שיטת אלקטרופורציה להפיכת ריקטסיה spp. עם וקטור מעבורת המבטא חלבון פלואורסצנטי בקווי תאי קרציות

Summary

אלקטרופורציה היא שיטה מהירה שאומצה באופן נרחב להחדרת דנ"א אקסוגני לסוג ריקטסיה. פרוטוקול זה מספק שיטת אלקטרופורציה שימושית לטרנספורמציה של חיידקים תוך תאיים מהסוג Rickettsia.

Abstract

Rickettsioses נגרמים על ידי מגוון רחב של חיידקים תוך תאיים חובה השייכים לסוג Rickettsia שיכולים להיות מועברים למארחים בעלי חוליות באמצעות נשיכה של וקטורים פרוקי רגליים נגועים. נכון להיום, מגפות מתעוררות או מתעוררות מחדש נותרו סיכון לבריאות הציבור בשל הקושי באבחון, שכן שיטות האבחון מוגבלות ואינן סטנדרטיות או נגישות אוניברסלית. אבחנה שגויה הנובעת מחוסר הכרה של הסימנים והתסמינים עלולה לגרום לעיכוב בטיפול האנטיביוטי ולתוצאות בריאותיות לקויות. הבנה מקיפה של מאפייני ריקטסיה תשפר בסופו של דבר את האבחון, ההערכה והטיפול הקליניים עם שליטה ומניעה משופרות של המחלה.

מחקרים פונקציונליים של גנים ריקטסיאליים חיוניים להבנת תפקידם בפתוגנזה. מאמר זה מתאר הליך לאלקטרופורציה של זן ריקטסיה פארקרי טייט'ס גיהנום עם וקטור המעבורת pRAM18dSFA ובחירת R. parkeri מותמר בתרבית תאי קרציות עם אנטיביוטיקה (ספקטינומיצין וסטרפטומיצין). שיטה מתוארת גם ללוקליזציה של R. parkeri מותמר בתאי קרציות באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית קונפוקלית, טכניקה שימושית לבדיקת טרנספורמציה בקווי תאים וקטוריים. גישות דומות מתאימות גם לטרנספורמציה של ריקטסיות אחרות.

Introduction

ריקטסיוזות נגרמות על ידי מגוון רחב של חיידקים תוך-תאיים השייכים לסוג Rickettsia (משפחה Rickettsiaceae, סדר Rickettsiales). הסוג Rickettsia מסווג לארבע קבוצות עיקריות בהתבסס על מאפיינים פילוגנטיים^1,2: קבוצת קדחת מנומרת (SFG), המכילה את הריקטזיה הגורמת לריקטזיוזות החמורות והקטלניות ביותר (למשל, Rickettsia rickettsii, הסוכן הסיבתי של קדחת הרוקי מאונטיין), קבוצת הטיפוס (TG, למשל, Rickettsia prowazekii, הסוכן של טיפוס מגיפה), קבוצת המעבר (TRG, למשל, Rickettsia felis, הגורם הסיבתי של קדחת מנומרת המועברת על ידי פרעושים), וקבוצת האבות (AG, למשל, Rickettsia bellii).

בין המחלות העתיקות ביותר הידועות המועברות על ידי וקטורים, ריקטסיוזים נרכשים בעיקר בעקבות העברת הפתוגנים דרך עקיצות של וקטורים של פרוקי רגליים נגועים, כולל קרציות, פרעושים, כינים וקרדיות ^3,4. אף על פי שהגילוי של אנטיביוטיקה יעילה שיפר את תוצאות הטיפול, ריקטסיוזים של מגפות מתעוררות ומתעוררות מחדש ממשיכים לאתגר את אסטרטגיות המניעה והבקרה המסורתיות. לפיכך, הבנה מקיפה של אינטראקציות ריקטסיה/מארח/וקטור תיצור בסופו של דבר בסיס איתן לפיתוח גישות חדשות למניעה ולריפוי של מחלות עתיקות אלה.

