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Resumen

La electroporación es un método rápido y ampliamente adoptado para introducir ADN exógeno en el género Rickettsia. Este protocolo proporciona un método de electroporación útil para la transformación de bacterias intracelulares obligadas en el género Rickettsia.

Resumen

Las rickettsiosis son causadas por una amplia gama de bacterias intracelulares obligadas pertenecientes al género Rickettsia que pueden transmitirse a huéspedes vertebrados a través de la picadura de artrópodos vectores infectados. Hasta la fecha, las rickettsiosis epidémicas emergentes o reemergentes siguen siendo un riesgo para la salud pública debido a la dificultad en el diagnóstico, ya que los métodos de diagnóstico son limitados y no están estandarizados o universalmente accesibles. El diagnóstico erróneo resultante de la falta de reconocimiento de los signos y síntomas puede dar lugar a un retraso en el tratamiento con antibióticos y a resultados de salud deficientes. Una comprensión integral de las características de la rickettsia mejoraría en última instancia el diagnóstico clínico, la evaluación y el tratamiento con un mejor control y prevención de la enfermedad.

Los estudios funcionales de los genes rickettsiales son cruciales para comprender su papel en la patogénesis. Este artículo describe un procedimiento para la electroporación de la cepa de Rickettsia parkeri Tate's Hell con el vector lanzadera pRAM18dSFA y la selección de R. parkeri transformado en cultivo de células de garrapatas con antibióticos (espectinomicina y estreptomicina). También se describe un método para la localización de R. parkeri transformado en células de garrapatas utilizando microscopía de inmunofluorescencia confocal, una técnica útil para verificar la transformación en líneas celulares vectoriales. Enfoques similares también son adecuados para la transformación de otras rickettsiae.

Introducción

Las rickettsiosis son causadas por una amplia gama de bacterias intracelulares obligadas que pertenecen al género Rickettsia (familia Rickettsiaceae, orden Rickettsiales). El género Rickettsia se clasifica en cuatro grupos principales basados en características filogenéticas1,2: el grupo de fiebre manchada (SFG), que contiene aquellas rickettsias que causan las rickettsias transmitidas por garrapatas más graves y fatales (por ejemplo, Rickettsia rickettsii, el agente causante de la fiebre maculosa de las Montañas Rocosas), el grupo del tifus (TG, por ejemplo, Rickettsia prowazekii, el agente del tifus epidémico), el grupo de transición (TRG, por ejemplo, Rickettsia felis, el agente causante de la fiebre maculosa transmitida por pulgas) y el grupo ancestral (AG, por ejemplo, Rickettsia bellii).

Entre las enfermedades transmitidas por vectores más antiguas conocidas, las rickettsiosis se adquieren principalmente después de la transmisión de los patógenos a través de las picaduras de artrópodos vectores infectados, incluyendo garrapatas, pulgas, piojos y ácaros 3,4. Aunque el descubrimiento de antibióticos efectivos mejoró los resultados del tratamiento, las rickettsiosis epidémicas emergentes y reemergentes continúan desafiando las estrategias tradicionales de prevención y control. Por lo tanto, una comprensión integral de las interacciones rickettsia / huésped / vector establecería en última instancia una base sólida para desarrollar nuevos enfoques para prevenir y curar estas enfermedades antiguas.

En la naturaleza, la transferencia horizontal de genes (HGT) en bacterias ocurre a través de la conjugación, transducción y transformación5. La transformación bacteriana in vitro utiliza estos conceptos de HGT, aunque la naturaleza intracelular de rickettsiae presenta algunos desafíos. Las condiciones de crecimiento restringidas y los sistemas de conjugación y transducción poco conocidos en diferentes especies de rickettsias han impedido la aplicación de métodos de conjugación y transducción en rickettsias 6,7,8. En comparación con otros géneros bacterianos intracelulares obligados (por ejemplo, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma y Ehrlichia), el género Rickettsia difiere con respecto a las estrategias de crecimiento y replicación dentro del citoplasma celular, lo que impone desafíos específicos a la modificación genética de rickettsiae debido a sus características únicas de estilo de vida9.

