微血管碎片血管化产热脂肪组织的三维培养

摘要

在这里，我们提出了一个详细的方案，概述了使用从啮齿动物或人类脂肪组织中分离的微血管碎片作为设计功能性，血管化米色脂肪组织的直接方法。

摘要

工程产热脂肪组织（例如，米色或棕色脂肪组织）已被研究为代谢疾病的潜在疗法或用于健康筛查和药物测试的个性化微组织设计。目前的策略通常相当复杂，无法准确完全描述产热脂肪组织的多细胞和功能特性。微血管碎片是由从脂肪组织中分离的小动脉、小静脉和毛细血管组成的完整小血管，作为细胞的单一自体来源，可实现血管化和脂肪组织形成。本文介绍了优化培养条件的方法，以便能够从微血管碎片中生成三维、血管化和功能性产热脂肪组织，包括从脂肪组织和培养条件中分离微血管碎片的方案。此外，还讨论了最佳实践，以及表征工程组织的技术，并提供了啮齿动物和人类微血管碎片的样品结果。这种方法有可能用于理解和开发肥胖和代谢疾病的治疗方法。

引言

该协议的目标是描述一种从单一的，潜在的自体来源微血管碎片（MVF）开发血管化米色脂肪组织的方法。棕色和米色脂肪组织已被证明具有与代谢调节相关的有益特性;然而，成人中这些脂肪组织库的小体积限制了对全身代谢的潜在影响，特别是在肥胖或2^{型糖尿病等}疾病条件下1，²，^3，4，⁵，^6，7。棕色/米色脂肪作为预防与肥胖及其合并症相关的有害代谢作用的治疗靶点引起了浓厚的兴趣8，9，^10，11，12。

MVF是可以直接从脂肪组织中分离，培养并以三维结构长时间保持的血管结构¹³，^14，15。我们小组和其他小组以前的工作已经开始利用MVF的多细胞和多能能力，特别是因为它与脂肪组织形成有关¹⁶，^17，18。作为这项工作的积累，我们最近证明，来自健康和2型糖尿病¹⁹的啮齿动物模型以及来自人类受试者（50岁以上的成年人）²⁰的MVF含有能够被诱导形成产热或米色脂肪组织的细胞。

这是一种利用单一来源MVF的创新方法，不仅能够创建米色脂肪组织，而且还能够创建其相关和关键的血管成分²¹。该技术的使用对于寻找一种直接的组织工程方法来形成产热脂肪组织的研究可能具有重要价值。与有志于设计米色脂肪组织^22，23，²⁴，25，^26，27，²⁸的其他方法不同^，本研究中描述的过程不需要使用多种细胞类型或复杂的诱导方案。可以使用源自啮齿动物和人类来源的MVF创建血管化的米色和白色脂肪模型，显示出巨大的翻译潜力。该方案的最终产品是一种工程米色产热脂肪组织，其结构和代谢功能与棕色脂肪组织相当。总体而言，该协议提出了这样一种想法，即易于访问且可能自体来源MVF可能是一种有价值的治疗干预和研究代谢紊乱的工具。

研究方案

本研究是根据《动物福利法》和《动物福利实施条例》根据《实验动物护理和使用指南》的原则进行的。所有动物程序均由德克萨斯大学圣安东尼奥分校的机构动物护理和使用委员会批准。

注意:对于下面描述的步骤，使用雄性刘易斯大鼠。必须对雌性以及小鼠微血管片段（MVF）收集进行轻微的方案调整²⁹。对于使用人MVF（h-MVF）的方案，唯一需要的步骤是按照制造商的方案重悬h-MVF，生长培养基制备（1.3），纤维蛋白水凝胶的形成（5）和培养（6）。有关协议的概述，请参见 图 1。