בטבע, העברת גנים אופקית (HGT) בחיידקים מתרחשת באמצעות הצמדה, התמרה וטרנספורמציה⁵. טרנספורמציה של חיידקים במבחנה משתמשת במושגי HGT אלה, אם כי האופי התוך-תאי של ריקטסיה מציב כמה אתגרים. תנאי הגידול המוגבלים ומערכות ההצמדה וההתמרות שלא הובנו כהלכה במינים שונים של ריקטסיה מנעו את היישום של שיטות הצמדה והתמרות ב-rickettsiae ^6,7,8. בהשוואה לסוגים אחרים של חיידקים תוך-תאיים (למשל, כלמידיה, קוקסיאלה, אנאפלזמה וארליכיה), הסוג ריקטסיה שונה בכל הנוגע לאסטרטגיות הגדילה והשכפול בתוך הציטופלסמה התאית, מה שמטיל אתגרים ספציפיים לשינוי הגנטי של ריקטסיה בשל תכונות אורח החיים הייחודיות שלהם⁹.

המכשול הראשוני שיש להתגבר עליו כאשר מנסים לבצע את השינוי הגנטי של rickettsiae הוא להשיג טרנספורמציה מוצלחת. לפיכך, תכנון גישה ישימה עם יעילות טרנספורמציה גבוהה יהיה בעל ערך רב לפיתוח כלים גנטיים עבור rickettsiae. כאן אנו מתמקדים באלקטרופורציה, שיטת טרנספורמציה מוכרת באופן נרחב ששימשה להחדרת דנ"א אקסוגני בהצלחה למספר מינים של ריקטסיה, כולל ריקטסיה פרוואזקי, ריקטסיה טיפי, ריקטסיה קונורי, ריקטסיה פרקרי, ריקטסיה מונטננסיס, ריקטסיה בלי, ריקטסיה טווסי, וריקטסיה בוכנרי^10,11,12 ,^13,14,15,16.

מאמר זה מתאר הליך לאלקטרופורציה של זן R. parkeri Tate's Hell (הצטרפות: GCA_000965145.1) עם וקטור המעבורת pRAM18dSFA שמקורו בזן Rickettsia amblyommatis AaR/SC פלסמיד pRAM18 שתוכנן לקודד mKATE, חלבון פלואורסצנטי אדום רחוק, ו- aadA, המקנה עמידות לספקטינומיצין וסטרפטומיצין 13,15,20. R. parkeri שעברו טרנספורמציה הם ברי קיימא ומתוחזקים ביציבות תחת ברירה אנטיביוטית בקווי תאי הקרציות. בנוסף, אנו מראים כי לוקליזציה של R. parkeri מותמר בתאי קרציות חיות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית יכולה לשמש להערכת איכות קצבי הטרנספורמציה בקווי תאים וקטוריים.

Protocol

1. התפשטות וטיהור של R. parkeri מתרבית תאי קרציות

הערה: כל הליכי תרבית התאים יבוצעו בארון בטיחות ביולוגית מדרגה II.

