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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'elettroporazione è un metodo rapido e ampiamente adottato per introdurre DNA esogeno nel genere Rickettsia. Questo protocollo fornisce un utile metodo di elettroporazione per la trasformazione di batteri intracellulari obbligati nel genere Rickettsia.

Abstract

Le rickettsiosi sono causate da una vasta gamma di batteri intracellulari obbligati appartenenti al genere Rickettsia che possono essere trasmessi agli ospiti vertebrati attraverso il morso di vettori artropodi infetti. Ad oggi, le rickettsiosi epidemiche emergenti o riemergenti rimangono un rischio per la salute pubblica a causa della difficoltà nella diagnosi, poiché i metodi diagnostici sono limitati e non standardizzati o universalmente accessibili. Una diagnosi errata derivante dalla mancanza di riconoscimento dei segni e dei sintomi può causare un trattamento antibiotico ritardato e scarsi risultati di salute. Una comprensione completa delle caratteristiche della rickettsia migliorerebbe in definitiva la diagnosi clinica, la valutazione e il trattamento con un migliore controllo e prevenzione della malattia.

Gli studi funzionali dei geni rickettsiali sono cruciali per comprendere il loro ruolo nella patogenesi. Questo articolo descrive una procedura per l'elettroporazione del ceppo di Rickettsia parkeri Tate's Hell con il vettore shuttle pRAM18dSFA e la selezione di R. parkeri trasformato in coltura di cellule di zecca con antibiotici (spectinomicina e streptomicina). Viene anche descritto un metodo per la localizzazione di R. parkeri trasformato in cellule di zecche utilizzando la microscopia a immunofluorescenza confocale, una tecnica utile per controllare la trasformazione in linee cellulari vettoriali. Approcci simili sono adatti anche per la trasformazione di altre rickettsiae.

Introduzione

Le rickettsiosi sono causate da una vasta gamma di batteri intracellulari obbligati che appartengono al genere Rickettsia (famiglia Rickettsiaceae, ordine Rickettsiales). Il genere Rickettsia è classificato in quattro gruppi principali basati sulle caratteristiche filogenetiche1,2: il gruppo della febbre maculata (SFG), che contiene quelle rickettsiae che causano le rickettsiosi trasmesse dalle zecche più gravi e fatali (ad esempio, Rickettsia rickettsii, l'agente eziologico della febbre maculata delle Montagne Rocciose), il gruppo tifo (TG, ad esempio, Rickettsia prowazekii, l'agente del tifo epidemico), il gruppo di transizione (TRG, ad esempio, Rickettsia felis, l'agente eziologico della febbre maculata trasmessa dalle pulci) e il gruppo ancestrale (AG, ad esempio, Rickettsia bellii).

Tra le più antiche malattie trasmesse da vettori conosciute, le rickettsiosi sono acquisite principalmente in seguito alla trasmissione dei patogeni attraverso i morsi di vettori di artropodi infetti, tra cui zecche, pulci, pidocchi e acari 3,4. Sebbene la scoperta di antibiotici efficaci abbia migliorato i risultati del trattamento, le rickettsiosi epidemiche emergenti e riemergenti continuano a sfidare le tradizionali strategie di prevenzione e controllo. Pertanto, una comprensione completa delle interazioni rickettsia / ospite / vettore stabilirebbe in definitiva una solida base per lo sviluppo di nuovi approcci per prevenire e curare queste antiche malattie.

In natura, il trasferimento genico orizzontale (HGT) nei batteri avviene attraverso la coniugazione, la trasduzione e la trasformazione5. La trasformazione batterica in vitro utilizza questi concetti di HGT, sebbene la natura intracellulare delle rickettsiae presenti alcune sfide. Le condizioni di crescita limitate e i sistemi di coniugazione e trasduzione poco conosciuti in diverse specie di rickettsiae hanno impedito l'applicazione di metodi di coniugazione e trasduzione nelle rickettsiae 6,7,8. Rispetto ad altri generi batterici intracellulari obbligati (ad esempio, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma ed Ehrlichia), il genere Rickettsia differisce per quanto riguarda le strategie di crescita e replicazione all'interno del citoplasma cellulare, che impone sfide specifiche alla modificazione genetica delle rickettsiae a causa delle loro caratteristiche uniche dello stile di vita9.