图 1:实验大纲。 分析前，使用MVF形成产热脂肪组织的六个关键步骤的分解。 请点击此处查看此图的大图。

1. 试剂制备

注意:以下试剂对应于一只大鼠，称重并在生物罩内制成。

1. 在PBS中制备牛血清白蛋白（BSA）。
   1. 在PBS中制备10毫克/毫升（1.0%）BSA，用于洗涤步骤（1毫克/毫升，0.1%）和消化（4毫克/毫升，0.4%）。
   2. 按照步骤1.1.3-1.1.5制备不同浓度的BSA，如步骤1.1.1-1.1.5所述。
   3. 10 毫克/毫升 PBS 中的 BSA（PBS 中的 1% BSA）
      1. 将 500 mg BSA 和 500 mL PBS 加入 50 mL 锥形管中，并涡旋溶液以溶解 BSA。
      2. 如果形成过多的气泡，则将溶液以350× g 离心2分钟。过滤器用0.22μm尼龙网过滤器对溶液进行灭菌。
   4. 1 毫克/毫升 PBS 中的 BSA（PBS 中的 0.1% BSA）
      1. 将 15 mL 10 mg/mL BSA 中的 10 mg/mL BSA 加入 500 mL 无菌瓶中的 135 mL PBS 中，用 PBS 以 1:10 的比例稀释 15 mL 10 mg/mL BSA，轻轻摇动瓶子以确保混合物均匀。
   5. 4 毫克/毫升 PBS 中的 BSA（PBS 中的 0.4% BSA）
      1. 在 100 mL 无菌瓶中加入 35 mL 10 mg/mL BSA 中的 PBS + 57.5 mL PBS 溶液，用 PBS 以 1:2.5 的比例稀释 35 mL 10 mg/mL BSA，轻轻摇动瓶子以确保混合物均匀。
2. 在BSA中制备胶原酶，用于消化碎脂肪垫。
   1. 准备6毫克/毫升胶原酶。
      1. 在 50 mL 锥形管中，称取 72 mg 胶原酶（标签"for Epi"）。
      2. 在三个 50 mL 锥形管中，分别称取 144 mg 胶原酶（标签"用于 Ing 1"、"用于 Ing 2"和"用于 SubQ"）。
      3. 将称重的胶原酶储存在4°C直至使用。
         注意:在消化之前不要添加BSA / PBS。
      4. 将 12 mL 的 4 mg/mL BSA 加入含有 72 mg 胶原酶的试管中。
      5. 将 24 mL 的 4 mg/mL BSA 加入到 PBS 中，加入含有 144 mg 胶原酶的试管中。
      6. 摇动试管以确保溶液均匀，并用0.22μm尼龙网过滤器过滤溶液。
3. 制备补充有氨基己酸 （ACA） 的生长培养基以补料/分化分离的 MVF。
   1. 生长培养基 （GM）:用 20% FBS、1% 青霉素-链霉素（笔链球菌）、0.2% 支原体预防性和 1 mg/mL ACA 补充 DMEM。
   2. 准备白色脂肪培养基（WAM）。
      1. WAM诱导:用20%FBS，1%笔链球菌，0.2%支原体预防性，10μg/ mL胰岛素，10μm佛司可林，1μm地塞米松和1mg / mL ACA补充DMEM / F12。
         注意:对于h-MVF，此外，添加125μM吲哚美辛。
      2. WAM维持:用20%FBS、1%笔链球菌、0.2%支原体预防、5μg/mL胰岛素和1mg/mL ACA补充DMEM/F12。
         注意:对于h-MVF，将胰岛素浓度更改为10μg/ mL。
   3. 准备米色成脂培养基 （BAM）。
      1. BAM诱导:用20%FBS，1%笔链球菌，0.2%支原体预防，10μg/ mL胰岛素，10μm佛司可林，1μm地塞米松，1μm罗格列酮，20nM 3，3′，5-三碘-L-甲状腺原氨酸（T3）和1mg / mL ACA补充DMEM / F12。
         注意:对于h-MVF，将T3的浓度更改为120 nM。
      2. BAM维持:用20%FBS，1%笔链球菌，0.2%支原体预防，5μg/ ml胰岛素，10μm佛司可林，1μm罗格列酮，20nM T3和1mg / mL ACA补充DMEM / F12。
         注意:对于h-MVF，将胰岛素浓度更改为10μg/ mL，将T3浓度更改为120nM。
4. 准备凝血酶（仅在没有原液等分溶液时才需要制作）以制造用于纤维蛋白凝胶的凝血剂。
   1. 10 U/mL 凝血酶，剂量为_{ddH 2}O:
      1. 使用制造商提供的1-5 mL ddH₂O重悬小瓶中的凝血酶粉末，并将重悬液转移到250 mL烧杯中。
      2. 将溶液升至 100 mL，并上下移液多次，以确保混合物均匀。将溶液分装到15 mL锥形管（~10 mL /管）中，并将等分试样储存在-20°C冰箱中。
         注意:使用时，在室温（RT）下解冻凝血酶。

