Méthode d’électroporation pour transformer Rickettsia spp. avec un vecteur navette exprimant une protéine fluorescente dans des lignées cellulaires de tiques

Résumé

L’électroporation est une méthode rapide et largement adoptée pour introduire de l’ADN exogène dans le genre Rickettsia. Ce protocole fournit une méthode d’électroporation utile pour la transformation des bactéries intracellulaires obligatoires dans le genre Rickettsia.

Résumé

Les rickettsioses sont causées par un large éventail de bactéries intracellulaires obligatoires appartenant au genre Rickettsia qui peuvent être transmises à des hôtes vertébrés par la piqûre d’arthropodes vecteurs infectés. À ce jour, les rickettsioses épidémiques émergentes ou réémergentes demeurent un risque pour la santé publique en raison de la difficulté du diagnostic, car les méthodes de diagnostic sont limitées et ne sont ni normalisées ni universellement accessibles. Un diagnostic erroné résultant d’un manque de reconnaissance des signes et symptômes peut entraîner un retard du traitement antibiotique et de mauvais résultats pour la santé. Une compréhension globale des caractéristiques de Rickettsia améliorerait finalement le diagnostic, l’évaluation et le traitement cliniques avec un meilleur contrôle et une meilleure prévention de la maladie.

Les études fonctionnelles des gènes rickettsiens sont cruciales pour comprendre leur rôle dans la pathogenèse. Cet article décrit une procédure d’électroporation de la souche Tate’s Hell de Rickettsia parkeri avec le vecteur navette pRAM18dSFA et la sélection de R. parkeri transformé en culture de cellules à tiques avec des antibiotiques (spectinomycine et streptomycine). Une méthode est également décrite pour la localisation de R. parkeri transformé dans les cellules de tiques en utilisant la microscopie confocale d’immunofluorescence, une technique utile pour vérifier la transformation dans les lignées cellulaires vectorielles. Des approches similaires conviennent également à la transformation d’autres rickettsies.

Introduction

Les rickettsioses sont causées par un large éventail de bactéries intracellulaires obligatoires appartenant au genre Rickettsia (famille des Rickettsiaceae, ordre des Rickettsiales). Le genre Rickettsia est classé en quatre grands groupes en fonction des caractéristiques phylogénétiques^1,2 : le groupe de la fièvre pourprée (SFG), qui comprend les rickettsies qui causent les rickettsioses transmises par les tiques les plus graves et les plus mortelles (p. ex., Rickettsia rickettsii, l’agent causal de la fièvre pourprée des montagnes Rocheuses), le groupe typhus (TG, p. ex., Rickettsia prowazekii^, l’agent du typhus épidémique), le groupe de transition (TRG, p. ex. Rickettsia felis, l’agent causal de la fièvre pourprée transmise par les puces) et le groupe ancestral (AG, p. ex. Rickettsia bellii).

Parmi les plus anciennes maladies à transmission vectorielle connues, les rickettsioses sont principalement acquises à la suite de la transmission des agents pathogènes par les piqûres d’arthropodes vecteurs infectés, notamment les tiques, les puces, les poux et les acariens ^3,4. Bien que la découverte d’antibiotiques efficaces ait amélioré les résultats du traitement, les rickettsioses épidémiques émergentes et réémergentes continuent de remettre en question les stratégies traditionnelles de prévention et de contrôle. Ainsi, une compréhension globale des interactions rickettsie/hôte/vecteur établirait en fin de compte une base solide pour développer de nouvelles approches pour prévenir et guérir ces maladies anciennes.

Dans la nature, le transfert horizontal de gènes (HGT) chez les bactéries se produit par conjugaison, transduction et transformation⁵. La transformation bactérienne in vitro utilise ces concepts HGT, bien que la nature intracellulaire des rickettsies présente certains défis. Les conditions de croissance restreintes et les systèmes de conjugaison et de transduction mal compris chez différentes espèces de rickettsies ont empêché l’application de méthodes de conjugaison et de transduction chez les rickettsies ^6,7,8. Comparé à d’autres genres bactériens intracellulaires obligatoires (par exemple, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma et Ehrlichia), le genre Rickettsia diffère en ce qui concerne les stratégies de croissance et de réplication dans le cytoplasme cellulaire, ce qui impose des défis spécifiques à la modification génétique des rickettsies en raison de leurs caractéristiques de style de vie uniques⁹.

