Microvascular Fragments에서 Vascularized Thermogenic Adipose Tissue의 3차원 배양

요약

여기에서 우리는 기능적 혈관화된 베이지색 지방 조직을 엔지니어링하기 위한 간단한 접근 방식으로 설치류 또는 인간 지방 조직에서 분리된 미세혈관 조각의 사용을 설명하는 자세한 프로토콜을 제시합니다.

초록

공학적 열 발생 지방 조직(예: 베이지색 또는 갈색 지방 조직)은 대사 질환에 대한 잠재적 치료법 또는 건강 검진 및 약물 검사를 위한 개인화된 미세 조직의 설계를 위한 것으로 조사되었습니다. 현재의 전략은 종종 매우 복잡하며 열 발생 지방 조직의 다세포 및 기능적 특성을 정확하게 완전히 묘사하지 못합니다. 지방 조직에서 분리된 세동맥, 세정맥 및 모세혈관으로 구성된 작고 손상되지 않은 미세혈관인 미세혈관 단편은 혈관화 및 지방 조직 형성을 가능하게 하는 단일 자가 세포 공급원 역할을 합니다. 이 기사에서는 지방 조직 및 배양 조건에서 미세혈관 단편을 분리하기 위한 프로토콜을 포함하여 미세혈관 조각에서 3차원, 혈관화 및 기능적 열발생 지방 조직을 생성할 수 있도록 배양 조건을 최적화하는 방법을 설명합니다. 또한 조작된 조직을 특성화하는 기술과 마찬가지로 모범 사례에 대해 논의하고 설치류 및 인간 미세혈관 단편의 샘플 결과를 제공합니다. 이 접근법은 비만 및 대사 질환 치료법의 이해와 개발에 활용될 가능성이 있습니다.

서문

이 프로토콜의 목표는 잠재적으로 자가 소스인 단일 미세혈관 단편(MVF)에서 혈관화된 베이지색 지방 조직을 개발하기 위한 접근 방식을 설명하는 것입니다. 갈색 및 베이지색 지방 조직은 대사 조절과 관련된 유익한 특성을 나타내는 것으로 입증되었습니다. 그러나, 성인의 이러한 지방 조직 저장소의 소량은 특히 비만이나 제2형 당뇨병과 같은 질병 상태에서 전신 대사에 대한 잠재적 영향을 제한한다 1,2,3,4,5,6,7. 비만 및 그 동반 질환과 관련된 유해한 대사 효과를 예방하기 위한 치료 표적으로서 갈색/베이지색 지방에 상당한 관심이 있습니다 8,9,10,11,12.

MVF는 지방 조직으로부터 직접 분리되고, 배양되고, 연장된 기간 동안 3차원 구성으로 유지될 수 있는 혈관 구조이다^(13,14,15). 우리 그룹과 다른 사람들의 이전 연구는 특히 지방 조직 형성과 관련하여 MVF의 다세포 및 다능성 능력을 활용하기 시작했습니다^16,17,18. 이 연구의 축적으로, 우리는 최근 건강한 제2형 당뇨병 및 제2형 당뇨병의 설치류 모델(¹⁹)과 인간 피험자(50세 이상의 성인⁾²⁰에서 파생된 MVF가 열발생 또는 베이지색 지방 조직을 형성하도록 유도될 수 있는 세포를 함유하고 있음을 입증했습니다.

본원은 베이지색 지방 조직뿐만 아니라 그의 관련되고 중요한 혈관 성분(²¹)을 생성할 수 있는 단일 공급원 MVF가 활용되는 혁신적인 접근법이다. 이 기술의 사용은 열 발생 지방 조직 형성을 위한 간단한 조직 공학적 접근 방식을 찾는 연구에 큰 가치가 있을 수 있습니다. 베이지색 지방 조직 22,23,24,25,26,27,28을 조작하려는 다른 방법과 달리 이 연구에 설명된 프로세스는 여러 세포 유형이나 복잡한 유도 요법을 사용할 필요가 없습니다. 혈관화된 베이지색 및 백색 지방 모델은 설치류 및 인간 소스에서 유래한 MVF로 생성할 수 있어 뛰어난 번역 잠재력을 보여줍니다. 이 프로토콜의 최종 제품은 갈색 지방 조직에 필적하는 구조와 대사 기능을 가진 엔지니어링된 베이지색 열 발생 지방 조직입니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 쉽게 접근할 수 있고 자가 소스 MVF가 대사 장애를 연구하기 위한 가치 있는 치료 개입 및 도구가 될 수 있다는 아이디어를 제시합니다.