2. 工具/材料准备

注意:所有仪器在使用前都应进行高压灭菌/灭菌。

1. 附睾/腹股沟/皮下脂肪分离（手术在确定的手术区域进行）
   1. 确保提供一次性垫子、两把剪刀、一个止血器（可选）、两个镊子和四个 50 mL 锥形管，其中 10-15 mL 的 1 mg/mL BSA （0.1%） 在 PBS 中。
2. 微血管碎片分离
   1. 对于切碎（在生物罩中进行），确保提供三个未包被的无菌 100 毫米培养皿、一对镊子和一对弯曲剪刀。
   2. 对于消化和分离（在生物罩中完成），确保一把剪刀，一对镊子，八个未包被的无菌100毫米培养皿，三个未包被的无菌35毫米培养皿，称量胶原酶并在4°C，四个250毫升烧瓶，一个中心有孔的塑料支架，四个500μM屏幕（切成3个圆形正方形）， 四个 37 μM 屏幕（切成 3 个圆形正方形）和 11 个 50 mL 锥形管。
3. 纤维蛋白重悬
   1. 对于纤维蛋白水凝胶（在生物罩中完成），确保纤维蛋白原、凝血酶和生长培养基（在试剂制备过程中制备）可用。

3. 脂肪分离方案

1. 预备步骤
   1. 在使用手术器械之前，在烧杯中装满乙醇以清洗和消毒手术器械。接下来，准备处理大鼠的桌子，并准备好真空吸出剃须步骤中产生的毛皮。
   2. 准备一个装有冰的桶，其中将放置先前制备的 50 mL 锥形管，每个锥形管含有 10 mL 的 1 mg/mL BSA。相应地标记管子。
      注意:可能需要有两个单独的锥形管用于腹股沟脂肪，因为需要提取两侧，并且与附睾和皮下后相比，从该区域收集的脂肪量往往是最大的。
   3. 首先使用所需的手术工具在规定的手术区域安乐死大鼠。通常，CO₂ 用于按照IACUC协议对大鼠实施安乐死。
   4. 使用理发器，在感兴趣的区域周围剃掉老鼠。具体来说，在腹股沟和腹部一半之间剃须，以隔离附睾和腹股沟脂肪（在该区域使用较小的剃须刀进行皮毛）。剃掉整个背部，使后皮下脂肪位于肩胛骨之间（最好使用较大的剃须刀，因为大鼠背面的皮毛较厚）。
   5. 通过喷洒70%乙醇无菌制备大鼠。通常，建议清洁将要切割的区域两次。
2. 隔离不同的脂肪库
   1. 腹股沟（皮下）
      1. 在仰卧位，用一把剪刀抬起阴茎下方的皮肤。用剪刀开始切口，从中心开始横向切割，形成"V"形并循环到老鼠的背部以进入整个脂肪库。记住要表面切割，以使下面的脂肪完好无损。在切割步骤中，通过切割相互连接的筋膜组织来确保皮肤与脂肪分离（图2A）。
      2. 一旦筋膜被适当切割，确保腹股沟脂肪的两侧是可见的（腹股沟脂肪从腹股沟区域向后延伸）。接下来，在两个单独的锥形管中去除两侧的脂肪，其中包含 10 mL 的 1 mg/mL BSA（图 2B）。
   2. 附睾（内脏）
      1. 通过切开腹部皮肤并小心地穿过睾丸周围的薄层来收获附睾脂肪（图2C）。
      2. 用镊子轻轻拉出脂肪组织并用剪刀将其剪出。避免解剖任何主要的可见血管（如果收获睾丸和附睾，请在生物罩的清洁步骤中将其移除）。
      3. 小心地将去除的脂肪放入 50 mL 锥形管中，其中 10 mL 的 1 mg/mL BSA 在 PBS 中。
         注意:附睾脂肪的去除应在腹股沟脂肪去除后进行。附睾脂肪的体积通常较小，位于腹股沟脂肪下方，睾丸和附睾周围的腹部皮肤下方。
   3. 后皮下
      1. 将大鼠俯卧（背侧朝上），并使用大剪刀将背部的皮肤（该区域的皮肤很厚）一直切到头皮，注意不要切得太深，就在皮肤下方（图2D）。
      2. 切开连接皮肤和组织的筋膜;脂肪位于肩胛间区域。记下区分/分离皮下脂肪和棕色脂肪。棕色脂肪更接近脊柱（图2E）。
      3. 分离脂肪并将其放入相应的 50 mL 锥形管中，其中 10 mL 的 1 mg/mL BSA 在 PBS 中。