Le premier obstacle à surmonter lors de la tentative de modification génétique des rickettsies est de réussir la transformation. Ainsi, la conception d’une approche réalisable avec une efficacité de transformation élevée serait extrêmement utile pour développer des outils génétiques pour les rickettsies. Ici, nous nous concentrons sur l’électroporation, une méthode de transformation largement reconnue qui a été utilisée pour introduire avec succès de l’ADN exogène dans plusieurs espèces de rickettsiae, y compris Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii et Rickettsia buchneri^10,11,12 ,^13,14,15,16.

Cet article décrit une procédure d’électroporation de la souche Tate’s Hell de R. parkeri (accession: GCA_000965145.1) avec le vecteur navette pRAM18dSFA dérivé du plasmide AaR/SC de Rickettsia amblyommatis pRAM18 conçu pour coder mKATE, une protéine fluorescente rouge lointain, et aadA, conférant une résistance à la spectinomycine et à la streptomycine^13,15,20. Les R. parkeri transformés sont viables et maintenus de manière stable dans le cadre de la sélection d’antibiotiques dans des lignées cellulaires de tiques. De plus, nous montrons que la localisation de R. parkeri transformé dans des cellules de tiques vivantes par microscopie confocale peut être utilisée pour évaluer la qualité des taux de transformation dans les lignées cellulaires vectorielles.

Protocole

1. Propagation et purification de R. parkeri à partir de cultures de cellules à tiques

NOTA : Toutes les procédures de culture cellulaire doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité de classe II.