L'ostacolo iniziale da superare quando si tenta la modificazione genetica delle rickettsiae è quello di ottenere una trasformazione di successo. Pertanto, progettare un approccio fattibile con un'elevata efficienza di trasformazione sarebbe estremamente prezioso per lo sviluppo di strumenti genetici per le rickettsiae. Qui, ci concentriamo sull'elettroporazione, un metodo di trasformazione ampiamente riconosciuto che è stato utilizzato per introdurre con successo il DNA esogeno in diverse specie di rickettsiae, tra cui Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii e Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.

Questo articolo descrive una procedura per l'elettroporazione del ceppo di R. parkeri Tate's Hell (accession: GCA_000965145.1) con il vettore shuttle pRAM18dSFA derivato dal plasmide Rickettsia amblyommatis AaR/SC pRAM18 progettato per codificare mKATE, una proteina fluorescente di colore rosso lontano, e aadA, conferendo resistenza alla spectinomicina e alla streptomicina13,15,20. R. parkeri trasformato sono vitali e stabilmente mantenuti sotto selezione antibiotica in linee cellulari di zecche. Inoltre, dimostriamo che la localizzazione di R. parkeri trasformato in cellule di zecche vive tramite microscopia confocale può essere utilizzata per valutare la qualità dei tassi di trasformazione in linee cellulari vettoriali.

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Protocollo

1. Propagazione e purificazione di R. parkeri da coltura di cellule di zecca

NOTA: Tutte le procedure di coltura cellulare devono essere eseguite in un armadio di biosicurezza di classe II.