图2:不同脂肪组织库的分离 。 （A）切除腹股沟脂肪组织所需的初始切口。（B）腹股沟脂肪库的位置。（C）附睾脂肪库的位置，注意进入所需的外皮切口。（D）一旦放置容易获得额外脂肪的小鼠，就需要额外的切口。（E）后皮下脂肪库的位置。 请点击此处查看此图的大图。

4. 微血管碎片分离方案

1. 将含有从大鼠切除的脂肪的 50 mL 锥形管放入生物罩中。
2. 使用镊子将脂肪放入标准的 100 毫米培养皿中（在 PBS 中加入 ~0.5 mL 的 1 mg/mL BSA 以保持组织水分）。
3. 清洁并去除脂肪中任何可见的血管和肌肉/外来组织。
4. 用剪刀切碎脂肪~10分钟（切碎，以便可以用10mL移液管转移）。
5. 通过在 PBS 中添加 ~0.5 mL 的 1 mg/mL BSA 来检查肿块;如有必要，继续切碎。
6. 用 10 mL 移液管将切碎的脂肪转移到无菌 250 mL 烧瓶中。
   注意:使用移液管注意体积。
7. 添加足够的BSA（1毫克/毫升），使最终体积为20毫升。
8. 在胶原酶中加入 4 mg/mL BSA 的 PBS（胶原酶终浓度:6 mg/mL）（即 72 mg 胶原酶为 12 mL，144 mg 胶原酶为 24 mL）。
   注意:在切碎完成之前不要添加，因为它对时间敏感。
9. 轻轻摇动锥形管以确保溶液均匀，并用0.22μm尼龙网过滤器过滤溶液。
10. 对于附睾脂肪，消化~8-10分钟;对于腹股沟和后皮下脂肪，在37°C水浴中消化~15-20分钟，在整个过程中以圆周运动摇动烧瓶（在脂肪到达仅剩几团块的那一刻停止）。
11. 将消化的脂肪转移到 50 mL 锥形管中（应有 ~30 mL/管），并将管标记为"消化脂肪"。
12. 以400× g 旋转管4分钟;纺纱后，颗粒必须是红色的（图3A）。
13. 在旋转过程中，将无菌的 37 μM 屏幕和 500 μM 屏幕放入无菌培养皿中，其中 5 mL 的 1 mg/mL BSA 在 PBS 中预浸泡。
14. 旋转后，将上清液倒入标记为"废物"的 50 mL 锥形管中。轻轻地进行倾析以去除浅表脂肪，并且不会干扰由MVF制成的颗粒。
15. 将 10 mL 的 1 mg/mL BSA 加入含有沉淀（"消化脂肪"）的试管中。研磨（上下移液）沉淀2倍。
16. 避免在颗粒上太粗糙，以免破坏碎片。
17. 将500μM屏幕置于塑料屏幕支架上方的新培养皿中（图3B）。
18. 使用同心圆从"消化沉淀"管中移取 10 mL 在 500 μM 屏幕上（图 3C）。
19. 用另外 5 mL 的 1 mg/mL BSA 在 PBS 中清洗过滤器。所需的细胞将过滤到培养皿中;因此，丢弃500μM屏幕，但将过滤后的液体保存在培养皿内。
20. 将37μM屏幕置于塑料屏幕支架上方的新培养皿中。
21. 在使用37μM筛网之前更换移液器以消除任何结块。
22. 使用同心圆在37μM屏幕上移取从第一次过滤中获得的液体。
23. 用另外 5 mL 的 1 mg/mL BSA 在 PBS 中清洗过滤器。所需的细胞将保留在过滤器中，因此丢弃过滤后的液体，但保存37μM屏幕。
24. 将 37 μM 屏幕滑动到含有 5 mL 1 mg/mL BSA 的 PBS 的新培养皿中。
25. 通过敲击圆锥形支架来摇晃盘子以去除碎片。不要用力摇晃，因为液体/细胞可能会从培养皿中溢出。
26. 用另外 5 mL 的 1 mg/mL BSA 在 PBS 中冲洗过滤器。所需细胞将保留在培养皿中的液体溶液中。保存37μM屏幕和培养皿内含有液体的脱落片段，以进行以下步骤。
27. 将含有液体的BSA +片段转移到无菌的50 mL锥形管中。
28. 重复冲洗37μM屏幕多次（每次用~5mL的1mg / mL BSA在PBS中）并添加到锥形管中。重复直到收集的总体积为 ~15-20 mL。最终，将从培养皿中的液体溶液中收集所需的细胞并放置在锥形管中;此时，在最后一次冲洗后丢弃 37 μM 屏幕，但将脱落的含有液体的碎片保存在 50 mL 锥形管内。
29. 用剪刀将 200 μL 移液器吸头的末端夹住。轻轻摇动 50 mL 管，取出两个 20 μL 样品，并将它们放入干净的 35 mm 培养皿中。
30. 计算培养皿中每个样品中的片段数，以获得分离的MVF总数。
    总片段数 =
31. 将剩余的脱落的含有液体的片段在 50 mL 锥形管中以 400 x g 旋转 4 分钟以收集 MVF。

