁액 50μL를 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
      2. 현탁액을 완전 배지(1:5 희석)로 희석하고 113× g 의 원심분리기를 사용하여 유리 현미경 슬라이드에 100μL를 원심분리합니다. 살아있는 R. parkeri 를 계속 보관하려면 원심 분리기에서 제거하도록 설계된 밀봉 된 로터가있는 원심 분리기를 사용하십시오. 이를 통해 밀봉된 로터를 후드 안팎으로 운반할 수 있습니다.
         참고: R. parkeri 는 원심분리 전에 아직 살아 있으므로 리케차가 죽을 때까지 샘플을 담아야 합니다. 따라서 R. parkeri 배양물을 슬라이드로 회전시키는 데 사용되는 원심분리기에는 원심분리기에서 들어 올릴 수 있도록 설계된 밀봉된 로터가 있어야 합니다. 층류 후드에 로터를 놓고 샘플을 깔때기 현미경 슬라이드 어셈블리에 로드하고 로터를 다시 밀봉한 다음 밀봉된 로터를 원심분리기에 다시 넣습니다. 그런 다음 원심 분리기를 켜면 샘플이 현미경 슬라이드에 증착됩니다. 실행이 끝나면 원심 분리기에서 밀봉 된 로터를 제거하고 층류 후드에 놓습니다. 거기에서 로터 뚜껑을 열고 후드 내부의 깔때기 현미경 슬라이드 어셈블리를 내립니다. 건조되면 유리 현미경 슬라이드를 절대 메탄올에 담그면 모든 병원체가 죽습니다. 깔때기와 금속 캐리어는 희석 된 DMQ에 잠겨 R. parkeri를 죽입니다.
      3. 슬라이드를 자연 건조시키고 실온(RT)에서 5분 동안 무수 메탄올에 고정합니다.
      4. 슬라이드를 Giemsa 염색(Sørenson의 완충액 중 4%, pH 6.6)으로 37°C에서 30분 동안 염색하고 5초 동안 물로 헹굽니다.
      5. 광학 현미경으로 감염률(리케차에 감염된 세포 수/100개 세포)을 결정합니다.
         참고: 그림 1 은 일반적인 Giemsa 염색 결과를 보여줍니다.
2. 무세포 R. 파케리 준비
   참고: 배양 중인 세포의 90%-100%가 감염되면 리케차는 ISE6 세포에서 분리되어야 하며 전기천공을 수행해야 합니다.
   1. 멸균 60-90 실리콘 카바이드 그릿을 멸균 2mL 마이크로 원심 분리 튜브에 약 0.2mL의 부피로 추가합니다.
   2. 100% R. parkeri-감염된 배양물로부터 2 mL의 배지를 제거하고(단계 1.1.3), 나머지 3 mL의 배지에 세포를 재현탁시킨다.
   3. 이 현탁액의 동일한 부분을 단계 1.2.1에서 준비된 튜브로 옮깁니다.
   4. 각 튜브를 30초 동안 고속으로 소용돌이한 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 중력에 의해 몇 초 안에 모래가 가라앉도록 하십시오.
   5. 클래스 II 생물안전 캐비닛에서 플런저가 확장되고 플런저 끝이 15mL 원뿔형 튜브용 폴리스티렌 베이스에 고정된 멸균 5mL Luer-lock 주사기를 준비합니다.
   6. 적절한 피펫터에 장착된 멸균된 1mL 배리어 피펫 팁을 사용하여 튜브에서 와류 세포 용해물의 상청액을 제거하고 모래가 흡입되지 않도록 주의하십시오. 피펫 팁을 주사기 허브 입구에 삽입하고 내용물을 부드러운 압력으로 주사기에 배출합니다. 또는 고무 전구로 작동하는 멸균 차단성 2mL 파스퇴르 피펫을 사용하십시오.
   7. 멸균된 2μm 공극 크기 필터를 주사기 허브에 부착하고 1.2.6단계의 R. parkeri 배양액을 멸균된 1.5mL 튜브에 여과합니다.
   8. R. 파케리를 4°C에서 5분 동안 13,600 × g으로 원심분리하여 수집하고, 상청액을 폐기한다.
   9. 펠릿을 얼음처럼 차가운 300mM 슈크로오스 1.2mL에 재현탁하고 4°C에서 13,600× g 에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 총 2회의 슈크로스 세척에 대해 재현탁 및 원심분리를 반복한다.
   10. R. parkeri 펠릿을 변환당 50μL의 얼음처럼 차가운 300mM 자당에 담긴 하나의 냉장 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 결합합니다. R. parkeri의 25cm2 플라스크 1개가 2-3회 변형에 충분한 리케차기를 제공하므로 100-150μL의 300mM 콜드 슈크로스를 추가합니다.
       참고: 원하는 경우 Petroff-Hausser 계수 챔버를 사용하여 리케차의 수를 계산할 수 있습니다. 5 × 10⁷ -10 × 10⁷ 무세포 R. parkeri의 초기 접종을 사용하는 경우 90%-100% 감염에 도달하는 데 평균 5-7일이 소요되어 약 5 × 10^7-10 × 10¹⁰ 무세포 R. parkeri가 생성됩니다.
   11. 펠릿이 완전히 분산될 때까지 피펫팅하여 부드럽게 재현탁합니다. 냉장 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 샘플을 50μL 분량으로 나눕니다.
       참고: 원하는 경우, 리케차 생존율은 형광 염료 ²¹을 사용한 염색에 이어 유동 세포측정법에 의해 평가될 수 있다.