  1. Preparazione R. parkeri-cellule di zecche infette
    1. Coltivare cellule ISE6 in flaconi di coltura cellulare da 25 cm2 a 34 °C in 5 ml di L15C300 medium17, integrati con siero bovino fetale (FBS) al 5%, brodo di fosfato di triptosio (TPB) al 5% e concentrato di lipoproteine allo 0,1% (LPC).
      NOTA: ISE6 (linea cellulare derivata dall'embrione di Ixodes scapularis) è una linea cellulare di zecche ampiamente utilizzata in molti laboratori ed è, quindi, un modello essenziale per studiare le interazioni zecche-patogeni17,18,19. Il tasso di crescita delle cellule ISE6 è più lento di quello delle cellule di mammifero, con un tempo di raddoppio della popolazione di ≥72 ore. Ad esempio, le cellule ISE6 subcoltivate da una coltura confluente al 100% con un rapporto di 1:5 impiegheranno 3-4 settimane per recuperare la confluenza al 100%. Le cellule ISE6 sane saranno generalmente arrotondate con numerosi filamenti aderenti17.
    2. Contare le cellule ISE6 con un emocitometro al microscopio ottico. Utilizzare ad una concentrazione di ~106 cellule/ml (100% confluente).
      1. Risciacquare delicatamente le cellule dal matraccio con mezzo e disperdere le cellule mediante pipettaggio per generare una sospensione cellulare omogenea. Aggiungere 20 μL di sospensione cellulare tra l'emocitometro e il vetro di copertura per contare le cellule utilizzando un emocitometro.
    3. Aggiungere R. parkeri 20 wild-type privo di cellule ospiti (numero medio: 5 × 10 7-10 × 107) alle colture cellulari ISE6 in flaconi di coltura cellulare da 25 cm2. Incubare colture cellulari infette di R. parkeri a 34 °C in 5 ml di terreno completo costituito da terreno L15C300, 10% FBS, 5% TPB, 0,1% LPC, 0,25% bicarbonato di sodio (NaHCO3) e 25 mM HEPES fino a quando il 90% -100% delle cellule sono infette.
      NOTA: Il tasso di infezione di R. parkeri nelle cellule ISE6 è determinato dalla colorazione di Giemsa e il tempo di incubazione per raggiungere il 90% -100% di infezione varia da 5 giorni a 7 giorni in media.
    4. Determinare il tasso di infezione tramite colorazione Giemsa.
      1. Nell'armadio di biosicurezza, risospendere le colture cellulari infette e trasferire 50 μL della sospensione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
      2. Diluire la sospensione con mezzo completo (diluizione 1:5) e centrifugare 100 μL su vetrini da microscopio con una centrifuga a 113 × g per 5 minuti. Per mantenere vivo R. parkeri contenuto, utilizzare una centrifuga con un rotore sigillato progettato per essere rimosso dalla centrifuga. Ciò consente il trasporto del rotore sigillato dentro e fuori dalla cappa.
        NOTA: Poiché i R. parkeri sono ancora vivi prima della centrifugazione, il campione deve essere contenuto fino a quando la rickettsia non viene uccisa. Pertanto, la centrifuga utilizzata per far girare la coltura di R. parkeri sul vetrino deve avere un rotore sigillato progettato per essere sollevato dalla centrifuga. Con il rotore nella cappa a flusso laminare, caricare i campioni nel gruppo vetrino imbuto-microscopio, risigillare il rotore e riposizionare il rotore sigillato nella centrifuga. Quindi, accendere la centrifuga e i campioni vengono depositati sui vetrini del microscopio. Al termine della corsa, rimuovere il rotore sigillato dalla centrifuga e posizionarlo nella cappa a flusso laminare. Lì, aprire il coperchio del rotore e scaricare il gruppo vetrino imbuto-microscopio all'interno del cofano. Una volta asciutto, immergere i vetrini del microscopio in metanolo assoluto, che uccide tutti gli agenti patogeni. Gli imbuti e i supporti metallici sono immersi in DMQ diluito, che uccide R. parkeri.
      3. Asciugare all'aria i vetrini e fissare in metanolo assoluto per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
      4. Colorare i vetrini con la colorazione Giemsa (4% nel tampone di Sørenson, pH 6,6) per 30 minuti a 37 °C e risciacquare con acqua per 5 s.
      5. Determinare la percentuale di infezione (numero di cellule infettate da rickettsiae/100 cellule) mediante microscopia ottica.
        NOTA: la Figura 1 mostra i risultati tipici della colorazione di Giemsa.
  2. Preparazione di R. parkeri senza cellule
    NOTA: Quando il 90% -100% delle cellule nella coltura sono infette, le rickettsiae devono essere isolate dalle cellule ISE6 e deve essere eseguita l'elettroporazione.
    1. Aggiungere graniglia sterile di carburo di silicio 60-90 a provette sterili da microcentrifuga da 2 ml per un volume di circa 0,2 ml.
    2. Rimuovere 2 mL di terreno da colture infette da R. parkeri al 100% (fase 1.1.3) e risospendere le cellule nei restanti 3 mL di terreno.
    3. Trasferire parti uguali di questa sospensione in tubi preparati al punto 1.2.1.
    4. Vortice ogni tubo ad alta velocità per 30 s e poi posizionare i tubi sul ghiaccio. Lascia che la grana si depositi in pochi secondi per gravità.
    5. In un armadio di biosicurezza di classe II, avere una siringa Luer-lock sterile da 5 mL pronta con lo stantuffo esteso e l'estremità dello stantuffo fissata in una base di polistirene per tubi conici da 15 ml.
    6. Utilizzando una punta di pipetta barriera sterile da 1 mL montata su un pipettor adatto, rimuovere dal tubo il surnatante del lisato cellulare a vortice, facendo attenzione a non aspirare alcuna graniglia. Inserire la punta del pipet nell'apertura del mozzo della siringa ed espellere il contenuto nella siringa con una leggera pressione. In alternativa, utilizzare una pipetta Pasteur sterile, barriera da 2 mL azionata con un bulbo di gomma.
    7. Collegare un filtro sterilizzato da 2 μm pori al mozzo della siringa e filtrare la coltura di R. parkeri dal punto 1.2.6 in tubi sterili da 1,5 ml.
    8. Raccogliere il R. parkeri mediante centrifugazione a 13.600 × g a 4 °C per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
    9. Risospendere il pellet in 1,2 mL di saccarosio ghiacciato da 300 mM e centrifugare nuovamente a 13.600 × g a 4 °C per 5 minuti. Ripetere la risospensione e la centrifugazione per un totale di due lavaggi di saccarosio.
    10. Unire i pellet di R. parkeri in un tubo di microcentrifuga refrigerato e sterile da 1,5 mL in 50 μL di saccarosio ghiacciato da 300 mM per trasformazione. Poiché un matraccio da 25 cm2 di R. parkeri fornisce abbastanza rickettsiae per due o tre trasformazioni, aggiungere 100-150 μL di 300 mM di saccarosio freddo.
      NOTA: Se lo si desidera, il numero di rickettsiae può essere calcolato utilizzando una camera di conteggio Petroff-Hausser. Quando si utilizza un'inoculazione iniziale di 5 × 107 -10 × 10 7 R. parkeri senza cellule, ci vorranno in media 5-7 giorni per raggiungere il 90% -100% di infezione, producendo circa 5 × 107-10 × 1010 R. parkeri senza cellule.
    11. Risospendere delicatamente il pellet mediante pipettaggio fino a quando non è completamente disperso. Dividere il campione in porzioni da 50 μL in provette da microcentrifuga sterili refrigerate da 1,5 ml.
      NOTA: Se lo si desidera, la vitalità rickettsiale può essere valutata mediante citometria a flusso dopo la colorazione con un colorante fluorescente 21.