图3:MVF的分离 。 （A）脂肪组织的消化后，描述了旋转后含有颗粒和上清液的MVF的分离。（B）用于过滤和截留MVF的耗材的布局。 （C）过滤/洗涤步骤的同心圆方法的图示。 请点击此处查看此图的大图。

5. 纤维蛋白水凝胶的形成

1. 计算示例:
   注意:以下是接种在~15，000-20，000 MVF / mL和纤维蛋白原:凝血酶凝胶比值为2:5的MVF的计算，纤维蛋白原在20 mg / mL浓度下使用。
   1. 要制备五块 250 μL 凝胶，需要 1，250 μL 的总体积。始终考虑到移液错误，因此，制备足够 1.5 mL 凝胶。
      1. 计算所需的纤维蛋白原体积，如下所示:
         ， X₁ = 428.57 μL 纤维蛋白原
      2. 计算所需的凝血酶体积，如下所示:
         ， X₂ = 1，071.43 μL 凝血酶
      3. 对于所需的 428.57 μL 体积，按如下方式制备 500 μL 纤维蛋白原:
         20毫克/毫升* 0.5毫升=10毫克纤维蛋白原。将其重悬于 500 μL DMEM 中
      4. 要获得每种凝胶，请按如下方式计算纤维蛋白原和凝血酶的体积:
         1. 纤维蛋白原:
            ， X₁ = 71.43 μL 纤维蛋白原（在 DMEM 中）+ MVF
         2. 凝血酶:
            ， X₂ = 178.57 μL 凝血酶
2. MVF 纤维蛋白凝胶铸造
   1. 倒出 50 mL 锥形管中离心片段中的大部分液体。使用移液器去除残留在锥形管边缘的少量液体。
   2. 将凝血酶添加到将要制造凝胶的孔中（图4A）。
   3. 夹住 200 μL 移液器吸头的末端，并使用纤维蛋白原轻轻重悬 MVF，一次在凝胶中获得 ~15，000-20，000 MVF/mL 的最终密度。
   4. 夹住 200 μL 移液器吸头的末端，然后将 MVF+纤维蛋白原轻轻移入凝血酶溶液中。快速上下移液，以确保混合物均匀。重复直至制成所有凝胶（图4B）。
   5. 将孔板置于培养箱（37°C，5%CO₂）中~15分钟以允许凝胶交联（图4C）。
   6. 向每个孔中加入 100-150 μL 生长培养基。