프로토콜

본 연구는 동물복지법 및 동물복지 시행규정에 따라 실험동물 관리 및 사용 가이드의 원칙에 따라 수행되었다. 모든 동물 절차는 샌안토니오에 있는 텍사스 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

참고: 아래에 설명된 단계에서는 수컷 Lewis Rats가 사용됩니다. 암컷과 생쥐 미세혈관 조각(MVF) 수집에 대해 약간의 프로토콜 조정이 이루어져야 한다²⁹. 인간 MVF(h-MVF)를 사용하는 프로토콜의 경우 필요한 유일한 단계는 제조업체의 프로토콜에 따른 h-MVF의 재현탁, 성장 배지 준비(1.3), 피브린 하이드로겔 형성(5) 및 배양(6)입니다. 프로토콜에 대한 개요는 그림 1을 참조하십시오.

그림 1: 실험 개요. MVF를 사용한 열발생 지방 조직 형성을 위한 분석 전 6가지 주요 단계 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 시약 준비

참고: 아래 시약은 쥐 한 마리에 해당하며, 무게를 측정하고 바이오후드 내부에서 만듭니다.

1. PBS에서 소 혈청 알부민(BSA)을 준비합니다.
   1. 세척 단계(1mg/mL, 1.0%) 및 소화(1mg/mL, 0.1%)를 위해 희석할 PBS에 4mg/mL(0.4%) BSA를 준비합니다.
   2. 1.1.3-1.1.5 단계에 따라 1.1.1 단계에서 언급 한대로 다른 농도의 BSA를 준비하십시오.
   3. PBS의 10mg/mL BSA(PBS의 1% BSA)
      1. 500mg의 BSA와 500mL의 PBS를 50mL의 원뿔형 튜브에 넣고 용액을 와동시켜 BSA를 용해시킵니다.
      2. 과도한 기포가 형성되면 용액을 350 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 필터는 0.22μm 나일론 네트 필터로 용액을 멸균합니다.
   4. PBS의 1mg/mL BSA(PBS의 0.1% BSA)
      1. 15mL 멸균 병에 PBS 10mL에 PBS 10mL를 첨가하여 PBS 10:15에 10mg/mL BSA 500mL를 희석하고 병을 부드럽게 흔들어 균질한 혼합물이 되도록 합니다.
   5. PBS의 4mg/mL BSA(PBS의 경우 0.4% BSA)
      1. PBS에 10mg/mL BSA 35mL + PBS 100mL 멸균 병에 PBS 57.5mL를 추가하여 PBS 10:2.5에 10mg/mL BSA 35mL를 희석하고 병을 부드럽게 흔들어 균질한 혼합물이 되도록 합니다.
2. 다진 지방 패드의 소화를 위해 BSA에서 콜라게나아제를 준비하십시오.
   1. 6mg/mL 콜라게나제를 준비합니다.
      1. 50mL 원뿔형 튜브에서 72mg의 콜라게나제("에피용" 라벨)의 무게를 잰다.
      2. 3개의 50mL 원뿔형 튜브에서 각각 144mg의 콜라게나제(라벨 "for Ing 1", "for Ing 2" 및 "for SubQ")를 잰다.
      3. 칭량된 콜라게나아제를 사용할 때까지 4°C에서 보관한다.
         알림: 소화 직전까지 BSA/PBS를 첨가하지 마십시오.
      4. PBS에 4mg/mL BSA 12mL를 콜라게나제 72mg이 들어 있는 튜브에 추가합니다.
      5. PBS에 24mg의 4mg/mL BSA 144mL를 콜라게나제가 들어 있는 튜브에 추가합니다.
      6. 튜브를 흔들어 균질한 용액을 확인하고 0.22μm 나일론 네트 필터로 용액을 여과하여 멸균합니다.
3. 분리된 MVF를 공급/분화하기 위해 아미노카프로산(ACA)이 보충된 성장 배지를 준비합니다.