1. Préparation R. parkeri-cellules de tiques infectées
   1. Cultiver des cellules ISE6 dans des flacons de culture cellulaire de 25 cm 2 à 34 °C dans 5 mL de milieu L15C300¹⁷, complétés par 5 % de sérum fœtal bovin (FBS), 5 % de bouillon de tryptose phosphate (TPB) et 0,1 % de concentré^de lipoprotéines (LPC).
      NOTE: ISE6 (lignée cellulaire dérivée de l’embryon d’Ixodes scapularis) est une lignée cellulaire de tiques largement utilisée dans de nombreux laboratoires et constitue donc un modèle essentiel pour étudier les interactions tiques-pathogènes^17,18,19. Le taux de croissance des cellules ISE6 est plus lent que celui des cellules de mammifères, avec un temps de doublement de la population de ≥72 h. Par exemple, les cellules ISE6 sous-cultivées à partir d’une culture confluente à 100% dans un rapport de 1:5 prendront 3-4 semaines pour retrouver 100% de confluence. Les cellules saines ISE6 seront généralement arrondies avec de nombreux filaments adhérents¹⁷.
   2. Compter les cellules ISE6 à l’aide d’un hémocytomètre au microscope optique. Utiliser à une concentration de ~10⁶ cellules/mL (100 % confluent).
      1. Rincer délicatement les cellules de la fiole avec un milieu et disperser les cellules par pipetage pour obtenir une suspension cellulaire homogène. Ajouter 20 μL de suspension cellulaire entre l’hémocytomètre et le verre de couverture pour compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
   3. Ajouter R. parkeri 20 de type sauvage exempt de cellules hôtes (nombre moyen: 5 × 10 7-10 × 10⁷) aux cultures cellulaires ISE6 dans des flacons de culture cellulaire de ²⁵ cm². Incuber des cultures de cellules infectées par R. parkeri à 34 °C dans 5 mL de milieu complet composé de milieu L15C300, 10 % FBS, 5 % TPB, 0,1 % LPC, 0,25 % de bicarbonate de sodium (NaHCO₃) et 25 mM HEPES jusqu’à ce que 90 % à 100 % des cellules soient infectées.
      REMARQUE: Le taux d’infection de R. parkeri dans les cellules ISE6 est déterminé par coloration de Giemsa, et le temps d’incubation pour atteindre 90% à 100% d’infection varie de 5 jours à 7 jours en moyenne.
   4. Déterminer le taux d’infection par coloration de Giemsa.
      1. Dans l’enceinte de biosécurité, remettre en suspension les cultures de cellules infectées et transférer 50 μL de la suspension dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
      2. Diluer la suspension avec un milieu complet (dilution 1:5) et centrifuger 100 μL sur des lames de microscope en verre à l’aide d’une centrifugeuse à 113 × g pendant 5 min. Pour contenir R. parkeri vivant, utilisez une centrifugeuse munie d’un rotor scellé conçu pour être retiré de la centrifugeuse. Cela permet le transport du rotor scellé à l’intérieur et à l’extérieur du capot.
         REMARQUE : Comme les R. parkeri sont encore en vie avant la centrifugation, l’échantillon doit être contenu jusqu’à ce que les rickettsies soient tuées. Ainsi, la centrifugeuse utilisée pour faire tourner la culture de R. parkeri sur la glissière doit avoir un rotor scellé conçu pour être soulevé hors de la centrifugeuse. Avec le rotor dans la hotte à flux laminaire, chargez les échantillons dans l’assemblage de lames de microscope en entonnoir, refermez le rotor et replacez le rotor scellé dans la centrifugeuse. Ensuite, allumez la centrifugeuse et les échantillons sont déposés sur les lames de microscope. Une fois le parcours terminé, retirez le rotor scellé de la centrifugeuse et placez-le dans la hotte à flux laminaire. Là, ouvrez le couvercle du rotor et déchargez l’ensemble lames de microscope en entonnoir à l’intérieur du capot. Une fois sec, plongez les lames de microscope en verre dans du méthanol absolu, qui tue tous les agents pathogènes. Les entonnoirs et les supports métalliques sont immergés dans du DMQ dilué, ce qui tue R. parkeri.
      3. Sécher les lames à l’air libre et fixer dans le méthanol absolu pendant 5 min à température ambiante (RT).
      4. Teindre les lames avec la coloration Giemsa (4% dans le tampon de Sørenson, pH 6,6) pendant 30 min à 37 °C et rincer à l’eau pendant 5 s.
      5. Déterminer le pourcentage d’infection (nombre de cellules infectées par des rickettsies/100 cellules) par microscopie optique.
         REMARQUE: La figure 1 montre les résultats typiques de la coloration de Giemsa.
2. Préparation de R. parkeri sans cellules
   REMARQUE: Lorsque 90% à 100% des cellules de la culture sont infectées, les rickettsies doivent être isolées des cellules ISE6 et une électroporation doit être effectuée.
   1. Ajouter du grain de carbure de silicium stérile de 60 à 90 dans des tubes microcentrifugés stériles de 2 mL à un volume d’environ 0,2 mL.
   2. Prélever 2 mL de milieu dans des cultures infectées à 100 % par R. parkeri (étape 1.1.3) et remettre les cellules en suspension dans les 3 mL restants de milieu.
   3. Transvaser des portions égales de cette suspension dans des tubes préparés à l’étape 1.2.1.
   4. Vortex chaque tube à grande vitesse pendant 30 s, puis placez les tubes sur de la glace. Laissez le gravier se déposer en quelques secondes par gravité.
   5. Dans une enceinte de biosécurité de classe II, avoir une seringue Luer-lock stérile de 5 mL prête avec le piston déployé et l’extrémité du piston fixée dans une base en polystyrène pour des tubes coniques de 15 mL.
   6. À l’aide d’un embout de pipette barrière stérile de 1 mL monté sur un pipeteur approprié, retirer le surnageant du lysat de cellules vortex du tube, en prenant soin de ne pas aspirer de gravier. Insérez l’embout de la pipette dans l’ouverture du moyeu de la seringue et éjectez le contenu dans la seringue en appuyant doucement. Vous pouvez également utiliser une pipette Pasteur stérile de 2 ml actionnée avec une ampoule en caoutchouc.
   7. Fixer un filtre stérilisé de taille de pores de 2 μm sur le moyeu de la seringue et filtrer la culture de R. parkeri de l’étape 1.2.6 dans des tubes stériles de 1,5 mL.
   8. Recueillir le R. parkeri par centrifugation à 13 600 × g à 4 °C pendant 5 min, et jeter le surnageant.
   9. Resuspendre la pastille dans 1,2 mL de saccharose glacé de 300 mM et centrifuger à nouveau à 13 600 × g à 4 °C pendant 5 min. Répéter la remise en suspension et la centrifugation pour un total de deux lavages au saccharose.
   10. Combiner les pastilles de R. parkeri dans un tube microcentrifuge glacé et stérile de 1,5 mL dans 50 μL de saccharose glacé de 300 mM par transformation. Comme une fiole de R. parkeri de 25 cm² fournit suffisamment de rickettsies pour deux ou trois transformations, ajouter 100-150 μL de saccharose froid 300 mM.
       NOTE: Si vous le souhaitez, le nombre de rickettsies peut être calculé à l’aide d’une chambre de comptage Petroff-Hausser. Lors de l’utilisation d’une inoculation initiale de 5 × 10 7 -10 × 10 7 R. parkeri sans cellules, il faudra en moyenne 5 à⁷ jours pour atteindre 90% à 100% d’infection, ce qui donne environ 5 × 10 7-10 × 10^{10 R}. parkeri sans cellules.
   11. Remettez doucement le granulé en suspension en le pipetant jusqu’à ce qu’il soit complètement dispersé. Répartir l’échantillon en portions de 50 μL dans des tubes microcentrifugés réfrigérés et stériles de 1,5 mL.
       NOTE: Si désiré, la viabilité des rickettsies peut être évaluée par cytométrie en flux après coloration avec un colorant fluorescent ²¹.