图4:MVF纤维蛋白凝胶的形成 。 （A）将5/7份凝血酶混合物移液到相应的孔中。（B）接下来，用夹住的移液器吸头（以免干扰MVF），将2/7份纤维蛋白原+MVF混合物移液到孔中并轻轻混合。（C）最后，将所有完成的凝胶放入37°C的培养箱中，使水凝胶在将培养基置于顶部之前完全固化。 请点击此处查看此图的大图。

6. MVF的培养条件

1. 为了培养非血管化的白色和米色脂肪组织（+GM对照），使用图5所示的时间线¹⁹。
2. 对于血管化的白色和米色脂肪组织的培养（+GM对照），使用图6所示的时间线¹⁹。
3. 在研究培养期间，水凝胶应保持在培养箱（37°C，5%CO₂）中，每隔一天更换一次培养基。有关样品的固定和处理进行分析，请参阅先前发表的著作¹⁶，^19，20。

图5:非血管化脂肪组织形成的时间。 这一数字是根据阿科斯塔等人¹⁹修改的。 请点击此处查看此图的大图。

图6:血管化脂肪组织形成的时间。 这一数字是根据阿科斯塔等人¹⁹修改的。 请点击此处查看此图的大图。

结果

米色/棕色脂肪组织有几个关键的表型形态特征:它是多房/含有小脂滴，具有大量的线粒体（这是其在 体内特征性"褐色"外观的原因），相应地具有高耗氧率/线粒体生物能量，高度血管化，脂肪分解/胰岛素刺激的葡萄糖摄取增加，以及最臭名昭著的， 表达高水平的解偶联蛋白 1 （UCP1），这是一种参与产热呼吸的线粒体蛋白^19，30。

讨论

棕色/米色脂肪组织工程领域在很大程度上尚未成熟22，23，24，25，26，27，^{28，大部分}脂肪模型正在开发用于白色脂肪组织⁸，^22，31.工程棕色/米色微组?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aminocaproic Acid	Sigma Aldrich	A2504-100G	Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL
Blunt-Tipped Scissors	Fisher scientific	12-000-172	Sterilize in autoclave
Bovin Serum Albumin (BSA)	Millipore	126575-10GM	Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL
Collagenase Type 1	Fisher scientific	NC9633623	Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat
Dexamethasone	Thermo Scientific	AC230302500	Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration
Disposable underpads	Fisher scientific	23-666-062	For fluid absorption during surgery
Dissecting Scissors	Fisher scientific	08-951-5	Sterilize in autoclave
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM)	Fisher scientific	11885092
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12)	Sigma Aldrich	D8062
Fetal Bovine Serum	Fisher scientific	16140089	Added in DMEM to 20% v/v.
Fibrinogen	Sigma Aldrich	F8630-25G	Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel
Flask, 250 mL	Fisher scientific	FB500250	Allows for digestion of fat using a large surface area
Forceps	Fisher scientific	50-264-21	Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration
Human MVF	Advanced Solutions Life Scienes, LLC	https://www.advancedsolutions.com/microvessels	Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study.
Indomethacine	Sigma Aldrich	I7378	Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration
Insulin from porcine pancreas	Sigma Aldrich	I5523	Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration
MycoZap	Fisher scientific	NC9023832	Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Fisher scientific	15140122	Added in DMEM to 1% v/v.
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm).	Fisher scientific	351029	3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm).	Fisher scientific	50-202-036	For counting fragments
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Fisher scientific	14-190-250	Diluted to 1x with sterile deionized water.
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)	Fisher scientific	NC0854141
Rosiglitazone	Fisher scientific	R0106200MG	Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration
Scissors	Fine Science Tools	14059-11	1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping
Screen  37 µM	Carolina Biological Supply Company	652222R	Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris
Screen 500 µM	Carolina Biological Supply Company	652222F	Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris
Serrated Hemostat	Fisher scientific	12-000-171	Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision
Steriflip Filter 0.22 μm	Millipore	SE1M179M6
Thrombin	Fisher scientific	6051601KU	Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin
Thyroid hormone (T3)	Sigma Aldrich	T2877	Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats - obese (FA/FA) or lean (FA/+) male	Charles River	https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611	Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.