El obstáculo inicial a superar al intentar la modificación genética de rickettsiae es lograr una transformación exitosa. Por lo tanto, diseñar un enfoque factible con alta eficiencia de transformación sería extremadamente valioso para desarrollar herramientas genéticas para rickettsiae. Aquí, nos centramos en la electroporación, un método de transformación ampliamente reconocido que se ha utilizado para introducir ADN exógeno con éxito en varias especies de rickettsiae, incluyendo Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii y Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.

Este artículo describe un procedimiento para la electroporación de la cepa Tate's Hell de R. parkeri (accesición: GCA_000965145.1) con el vector lanzadera pRAM18dSFA derivado del plásmido pRAM18 de la cepa AaR/SC de Rickettsia amblyommatis diseñado para codificar mKATE, una proteína fluorescente de color rojo lejano, y aadA, que confiere resistencia a la espectinomicina y la estreptomicina13,15,20. Los R. parkeri transformados son viables y se mantienen establemente bajo selección de antibióticos en líneas celulares de garrapatas. Además, mostramos que la localización de R. parkeri transformado en células vivas de garrapatas mediante microscopía confocal se puede utilizar para evaluar la calidad de las tasas de transformación en líneas celulares vectoriales.

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Protocolo

1. Propagación y purificación de R. parkeri a partir de cultivo de células de garrapatas

NOTA: Todos los procedimientos de cultivo celular deben realizarse en un gabinete de bioseguridad de clase II.