   1. 성장 배지(GM): DMEM에 20% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신(펜 스트렙), 0.2% 마이코플라스마 예방 및 1mg/mL ACA를 보충합니다.
   2. 백색 지방 생성 배지(WAM)를 준비합니다.
      1. WAM 유도: DMEM/F12에 20% FBS, 1% 펜 연쇄상 구균, 0.2% 마이코플라스마 예방, 10μg/mL 인슐린, 10μm의 포스콜린, 1μm의 덱사메타손 및 1mg/mL ACA를 보충합니다.
         참고: h-MVF의 경우 125μM의 인도메타신을 추가합니다.
      2. WAM 유지: 20% FBS, 1% 펜 연쇄상 구균, 0.2% 마이코플라스마 예방, 5μg/mL 인슐린 및 1mg/mL ACA로 DMEM/F12를 보충합니다.
         참고: h-MVF의 경우 인슐린 농도를 10μg/mL로 변경합니다.
   3. 베이지색 지방 생성 배지(BAM)를 준비합니다.
      1. BAM 유도: DMEM/F12에 20% FBS, 1% 펜 스트렙, 0.2% 마이코플라스마 예방, 10μg/mL 인슐린, 10μm의 포스콜린, 1μm의 덱사메타손, 1μm의 로시글리타존, 20nM 3,3′,5-트리요오도-L-티로닌(T3) 및 1mg/mL ACA.
         알림: h-MVF의 경우 T3의 농도를 120nM으로 변경합니다.
      2. BAM 유지: DMEM/F12에 20% FBS, 1% 펜 연쇄상 구균, 0.2% 마이코플라스마 예방, 5μg/ml 인슐린, 10μm의 포스콜린, 1μm의 로시글리타존, 20nM T3 및 1mg/mL ACA를 보충합니다.
         참고: h-MVF의 경우 인슐린 농도를 10μg/mL로, T3 농도를 120nM으로 변경합니다.
4. 피브린 겔에 사용할 응고제를 만들기 위해 트롬빈을 준비합니다(스톡 분취 용액을 사용할 수 없는 경우에만 만들어야 함).
   1. ddH_2O의 10U/mL 트롬빈:
      1. 제조자로부터의 바이알에 1-5 mL의_ddH2O를 사용하여 트롬빈 분말을 재현탁시키고, 재현탁액을 250 mL 비커로 옮긴다.
      2. 용액을 100mL로 올리고 균질한 혼합물이 되도록 용액을 위아래로 여러 번 피펫합니다. 용액을 15mL 원뿔형 튜브(~10mL/튜브)에 분취하고 분취량을 -20°C 냉동고에 보관합니다.
         알림: 사용하려면 실온(RT)에서 트롬빈을 해동하십시오.

2. 공구/재료 준비

알림: 모든 기기는 사용하기 전에 고압 증기멸균/멸균해야 합니다.

1. 부고환/사타구니/피하 지방 분리(정의된 수술 부위에서 시행하는 수술)
   1. PBS에서 10-15mL의 1mg/mL BSA(0.1%)가 있는 일회용 언더패드, 가위 2개, 지혈제 1개(옵션), 겸자 2개, 50mL 원뿔형 튜브 4개의 가용성을 보장합니다.
2. 미세혈관 단편 분리
   1. 다진 것(바이오후드에서 수행)의 경우 코팅되지 않은 멸균 100mm 페트리 접시 3개, 집게 1쌍, 곡선 가위 1쌍을 사용할 수 있는지 확인하십시오.
   2. 소화 및 분리(바이오후드에서 수행)를 위해 가위 1쌍, 집게 1쌍, 코팅되지 않은 멸균 100mm 페트리 접시 8개, 코팅되지 않은 멸균 35mm 페트리 접시 3개, 콜라게나제 칭량 및 4°C, 250mL 플라스크 4개, 중앙에 구멍이 있는 플라스틱 홀더 1개, 500μM 스크린 4개(둥근 사각형으로 3개로 절단), 4개의 37μM 스크린(둥근 정사각형으로 3개로 절단) 및 11개의 50mL 원뿔형 튜브.
3. 피브린 재현탁
   1. 피브린 하이드로겔(바이오후드에서 수행)의 경우 피브리노겐, 트롬빈 및 성장 배지(시약 준비 중에 생성됨)를 사용할 수 있는지 확인하십시오.