1. הכנת R. parkeri-תאי קרציות נגועים
   1. לגדל תאי ISE6 בבקבוקי תרבית תאים^{בגודל 25} ס"מ בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס ב-5 מ"ל של L15C300 בינוני¹⁷, בתוספת 5% סרום בקר עוברי (FBS), 5% מרק טריפטוז פוספט (TPB) ו-0.1% תרכיז ליפופרוטאין (LPC).
      הערה: ISE6 (Ixodes scapularis קו תאים שמקורו בעובר) הוא קו תאי קרציות הנמצא בשימוש נרחב במעבדות רבות והוא, לפיכך, מודל חיוני לחקר אינטראקציות בין קרציות לפתוגן 17,18,19. קצב הגדילה של תאי ISE6 איטי יותר מזה של תאי יונקים, עם זמן הכפלת אוכלוסייה של ≥72 שעות. לדוגמה, לתאי ISE6 שעברו תת-תרבות מתרבית של 100% מפגש ביחס של 1:5 ייקח 3-4 שבועות להחזיר 100% מפגש. תאי ISE6 בריאים יהיו בדרך כלל מעוגלים עם חוטים נצמדים רבים¹⁷.
   2. ספרו את תאי ISE6 בעזרת המוציטומטר תחת מיקרוסקופ אור. יש להשתמש בריכוז של ~10⁶ תאים/מ"ל (100% מפגש).
      1. שטפו בעדינות את התאים מהבקבוקון עם מדיום ופזרו את התאים על ידי פיפטינג ליצירת תרחיף תאים הומוגני. הוסף 20 μL של תרחיף התא בין ההמוציטומטר לזכוכית כיסוי כדי לספור את התאים באמצעות המוציטומטר.
   3. הוסף צלוחיות מסוג R. parkeri 20 ללא תאים מארחים (מספר ממוצע: 5 × 10 7-10 × ^{10 7}) לתרביות התאים ISE6 בבקבוקונים של ^{25 ס"}מ 2 תרביות תאים. דגירה נגועה R. parkeri תרביות תאים ב 34 מעלות צלזיוס ב 5 מ"ל של מדיום שלם המורכב L15C300 בינוני, 10% FBS, 5% TPB, 0.1% LPC, 0.25% סודיום ביקרבונט (NaHCO₃), ו 25 mM HEPES עד 90%-100% של תאים נגועים.
      הערה: שיעור ההדבקה של R. parkeri בתאי ISE6 נקבע על ידי צביעת Giemsa, וזמן הדגירה להגיע לזיהום של 90%-100% נע בין 5 ימים ל-7 ימים בממוצע.
   4. לקבוע את שיעור ההדבקה באמצעות צביעת גימסה.
      1. בארון הבטיחות הביולוגית, יש להשעות את תרביות התאים הנגועים ולהעביר 50 מיקרו-ליטר מהמתלים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
      2. לדלל את המתלים עם מדיום שלם (דילול 1:5) וצנטריפוגה 100 μL על מיקרוסקופ זכוכית שקופיות באמצעות צנטריפוגה ב 113 × גרם במשך 5 דקות. כדי לשמור על R. parkeri חי, השתמש בצנטריפוגה עם רוטור אטום המיועד להסרה מהצנטריפוגה. זה מאפשר את הובלת הרוטור האטום פנימה והחוצה ממכסה המנוע.
         הערה: מכיוון שה-R. parkeri עדיין בחיים לפני הצנטריפוגה, יש להכיל את הדגימה עד להריגת הריקטזיה. לפיכך, הצנטריפוגה המשמשת לסיבוב תרבות R. parkeri על המגלשה חייבת להיות בעלת רוטור אטום המיועד להרמה מתוך הצנטריפוגה. עם הרוטור במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, טען את הדגימות למכלול שקופיות המשפך-מיקרוסקופ, אטם מחדש את הרוטור והנח את הרוטור האטום בחזרה לצנטריפוגה. לאחר מכן, הפעל את הצנטריפוגה, והדגימות מופקדות על שקופיות המיקרוסקופ. לאחר סיום הריצה, הסר את הרוטור האטום מהצנטריפוגה והנח אותו במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. שם, פתחו את מכסה הרוטור, ופרקו את מכלול השקופיות של המשפך-מיקרוסקופ בתוך מכסה המנוע. לאחר התייבשות, לטבול את מיקרוסקופ הזכוכית מחליק מתנול מוחלט, אשר הורג את כל הפתוגנים. המשפכים ונושאי המתכת שקועים ב- DMQ מדולל, שהורג את ר 'פארקרי.