  1. Preparando R. parkeri-células de garrapatas infectadas
    1. Cultivar células ISE6 en matraces de cultivo celular de 25 cm 2 a 34 °C en 5 ml de L15C300 medio17, suplementado con 5%de suero fetal bovino (FBS), 5% de caldo de fosfato de triptosa (TPB) y 0,1% de concentrado de lipoproteínas (LPC).
      NOTA: ISE6 (Ixodes scapularis embryo-derived cell line) es una línea celular de garrapata ampliamente utilizada en muchos laboratorios y, por lo tanto, es un modelo esencial para estudiar las interacciones garrapata-patógeno17,18,19. La tasa de crecimiento de las células ISE6 es más lenta que la de las células de mamíferos, con un tiempo de duplicación de la población de ≥72 h. Por ejemplo, las células ISE6 subcultivadas a partir de un cultivo 100% confluente en una proporción de 1:5 tardarán de 3 a 4 semanas en recuperar el 100% de confluencia. Las células ISE6 sanas generalmente se redondearán con numerosos filamentos adheridos17.
    2. Cuente las células ISE6 con un hemocitómetro bajo un microscopio óptico. Usar a una concentración de ~106 células/ml (100% confluente).
      1. Enjuagar suavemente las células del matraz con medio y dispersar las células pipeteando para generar una suspensión celular homogénea. Agregue 20 μL de suspensión celular entre el hemocitómetro y cubra el vidrio para contar las células con un hemocitómetro.
    3. Añadir R. parkeri 20 de tipo silvestre libre de células hospedadoras (número medio: 5 × 10 7-10 × 107) a los cultivos celulares ISE6 en matraces de cultivo celular de 25 cm2. Incubar cultivos celulares de R. parkeri infectados a 34 °C en 5 ml de medio completo compuesto por medio L15C300, 10% FBS, 5% TPB, 0,1% LPC, 0,25% bicarbonato de sodio (NaHCO3) y 25 mM HEPES hasta que el 90%-100% de las células estén infectadas.
      NOTA: La tasa de infección de R. parkeri en las células ISE6 está determinada por la tinción de Giemsa, y el tiempo de incubación para alcanzar el 90% -100% de infección varía de 5 días a 7 días en promedio.
    4. Determinar la tasa de infección a través de la tinción de Giemsa.
      1. En el gabinete de bioseguridad, resuspender los cultivos celulares infectados y transferir 50 μL de la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
      2. Diluir la suspensión con medio completo (dilución 1:5) y centrifugar 100 μL en portaobjetos de microscopio de vidrio utilizando una centrífuga a 113 × g durante 5 min. Para mantener vivo R. parkeri contenido, use una centrífuga con un rotor sellado que esté diseñado para ser retirado de la centrífuga. Esto permite el transporte del rotor sellado dentro y fuera del capó.
        NOTA: Como los R. parkeri todavía están vivos antes de la centrifugación, la muestra debe contenerse hasta que se elimine la rickettsia. Por lo tanto, la centrífuga utilizada para hacer girar el cultivo de R. parkeri sobre la corredera debe tener un rotor sellado que esté diseñado para ser levantado fuera de la centrífuga. Con el rotor en la campana de flujo laminar, cargue las muestras en el conjunto de portaobjetos de embudo-microscopio, vuelva a sellar el rotor y vuelva a colocar el rotor sellado en la centrífuga. Luego, encienda la centrífuga y las muestras se depositan en los portaobjetos del microscopio. Una vez finalizada la carrera, retire el rotor sellado de la centrífuga y colóquelo en la campana de flujo laminar. Allí, abra la tapa del rotor y descargue el conjunto de portaobjetos de embudo-microscopio dentro del capó. Una vez seco, sumerja los portaobjetos del microscopio de vidrio en metanol absoluto, que mata a todos los patógenos. Los embudos y los portadores metálicos se sumergen en DMQ diluido, lo que mata a R. parkeri.
      3. Seque al aire los portaobjetos y fíjelos en metanol absoluto durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).
      4. Manchar los portaobjetos con tinción de Giemsa (4% en tampón de Sørenson, pH 6,6) durante 30 min a 37 °C y enjuagar con agua durante 5 s.
      5. Determinar el porcentaje de infección (número de células infectadas con rickettsiae/100 células) mediante microscopía óptica.
        NOTA: La Figura 1 muestra los resultados típicos de la tinción de Giemsa.
  2. Preparación de R. parkeri libre de células
    NOTA: Cuando el 90%-100% de las células en el cultivo están infectadas, las rickettsias deben aislarse de las células ISE6 y se debe realizar la electroporación.
    1. Agregue grano de carburo de silicio estéril 60-90 a tubos de microcentrífuga estériles de 2 ml a un volumen de aproximadamente 0,2 ml.
    2. Extraer 2 ml de medio de cultivos infectados con R. parkeri al 100% (paso 1.1.3) y resuspender las células en los 3 ml restantes de medio.
    3. Transfiera partes iguales de esta suspensión a los tubos preparados en el paso 1.2.1.
    4. Vórtice cada tubo a alta velocidad durante 30 s y luego coloque los tubos sobre hielo. Deje que la arena se asiente en segundos por gravedad.
    5. En un gabinete de bioseguridad de clase II, tenga lista una jeringa Luer-lock estéril de 5 ml con el émbolo extendido y el extremo del émbolo asegurado en una base de poliestireno para tubos cónicos de 15 ml.
    6. Utilizando una punta de pipeta de barrera estéril de 1 ml instalada en un pipete adecuado, retire el sobrenadante del lisado celular vórtice del tubo, teniendo cuidado de no aspirar ningún grano. Inserte la punta de la pipeta en la abertura del cubo de la jeringa y expulse el contenido en la jeringa con una presión suave. Alternativamente, utilice una pipeta estéril Pasteur de barrera de 2 ml operada con una bombilla de goma.
    7. Coloque un filtro esterilizado de tamaño de poro de 2 μm en el cubo de la jeringa y filtre el cultivo de R. parkeri del paso 1.2.6 en tubos estériles de 1,5 ml.
    8. Recoger el R. parkeri por centrifugación a 13.600 × g a 4 °C durante 5 min, y desechar el sobrenadante.
    9. Vuelva a suspender el pellet en 1,2 ml de sacarosa helada de 300 mM y centrifugar de nuevo a 13.600 × g a 4 °C durante 5 min. Repita la resuspensión y centrifugación para un total de dos lavados de sacarosa.
    10. Combine los gránulos de R. parkeri en un tubo de microcentrífuga refrigerado y estéril de 1,5 ml en 50 μL de sacarosa helada de 300 mM por transformación. Como un matraz de 25 cm2 de R. parkeri proporciona suficientes rickettsias para dos o tres transformaciones, añadir 100-150 μL de sacarosa fría de 300 mM.
      NOTA: Si se desea, el número de rickettsias se puede calcular utilizando una cámara de conteo de Petroff-Hausser. Cuando se utiliza una inoculación inicial de 5 × 107 -10 × 10 7 R. parkeri libre de células, tomará 5-7 días en promedio alcanzar el 90% -100% de infección, produciendo aproximadamente 5 × 107-10 × 1010 R. parkeri libre de células.
    11. Resuspenda suavemente el pellet pipeteando hasta que se disperse completamente. Dividir la muestra en porciones de 50 μL en tubos de microcentrífuga refrigerados y estériles de 1,5 ml.
      NOTA: Si se desea, la viabilidad rickettsial puede evaluarse mediante citometría de flujo después de la tinción con un colorante fluorescente 21.