2. r. 파케리 와 pRAM18dSFA 플라스미드의 형질전환

1. 얼음 위에서 R. parkeri 현탁액 3μL가 들어 있는 각 튜브에 내독소가 없는 pRAM18dSFA 플라스미드^{DNA 13,15,20} 50μg을 넣고 피펫 팁으로 혼합물을 부드럽지만 완전히 저어줍니다.
   참고: 플라스미드 DNA를 준비할 때 내독소 제거 단계가 포함된 정제 키트를 사용하여 내독소가 없는 플라스미드 DNA²³을 생성하십시오. R. parkeri 현탁액 50μL당 1μg에서 3μg 사이의 플라스미드 농도 범위는 성공적인 형질전환을 초래한 반면, 플라스미드의 양을 10μg으로 늘리면 형질전환이 억제된다는 것을 발견했습니다.
2. 위의 DNA와 R. parkeri 의 혼합물을 냉장되고 멸균 된 0.1cm 간격의 전기 천공 큐벳 (혼합물이 고르게 분포 될 때까지 큐벳을 부드럽게 두드리십시오)에 옮기고 10-30 분 동안 얼음 위에 두십시오.
3. ISE6 세포의 100% 컨플루언트 배양물로부터 배지를 제거하고, NaHCO3 및 HEPES 완충액을 사용하여 1.5mL의 새로운 배지에 세포층을 재현탁시킨다(단계 1.1.3에서 상기 설명됨). 형질 전환 당 하나의 합류 세포 플라스크를 사용하십시오.
4. 재현탁 세포를 멸균된 2mL 미세 원심분리 튜브(ISE6 세포의 25cm2 플라스크당 튜브 1개)로 옮깁니다.
5. 전기 천공기를 사용하여 R. parkeri/pRAM18dSFA 혼합물을 1.8KV, 200옴, 25μF에서 전기천공합니다.
6. 멸균되고 확장된 미세 팁 이송 피펫을 사용하여 소량의 ISE6 세포 현탁액(2.4단계)을 큐벳으로 옮기고 액체를 위아래로 부드럽게 당겨 큐벳을 씻어냅니다. 혼합물을 ISE6 세포 현탁액의 나머지 부분을 포함하는 2mL 미세 원심분리 튜브로 옮기고 형질전환 혼합물을 세포와 부드럽게 혼합합니다.
7. RT에서 2분 동안 700×g에서 형질전환 된 샘플을 원심분리한 다음 RT에서 1분 더 원심분리 속도를 13,600×g으로 높입니다.
   참고: 두 가지 원심분리 속도는 세포와의 리케차 결합 및 진입을 촉진합니다: 700 × g은 ISE6 세포를 풀다운하는 데 사용되는 반면 13,600 × g은 리케차아를 풀다운하는 데 사용됩니다.
8. 샘플을 RT 또는 34 ° C에서 15 분에서 1 시간 동안 그대로 두십시오.
9. 피펫터에 장착된 멸균 2mL 장벽 피펫 팁을 사용하여 ISE6 세포에 형질전환체(2개 또는 3개)를 재현탁하고 NaHCO3 및 HEPES 완충액이 포함된 3.5mL의 새로운 배지가 들어 있는 2개 또는 3개의 25cm² 세포 배양 플라스크로 옮깁니다. 또는 고무 전구로 작동하는 멸균 차단성 2mL 파스퇴르 피펫을 사용하십시오.
10. 플라스크를 흔들어 혼합물을 고르게 펴고 34°C에서 배양합니다.
11. 16-24 시간 후, 10 μL의 스펙 티노 마이신 (50 mg / mL)과 10 μL의 스트렙토 마이신 (50 mg / mL)을 2.10 단계에서 각 플라스크에 첨가하십시오.