      3. אוויר לייבש את המגלשות לתקן מתנול מוחלט במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      4. הכתימו את המגלשות בכתם Giemsa (4% בחיץ של Sørenson, pH 6.6) למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ושטפו במים במשך 5 שניות.
      5. קבע את אחוז ההדבקה (מספר התאים הנגועים בריקטזיה/100 תאים) על ידי מיקרוסקופיית אור.
         הערה: איור 1 מציג תוצאות אופייניות של כתמי Giemsa.
2. הכנת ר. פרקרי ללא תאים
   הערה: כאשר 90%-100% מהתאים בתרבית נגועים, יש לבודד את הריקטזיה מתאי ISE6 ולבצע אלקטרופורציה.
   1. הוסף חצץ סיליקון קרביד סטרילי 60-90 לצינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים של 2 מ"ל לנפח של כ-0.2 מ"ל.
   2. הסר 2 מ"ל של בינוני מתרביות נגועות ב- 100% R. parkeri (שלב 1.1.3) והושיע מחדש את התאים ב- 3 מ"ל הנותרים של המדיום.
   3. העבר חלקים שווים של מתלה זה לצינורות שהוכנו בשלב 1.2.1.
   4. מערבבים כל צינור במהירות גבוהה במשך 30 שניות ואז מניחים את הצינורות על קרח. תנו לחצץ לשקוע תוך שניות על ידי כוח הכבידה.
   5. בארון בטיחות ביולוגית מדרגה II, יש מזרק Luer-lock סטרילי של 5 מ"ל מוכן עם הבוכנה מורחבת וקצה הבוכנה מאובטח בבסיס פוליסטירן עבור צינורות חרוטיים של 15 מ"ל.
   6. באמצעות קצה פיפט מחסום סטרילי, 1 מ"ל המותאם לפיפטטור מתאים, הסר את הסופר-נטנט של התא המערבולת ליזאט מהצינור, תוך הקפדה שלא לשאוף לשום חצץ. הכנס את קצה הפיפט לפתח רכזת המזרק והוצא את התוכן לתוך המזרק בלחץ עדין. לחלופין, השתמש בפיפטה סטרילית, מחסום 2 מ"ל פסטר המופעל עם נורת גומי.
   7. חברו מסנן מעוקר בגודל נקבוביות של 2 מיקרומטר לרכזת המזרק וסננו את תרבית R. parkeri משלב 1.2.6 לצינורות סטריליים של 1.5 מ"ל.
   8. לאסוף את R. parkeri על ידי צנטריפוגה ב 13,600 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, ולהשליך את supernatant.
   9. השהה את הכדור ב-1.2 מ"ל של סוכרוז קר כקרח 300 מ"מ וצנטריפוגה שוב ב-13,600 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. חזור על החידוש והצנטריפוגה בסך הכל שתי שטיפות סוכרוז.
   10. שלבו את כדורי R. parkeri לצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר וסטרילי אחד בגודל 1.5 מ"ל ב-50 מיקרו-ליטר של סוכרוז קר כקרח של 300 מ"ל לכל טרנספורמציה. מכיוון שבקבוקון אחד בגודל²⁵ ס"מ 2 של R. parkeri מספק מספיק ריקטסיה לשתיים עד שלוש טרנספורמציות, הוסף 100-150 מיקרון של סוכרוז קר של 300 mM.
       הערה: אם תרצה, ניתן לחשב את מספר הריקטזיה באמצעות תא ספירה של פטרוף-האוזר. כאשר משתמשים בחיסון ראשוני של 5 × 10⁷ -10 × 10 7 R. parkeri ללא תאים, ייקח 5-7 ימים בממוצע להגיע לזיהום של 90%-100%, מה שמניב בערך 5 × 10^7-10 × ^{10 10} R. parkeri ללא תאים.
   11. יש למרוח בעדינות את הכדור על ידי פיפטינג עד לפיזור יסודי. חלקו את הדגימה לחלקים של 50 μL בצינורות מיקרוצנטריפוגה מקוררים וסטריליים של 1.5 מ"ל.
       הערה: אם תרצה, ניתן להעריך את הכדאיות הריקטסיאלית על ידי ציטומטריה של זרימה לאחר צביעה בצבע פלואורסצנטי ²¹.