2. Transformación de R. parkeri con el plásmido pRAM18dSFA

  1. En hielo, añadir 3 μg de pRAM18dSFA ADN plásmido libre de endotoxinas13,15,20 a cada tubo que contenga 50 μL de suspensión de R. parkeri y agitar la mezcla con la punta de la pipeta suave pero completamente.
    NOTA: Al preparar ADN plásmido, utilice un kit de purificación que incluya un paso de eliminación de endotoxinas para obtener ADN plásmido libre de endotoxinas23. Encontramos que un rango de concentraciones de plásmidos de entre 1 μg y 3 μg por 50 μL de suspensión de R. parkeri dio lugar a transformaciones exitosas, mientras que el aumento de la cantidad de plásmido a 10 μg inhibió la transformación.
  2. Transfiera la mezcla anterior de ADN y R. parkeri a una cubeta de electroporación refrigerada y estéril de 0,1 cm (golpee suavemente la cubeta hasta que la mezcla se distribuya uniformemente) y déjela reposar en hielo durante 10-30 minutos.
  3. Retire el medio de un cultivo 100% confluente de células ISE6 y resuspenda las capas celulares en 1,5 ml de medio fresco con NaHCO 3 y tampón HEPES (descrito anteriormente en el paso 1.1.3). Utilice un matraz de células confluentes por transformación.
  4. Transfiera las células resuspendidas a un tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml (un tubo por cada matraz de 25 cm2 de células ISE6).
  5. Electroporar la mezcla de R. parkeri/pRAM18dSFA a 1,8 KV, 200 ohmios, 25 μF utilizando un electroporador.
  6. Con una pipeta de transferencia de punta fina estéril y extendida, transfiera una pequeña cantidad de la suspensión de células ISE6 (paso 2.4) a la cubeta y tire suavemente del líquido hacia arriba y hacia abajo para lavar la cubeta. Transfiera la mezcla al tubo de microcentrífuga de 2 ml que contiene el resto de la suspensión celular ISE6 y mezcle suavemente la mezcla de transformación con las células.
  7. Centrifugar las muestras transformadas a 700 × g durante 2 min a RT, y luego aumentar la velocidad de centrifugación a 13.600 × g durante 1 min más a RT.
    NOTA: Las dos velocidades de centrifugación promueven la unión rickettsial y la entrada en las células: 700 × g se utilizan para tirar hacia abajo de las células ISE6, mientras que 13.600 × g se utilizan para tirar hacia abajo de las rickettsias.
  8. Dejar reposar las muestras a RT o 34 °C durante 15 min a 1 h.
  9. Resuspender los transformadores (dos o tres) en células ISE6 con una punta de pipeta de barrera estéril de 2 ml instalada en una pipeta y transferir a dos o tres matraces de cultivo celular de 25cm2 que contengan 3,5 ml de medio fresco con tampón NaHCO3 y HEPES. Alternativamente, utilice una pipeta estéril Pasteur de barrera de 2 ml operada con una bombilla de goma.
  10. Mece los matraces para esparcir la mezcla uniformemente y luego incubar a 34 °C.
  11. Después de 16-24 h, añadir 10 μL de espectinomicina (50 mg/ml) y 10 μL de estreptomicina (50 mg/ml) a cada matraz en la etapa 2.10.