2. Transformation de R. parkeri avec le plasmide pRAM18dSFA

1. Sur la glace, ajouter 3 μg d’ADN plasmidique pRAM18dSFA^13,15,20 exempt d’endotoxines dans chaque tube contenant ⁵⁰ μL de suspension de R. parkeri et remuer le mélange avec l’embout de la pipette doucement mais soigneusement.
   REMARQUE: Lors de la préparation de l’ADN plasmidique, utilisez une trousse de purification qui comprend une étape d’élimination des endotoxines pour produire de l’ADN plasmidique²³ exempt d’endotoxines. Nous avons constaté qu’une gamme de concentrations plasmidiques comprises entre 1 μg et 3 μg par 50 μL de suspension de R. parkeri entraînait des transformations réussies, tandis que l’augmentation de la quantité de plasmide à 10 μg inhibait la transformation.
2. Transférer le mélange ci-dessus d’ADN et de R. parkeri dans une cuvette d’électroporation à intervalle glacé de 0,1 cm (tapoter doucement la cuvette jusqu’à ce que le mélange soit uniformément réparti) et laisser reposer sur la glace pendant 10 à 30 minutes.
3. Retirer le milieu d’une culture confluente à 100 % de cellules ISE6 et remettre en suspension les couches cellulaires dans 1,5 mL de milieu frais avec NaHCO 3 et tampon HEPES (décrit ci-dessus à l’étape 1.1.3). Utilisez une fiole de cellules confluentes par transformation.
4. Transvaser les cellules remises en suspension dans un tube microcentrifuge stérile de 2 mL (un tube pour^{25 cm 2} de cellules ISE6).
5. Électroporate le mélange R. parkeri/pRAM18dSFA à 1,8 KV, 200 ohms, 25 μF à l’aide d’un électroporateur.
6. À l’aide d’une pipette de transfert à pointe fine étendue et stérile, transférer une petite quantité de la suspension cellulaire ISE6 (étape 2.4) dans la cuvette et tirer doucement le liquide vers le haut et vers le bas pour laver la cuvette. Transférer le mélange dans le tube de microcentrifugation de 2 mL contenant le reste de la suspension cellulaire ISE6 et mélanger doucement le mélange de transformation avec les cellules.
7. Centrifuger les échantillons transformés à 700 × g pendant 2 min à TA, puis augmenter la vitesse de centrifugation à 13 600 × g pendant 1 min de plus à TA.
   NOTE: Les deux vitesses de centrifugation favorisent la liaison rickettsiale avec et l’entrée dans les cellules: 700 × g sont utilisés pour tirer vers le bas les cellules ISE6, tandis que 13 600 × g sont utilisés pour tirer vers le bas les rickettsies.
8. Laisser reposer les échantillons à TA ou 34 °C pendant 15 min à 1 h.
9. Resuspendre les transformants (deux ou trois) dans des cellules ISE6 avec un embout de pipette barrière stérile de 2 mL monté sur un pipeteur et transférer dans deux ou trois flacons de culture cellulaire de 25 cm² contenant 3,5 mL de milieu frais avec tampon NaHCO₃ et HEPES. Vous pouvez également utiliser une pipette Pasteur stérile de 2 ml actionnée avec une ampoule en caoutchouc.
10. Balancer les flacons pour répartir uniformément le mélange, puis incuber à 34 °C.
11. Après 16-24 h, ajouter 10 μL de spectinomycine (50 mg/mL) et 10 μL de streptomycine (50 mg/mL) dans chaque fiole à l’étape 2.10.