2. טרנספורמציה של R. parkeri עם פלסמיד pRAM18dSFA

1. על הקרח, הוסיפו 3 מיקרוגרם של pRAM18dSFA DNA פלסמיד נטול אנדוטוקסין^13,15,20 לכל צינור המכיל ⁵⁰ μL של תרחיף R. parkeri וערבבו את התערובת עם קצה הפיפט בעדינות אך ביסודיות.
   הערה: בעת הכנת דנ"א פלסמיד, השתמש בערכת טיהור הכוללת שלב להסרת אנדוטוקסין כדי להפיק DNA פלסמיד²³ נטול אנדוטוקסין. מצאנו כי טווח של ריכוזי פלסמידים של בין 1 מיקרוגרם ל-3 מיקרוגרם לכל 50 μL של מתלה R. parkeri הביא לשינויים מוצלחים, בעוד שהגדלת כמות הפלסמיד ל-10 מיקרוגרם עיכבה את הטרנספורמציה.
2. מעבירים את התערובת הנ"ל של דנ"א ו-R. parkeri לתוך קובט אלקטרופורציה מקורר וסטרילי בגודל 0.1 ס"מ (מקישים בעדינות על הקובט עד שהתערובת מפוזרת באופן שווה) ומניחים לה לשבת על הקרח למשך 10-30 דקות.
3. הסר את המדיום מתרבית 100% קונפלואנטית של תאי ISE6 והשהה מחדש את שכבות התאים ב-1.5 מ"ל של מדיום טרי עם NaHCO 3 וחיץ HEPES (שתואר לעיל בשלב 1.1.3). השתמש בבקבוקון אחד של תאים מתמזגים לכל טרנספורמציה.
4. מעבירים את התאים המחיים לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 2 מ"ל (צינור אחד לכל 25^ס" מ 2 בקבוקון של תאי ISE6).
5. אלקטרופוראט תערובת R. parkeri/pRAM18dSFA ב-1.8 KV, 200 אוהם, 25 μF באמצעות אלקטרופורטור.
6. באמצעות פיפט סטרילי בעל קצה עדין מורחב, מעבירים כמות קטנה מתלייה של תאי ISE6 (שלב 2.4) לתוך הקובט ומושכים בעדינות את הנוזל למעלה ולמטה כדי לשטוף את הקובט. מעבירים את התערובת לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל המכיל את שארית מתלה תאי ISE6 ומערבבים בעדינות את תערובת הטרנספורמציה עם התאים.
7. צנטריפוגה את הדגימות שעברו טרנספורמציה ב-700 × גרם למשך 2 דקות ב-RT, ולאחר מכן הגדל את מהירות הצנטריפוגה ל-13,600 × גרם למשך דקה אחת נוספת ב-RT.
   הערה: שתי מהירויות הצנטריפוגה מקדמות קשירה ריקטסיאלית עם התאים וכניסה אליהם: 700 × גרם משמשים למשיכת תאי ISE6, בעוד 13,600 × גרם משמשים למשיכת הריקטזיה.
8. תנו לדגימות לשבת ב-RT או ב-34°C למשך 15 דקות עד שעה.
9. השהה את הטרנספורמטורים (שניים או שלושה) בתאי ISE6 עם קצה פיפט מחסום סטרילי של 2 מ"ל המותאם לפיפטור והעבר לשניים או שלושה צלוחיות תרבית תאים בגודל 25 ס"מ^{המכילות} 3.5 מ"ל של מדיום טרי עם NaHCO₃ וחיץ HEPES. לחלופין, השתמש בפיפטה סטרילית, מחסום 2 מ"ל פסטר המופעל עם נורת גומי.
10. נדנדנדו את הצלוחיות כדי לפזר את התערובת באופן שווה ולאחר מכן דגירה ב 34 מעלות צלזיוס.
11. לאחר 16-24 שעות, יש להוסיף 10 μL של ספקטינומיצין (50 מ"ג/מ"ל) ו-10 μL של סטרפטומיצין (50 מ"ג/מ"ל) לכל בקבוק בשלב 2.10.