3. Observación del R. parkeri transformado

NOTA: Utilice un microscopio de epifluorescencia con filtros de rodamina/TRITC para observar los matraces preparados en el paso 2.11 después de 3-7 días. Una vez que las placas son evidentes en los cultivos (5-14 días), se puede ver R. parkeri transformado que expresa la proteína fluorescente roja mKATE, codificada en el plásmido pRAM18dSFA.

  1. Microscopía confocal
    1. Resuspender los cultivos celulares de los matraces del paso 2.11 y mezclar 100 μL de estos cultivos celulares con 5 μL de solución Hoechst 33342 durante 10-30 min a RT en la oscuridad.
      NOTA: Hoechst 33342 es una contratinción nuclear permeable a las células que se une al ADN de las células vivas de garrapatas y emite fluorescencia azul.
    2. Centrifugar 50 μL de la mezcla en portaobjetos de microscopio de vidrio utilizando una centrífuga a 5 × g durante 3 min.
    3. Agregue 3 μL de 1x PBS al punto de células depositadas en el portaobjetos, superponga con un cubreobjetos y vea con un microscopio confocal (objetivo 60x). Utilice los siguientes parámetros de excitación y emisión para imágenes fluorescentes: para 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), excitación a 350 nm, emisión a 470 nm; para tetrametilrodamina (TRITC), excitación a 557 nm, emisión a 576 nm.

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Resultados

La morfología de R. parkeri en células ISE6 bajo un microscopio óptico después de la tinción de Giemsa se muestra en la Figura 1. En la Figura 2, R. parkeri transformada que expresa proteína de fluorescencia roja en células ISE6 se muestra mediante microscopía confocal. Hay un aumento sustancial en la tasa de infección de R. parkeri transformado (rojo) en células ISE6 (azul, corresponde a los núcleos) desde (A

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Discusión

Aquí, demostramos un método para introducir ADN exógeno codificado en el plásmido lanzadera pRAM18dSFA en rickettsiae utilizando electroporación. En este procedimiento, las rickettsias libres de células se purificaron a partir de células huésped, se transformaron con un vector lanzadera rickettsial y se liberaron en las células de garrapatas para la infección. También se describe un procedimiento de inmunofluorescencia confocal para detectar R. parkeri que expresa la proteína de fluorescencia roja en...

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Divulgaciones

No se declaran conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a Timothy J. Kurtti y Benjamin Cull por sus perspicaces discusiones y sugerencias. Este estudio fue apoyado financieramente por una subvención a U.G.M. del NIH (2R01AI049424) y una subvención a U.G.M. de la Estación Experimental Agrícola de Minnesota (MIN-17-078).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvetteBio-Rad1652083
2 μm pore size filter GE Healthcare Life Sciences Whatman6783-2520
5 mL Luer-lock syringe BD309646
60-90 silicon carbide grit LORTONE, inc 591-056
absolute methanol Fisher ScientificA457-4
Bacto tryptose phosphate broth BD260300
Cytospin centrifuge Cytospin4Thermo Fisher ScientificA78300003The rotor is detachable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)QIAGEN12362used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet Perfector ScientificTP03-5301
fetal bovine serum Gemini Bio900-108The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUSBio-Rad165-2105 & 165-2110
hemocytometerThermo Fisher Scientific267110
HEPESMillipore-SigmaH4034
ImageJ FijiNational Institute of Healthraw image editing
KaryoMAX Giemsa stain Gibco 2021-10-30
Leibovitz's L-15 mediumGibco41300039
lipoprotein concentrate MP Biomedicals191476
Nikon DiaphotNikonepifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent Thermo Fisher ScientificR37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope Olympus
Petroff-Hausser Counting ChamberHausser Scientific Chamber 3900
sodium bicarbonateMillipore-SigmaS5761
VortexFisher Vortex Genie 212-812

Referencias

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  2. Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
  3. Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
  4. Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
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