3. 변형 된 R. 파케리의 관찰

참고: 로다민/TRITC 필터가 있는 에피형광 현미경을 사용하여 2.11-3일 후에 7단계에서 준비한 플라스크를 관찰합니다. 일단 플라크가 배양물에서 명백해지면(5-14일), 형질전환된 R. 파케리는 pRAM18dSFA 플라스미드 상에서 암호화된 적색 형광 단백질 mKATE를 발현함을 알 수 있다.

1. 컨포칼 현미경
   1. 단계 2.11 플라스크에서 세포 배양물을 재현탁하고 이러한 세포 배양물 100μL를 Hoechst 33342 용액 5μL와 혼합하여 어둠 속에서 RT에서 10-30분 동안 혼합합니다.
      참고: Hoechst 33342는 살아있는 진드기 세포 DNA에 결합하여 청색 형광을 방출하는 세포 투과성 핵 카운터스테인입니다.
   2. 혼합물 50μL를 5×g에서 3 분 동안 원 심분리하여 유리 현미경 슬라이드 상에 원심분리한다.
   3. 슬라이드에 증착된 세포 지점에 3μL의 1x PBS를 추가하고 커버 슬립으로 오버레이한 다음 컨포칼 현미경(60x 대물렌즈)으로 봅니다. 형광 이미징에 다음과 같은 여기 및 방출 파라미터를 사용하십시오 : 4', 6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌 (DAPI), 350 nm에서의 여기, 470 nm에서의 방출; 테트라 메틸로 다민 (TRITC)의 경우, 557 nm에서의 여기, 576 nm에서의 방출.

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결과

Giemsa 염색 후 광학 현미경으로 ISE6 세포에서 R. parkeri의 형태를 도 1에 나타내었다. 도 2에서, ISE6 세포에서 적색 형광 단백질을 발현하는 형질전환된 R. parkeri를 공초점 현미경을 사용하여 나타내었다. (A) 배양 7일째부터 (B) 10일째까지 ISE6 세포(청색, 핵에 해당)에서 형질전환된 R. 파케리(적색)의 감염률이 실?...

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토론

여기에서는 전기 천공을 사용하여 셔틀 플라스미드 pRAM18dSFA에 암호화된 외인성 DNA를 리케차에 도입하는 방법을 시연합니다. 이 절차에서, 무세포 리케차는 숙주 세포로부터 정제되고, 리케차 셔틀 벡터로 형질전환되고, 감염을 위해 진드기 세포 상으로 방출되었다. 또한 진드기 세포에서 적색 형광 단백질 발현 R. parkeri 를 검출하기 위한 공초점 면역형광 절차가 설명되어 있습니다. 유사한...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette	Bio-Rad	1652083
2 μm pore size filter	GE Healthcare Life Sciences Whatman	6783-2520
5 mL Luer-lock syringe	BD	309646
60-90 silicon carbide grit	LORTONE, inc	591-056
absolute methanol	Fisher Scientific	A457-4
Bacto tryptose phosphate broth	BD	260300
Cytospin centrifuge Cytospin4	Thermo Fisher Scientific	A78300003	The rotor is detachable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)	QIAGEN	12362	used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet	Perfector Scientific	TP03-5301
fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108	The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS	Bio-Rad	165-2105 & 165-2110
hemocytometer	Thermo Fisher Scientific	267110
HEPES	Millipore-Sigma	H4034
ImageJ Fiji	National Institute of Health		raw image editing
KaryoMAX Giemsa stain	Gibco	2021-10-30
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	41300039
lipoprotein concentrate	MP Biomedicals	191476
Nikon Diaphot	Nikon		epifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent	Thermo Fisher Scientific	R37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope	Olympus
Petroff-Hausser Counting Chamber	Hausser Scientific	Chamber 3900
sodium bicarbonate	Millipore-Sigma	S5761
Vortex	Fisher Vortex Genie 2	12-812