3. תצפית על ר' פרקרי שעבר טרנספורמציה

הערה: השתמש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מסנני רודמין/TRITC כדי לצפות בצלוחיות שהוכנו בשלב 2.11 לאחר 3-7 ימים. ברגע שהפלאקים ניכרים בתרביות (5-14 ימים), ניתן לראות את R. parkeri שעבר טרנספורמציה המבטאת את החלבון הפלואורסצנטי האדום mKATE, המקודד על פלסמיד pRAM18dSFA.

1. מיקרוסקופיה קונפוקלית
   1. השהה את תרביות התאים משלב 2.11 צלוחיות וערבב 100 μL של תרביות תאים אלה עם 5 μL של תמיסת Hoechst 33342 למשך 10-30 דקות ב- RT בחושך.
      הערה: Hoechst 33342 הוא כתם נגדי גרעיני חדיר לתאים שנקשר לדנ"א של תאי קרציות חיים ופולט פלואורסצנטיות כחולה.
   2. צנטריפוגה 50 μL של התערובת על מיקרוסקופ זכוכית מחליק באמצעות צנטריפוגה ב 5 × גרם במשך 3 דקות.
   3. הוסף 3 μL של 1x PBS לנקודה של תאים שהופקדו על המגלשה, כיסוי עם כיסוי להחליק, וצפה עם מיקרוסקופ confocal (60x מטרה). השתמש בפרמטרים הבאים של עירור ופליטה להדמיית פלואורסצנט: עבור 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), עירור ב-350 ננומטר, פליטה ב-470 ננומטר; עבור טטרה-מתילרודאמין (TRITC), עירור ב-557 ננומטר, פליטה ב-576 ננומטר.

תוצאות

המורפולוגיה של R. parkeri בתאי ISE6 תחת מיקרוסקופ אור לאחר צביעת גימסה מוצגת באיור 1. באיור 2, R. parkeri שעבר טרנספורמציה המבטא חלבון פלואורסצנטי אדום בתאי ISE6 מוצג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. ישנה עלייה משמעותית בשיעור ההדבקה של R. parkeri (אדום) מותמר בת...

Discussion

כאן, אנו מדגימים שיטה להחדרת דנ"א אקסוגני המקודד על פלסמיד pRAM18dSFA לתוך ריקטסיה באמצעות אלקטרופורציה. בהליך זה, ריקטסיה נטולת תאים טוהרה מתאים מארחים, הומרה עם וקטור מעבורת ריקטסיאלית, ושוחררה לתאי קרציות לצורך זיהום. כמו כן מתואר הליך אימונופלואורסצנטי קונפוקלי לאיתור חלבון פלואורסצנטי א?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette	Bio-Rad	1652083
2 μm pore size filter	GE Healthcare Life Sciences Whatman	6783-2520
5 mL Luer-lock syringe	BD	309646
60-90 silicon carbide grit	LORTONE, inc	591-056
absolute methanol	Fisher Scientific	A457-4
Bacto tryptose phosphate broth	BD	260300
Cytospin centrifuge Cytospin4	Thermo Fisher Scientific	A78300003	The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)	QIAGEN	12362	used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet	Perfector Scientific	TP03-5301
fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108	The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS	Bio-Rad	165-2105 & 165-2110
hemocytometer	Thermo Fisher Scientific	267110
HEPES	Millipore-Sigma	H4034
ImageJ Fiji	National Institute of Health		raw image editing
KaryoMAX Giemsa stain	Gibco	2021-10-30
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	41300039
lipoprotein concentrate	MP Biomedicals	191476
Nikon Diaphot	Nikon		epifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent	Thermo Fisher Scientific	R37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope	Olympus
Petroff-Hausser Counting Chamber	Hausser Scientific	Chamber 3900
sodium bicarbonate	Millipore-Sigma	S5761
Vortex	Fisher Vortex Genie 2	12-812