3. Observation du R. parkeri transformé

NOTE: Utilisez un microscope à épifluorescence avec des filtres rhodamine/TRITC pour observer les flacons préparés à l’étape 2.11 après 3-7 jours. Une fois que les plaques sont évidentes dans les cultures (5-14 jours), on peut voir R. parkeri transformé qui exprime la protéine fluorescente rouge mKATE, codée sur le plasmide pRAM18dSFA.

1. Microscopie confocale
   1. Resuspendre les cultures cellulaires des flacons de l’étape 2.11 et mélanger 100 μL de ces cultures cellulaires avec 5 μL de solution Hoechst 33342 pendant 10-30 min à TA dans l’obscurité.
      REMARQUE: Hoechst 33342 est une contre-coloration nucléaire perméable aux cellules qui se lie à l’ADN des cellules de tiques vivantes et émet une fluorescence bleue.
   2. Centrifuger 50 μL du mélange sur des lames de microscope en verre à l’aide d’une centrifugeuse à 5 × g pendant 3 min.
   3. Ajouter 3 μL de 1x PBS à l’endroit des cellules déposées sur la lame, superposer avec un couvercle et voir avec un microscope confocal (objectif 60x). Utiliser les paramètres d’excitation et d’émission suivants pour l’imagerie fluorescente : pour le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), excitation à 350 nm, émission à 470 nm; pour la tétraméthylrhodamine (TRITC), excitation à 557 nm, émission à 576 nm.

Résultats

La morphologie de R. parkeri dans les cellules ISE6 au microscope optique après coloration de Giemsa est illustrée à la figure 1. Sur la figure 2, R. parkeri transformé exprimant la protéine de fluorescence rouge dans les cellules ISE6 est représenté par microscopie confocale. Il y a une augmentation substantielle du taux d’infection de R. parkeri transformé (rouge) dans les cellules ISE6 (bleu, correspond aux noyaux) de (

Discussion

Ici, nous démontrons une méthode d’introduction d’ADN exogène codé sur le plasmide navette pRAM18dSFA dans les rickettsies par électroporation. Dans cette procédure, les rickettsies acellulaires ont été purifiées à partir de cellules hôtes, transformées avec un vecteur navette rickettsial et libérées sur les cellules de tiques pour l’infection. Une procédure d’immunofluorescence confocale pour détecter R. parkeri exprimant la protéine de fluorescence rouge dans les cellules de tiques est...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette	Bio-Rad	1652083
2 μm pore size filter	GE Healthcare Life Sciences Whatman	6783-2520
5 mL Luer-lock syringe	BD	309646
60-90 silicon carbide grit	LORTONE, inc	591-056
absolute methanol	Fisher Scientific	A457-4
Bacto tryptose phosphate broth	BD	260300
Cytospin centrifuge Cytospin4	Thermo Fisher Scientific	A78300003	The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)	QIAGEN	12362	used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet	Perfector Scientific	TP03-5301
fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108	The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS	Bio-Rad	165-2105 & 165-2110
hemocytometer	Thermo Fisher Scientific	267110
HEPES	Millipore-Sigma	H4034
ImageJ Fiji	National Institute of Health		raw image editing
KaryoMAX Giemsa stain	Gibco	2021-10-30
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	41300039
lipoprotein concentrate	MP Biomedicals	191476
Nikon Diaphot	Nikon		epifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent	Thermo Fisher Scientific	R37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope	Olympus
Petroff-Hausser Counting Chamber	Hausser Scientific	Chamber 3900
sodium bicarbonate	Millipore-Sigma	S5761
Vortex	Fisher Vortex Genie 2	12-812