2. Trasformazione di R. parkeri con il plasmide pRAM18dSFA

  1. Sul ghiaccio, aggiungere 3 μg di pRAM18dSFA plasmide DNA13,15,20 privo di endotossine a ciascuna provetta contenente 50 μL di sospensione di R. parkeri e mescolare la miscela con la punta del pipet delicatamente ma accuratamente.
    NOTA: Quando si prepara il DNA plasmide, utilizzare un kit di purificazione che includa una fase di rimozione delle endotossine per produrre DNA plasmidico privo di endotossine23. Abbiamo scoperto che un intervallo di concentrazioni di plasmidi compreso tra 1 μg e 3 μg per 50 μL di sospensione di R. parkeri ha portato a trasformazioni di successo, mentre l'aumento della quantità di plasmide a 10 μg ha inibito la trasformazione.
  2. Trasferire la suddetta miscela di DNA e R. parkeri in una cuvetta di elettroporazione fredda e sterile da 0,1 cm (picchiettare delicatamente la cuvetta fino a quando la miscela non è uniformemente distribuita) e lasciarla riposare sul ghiaccio per 10-30 minuti.
  3. Rimuovere il terreno da una coltura confluente al 100% di cellule ISE6 e risospendere gli strati cellulari in 1,5 ml di terreno fresco con NaHCO 3 e tampone HEPES (descritto sopra al punto 1.1.3). Utilizzare un matraccio di cellule confluenti per trasformazione.
  4. Trasferire le cellule risospese in una provetta sterile da microcentrifuga da 2 mL (una provetta per pallone da 25 cm2 di cellule ISE6).
  5. Elettroporare la miscela R. parkeri/pRAM18dSFA a 1,8 KV, 200 ohm, 25 μF usando un elettroporatore.
  6. Utilizzando un pipetta di trasferimento sterile ed estesa a punta fine, trasferire una piccola quantità della sospensione cellulare ISE6 (fase 2.4) nella cuvetta e tirare delicatamente il liquido su e giù per lavare la cuvetta. Trasferire la miscela nella provetta da microcentrifuga da 2 mL contenente il resto della sospensione cellulare ISE6 e mescolare delicatamente la miscela di trasformazione con le cellule.
  7. Centrifugare i campioni trasformati a 700 × g per 2 minuti a RT, quindi aumentare la velocità di centrifugazione a 13.600 × g per 1 minuto in più a RT.
    NOTA: Le due velocità di centrifugazione favoriscono il legame e l'ingresso del rickettsial nelle cellule: 700 × g vengono utilizzati per abbattere le cellule ISE6, mentre 13.600 × g vengono utilizzati per tirare giù le rickettsiae.
  8. Lasciare riposare i campioni a RT o 34 °C per 15 minuti a 1 ora.
  9. Risospendere i trasformanti (due o tre) in cellule ISE6 con una punta di pipetta barriera sterile da 2 mL montata su un pipettor e trasferirli in due o tre palloni dicoltura cellulare da 25 cm contenenti 3,5 ml di terreno fresco con tampone NaHCO3 e HEPES. In alternativa, utilizzare una pipetta Pasteur sterile, barriera da 2 mL azionata con un bulbo di gomma.
  10. Bagnare i palloni per distribuire uniformemente il composto e quindi incubare a 34 °C.
  11. Dopo 16-24 ore, aggiungere 10 μL di spectinomicina (50 mg/ml) e 10 μL di streptomicina (50 mg/ml) a ciascun matraccio al punto 2.10.

3. Osservazione del R . parkeri trasformato

NOTA: Utilizzare un microscopio a epifluorescenza con filtri a rhodamina/TRITC per osservare i palloni preparati al punto 2.11 dopo 3-7 giorni. Una volta che le placche sono evidenti nelle colture (5-14 giorni), si può vedere R. parkeri trasformato che esprime la proteina fluorescente rossa mKATE, codificata sul plasmide pRAM18dSFA.

  1. Microscopia confocale
    1. Risospendere le colture cellulari dai palloni della fase 2.11 e mescolare 100 μL di queste colture cellulari con 5 μL di soluzione di Hoechst 33342 per 10-30 minuti a RT al buio.
      NOTA: Hoechst 33342 è una controcolorazione nucleare permeabile alle cellule che si lega al DNA delle cellule di zecca vive ed emette fluorescenza blu.
    2. Centrifugare 50 μL della miscela su vetrini da microscopio con una centrifuga a 5 × g per 3 minuti.
    3. Aggiungere 3 μL di 1x PBS al punto delle cellule depositate sul vetrino, sovrapporre con un vetrino di copertura e visualizzare con un microscopio confocale (obiettivo 60x). Utilizzare i seguenti parametri di eccitazione ed emissione per l'imaging fluorescente: per 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), eccitazione a 350 nm, emissione a 470 nm; per la tetrametilrodamina (TRITC), eccitazione a 557 nm, emissione a 576 nm.

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Risultati

La morfologia di R. parkeri nelle cellule ISE6 al microscopio ottico dopo la colorazione di Giemsa è mostrata nella Figura 1. Nella Figura 2, R. parkeri trasformato che esprime la proteina di fluorescenza rossa nelle cellule ISE6 è mostrato usando la microscopia confocale. C'è un sostanziale aumento del tasso di infezione di R. parkeri trasformato (rosso) nelle cellule ISE6 (blu, corrisponde ai nuclei) da (A) giorno...

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Discussione

Qui, dimostriamo un metodo per introdurre DNA esogeno codificato sul plasmide shuttle pRAM18dSFA nelle rickettsiae utilizzando l'elettroporazione. In questa procedura, le rickettsiae prive di cellule sono state purificate dalle cellule ospiti, trasformate con un vettore navetta rickettsial e rilasciate sulle cellule delle zecche per l'infezione. Viene inoltre descritta una procedura di immunofluorescenza confocale per rilevare R. parkeri che esprime proteine di fluorescenza rossa nelle cellule delle zecche. Meto...

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Divulgazioni

Non vengono dichiarati conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Ringraziamo Timothy J. Kurtti e Benjamin Cull per le loro discussioni e suggerimenti perspicaci. Questo studio è stato sostenuto finanziariamente da una sovvenzione a U.G.M. dal NIH (2R01AI049424) e una sovvenzione a U.G.M. dalla Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvetteBio-Rad1652083
2 μm pore size filter GE Healthcare Life Sciences Whatman6783-2520
5 mL Luer-lock syringe BD309646
60-90 silicon carbide grit LORTONE, inc 591-056
absolute methanol Fisher ScientificA457-4
Bacto tryptose phosphate broth BD260300
Cytospin centrifuge Cytospin4Thermo Fisher ScientificA78300003The rotor is detachable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)QIAGEN12362used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet Perfector ScientificTP03-5301
fetal bovine serum Gemini Bio900-108The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUSBio-Rad165-2105 & 165-2110
hemocytometerThermo Fisher Scientific267110
HEPESMillipore-SigmaH4034
ImageJ FijiNational Institute of Healthraw image editing
KaryoMAX Giemsa stain Gibco 2021-10-30
Leibovitz's L-15 mediumGibco41300039
lipoprotein concentrate MP Biomedicals191476
Nikon DiaphotNikonepifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent Thermo Fisher ScientificR37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope Olympus
Petroff-Hausser Counting ChamberHausser Scientific Chamber 3900
sodium bicarbonateMillipore-SigmaS5761
VortexFisher Vortex Genie 212-812

Riferimenti

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