3. 뚱뚱한 고립 의정서

1. 예비 단계
   1. 비커에 에탄올을 채워 수술 기구를 사용하기 전에 세척하고 소독하십시오. 다음으로, 쥐를 다루기 위해 테이블을 준비하고 면도 단계에서 생성된 털을 흡인할 수 있도록 진공 청소기를 준비합니다.
   2. 각각 50mg/mL BSA 10mL가 들어 있는 미리 준비된 1mL 원뿔형 튜브를 놓을 얼음이 담긴 양동이를 준비합니다. 그에 따라 튜브에 라벨을 붙입니다.
      참고: 사타구니 지방에 대해 두 개의 분리된 원추형 튜브가 필요할 수 있습니다., 양면을 추출해야 하고 이 부위에서 수집된 지방의 양이 부고환 및 후방 피하에 비해 가장 큰 경향이 있기 때문입니다.
   3. 필요한 수술 도구를 사용하여 정의된 수술 영역에서 안락사된 쥐로 시작합니다. 일반적으로,_CO2 는 IACUC 프로토콜에 따라 래트를 안락사시키는데 사용된다.
   4. 머리 깎기를 사용하여 관심 부위 주변의 쥐를 면도하십시오. 특히, 부고환 및 사타구니 지방 분리를 위해 사타구니와 복부의 절반 사이를 면도합니다(이 부위의 모피에는 더 작은 면도기 사용). 견갑골 사이에 위치한 후방 피하 지방을 얻기 위해 등 전체를 면도하십시오 (쥐의 뒷면에서 털이 더 두껍기 때문에 더 큰 면도기를 사용하는 것이 가장 좋습니다).
   5. 쥐를 70% 에탄올로 분사하여 무균적으로 준비합니다. 일반적으로 절단할 부분을 두 번 청소하는 것이 좋습니다.
2. 다른 지방 저장소의 격리
   1. 사타구니 (피하)
      1. 앙와위 자세에서 가위로 음경 아래의 피부를 들어 올립니다. 가위로 절개를 시작하여 중앙에서 시작하여 측면으로 절단하여 "V"자 모양을 형성하고 쥐의 뒤쪽으로 고리를 만들어 전체 지방 저장소에 접근합니다. 아래의 지방이 손상되지 않도록 표면을 자르는 것을 잊지 마십시오. 절단 단계 동안, 상호연결된 근막 조직을 절단하여 지방으로부터 피부의 분리를 보장한다(도 2A).
      2. 근막이 적절하게 절단되면 사타구니 지방의 양면이 보이는지 확인합니다(사타구니 지방은 사타구니 부위에서 뒤쪽으로 확장됨). 다음으로, 10mg/mL BSA 1mL가 들어 있는 두 개의 별도 원뿔형 튜브에서 양면의 지방을 제거합니다(그림 2B).
   2. 부고환 (내장)
      1. 복부 피부를 절단하고 고환을 둘러싼 얇은 층을 조심스럽게 통해 부고환 지방을 수확합니다(그림 2C).
      2. 집게로 지방 조직을 부드럽게 잡아 당기고 가위를 사용하여 잘라냅니다. 눈에 보이는 주요 혈관을 해부하지 마십시오(고환과 부고환을 채취해야 하는 경우 생체 후드의 세척 단계에서 제거하십시오).
      3. 제거된 지방을 PBS에 10mL의 1mg/mL BSA가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 조심스럽게 넣습니다.
         참고: 부고환 지방 제거는 사타구니 지방이 제거된 후에 이루어져야 합니다. 부고환 지방은 일반적으로 부피가 작고 사타구니 지방 아래, 고환과 부고환을 둘러싼 복부 피부 아래에 위치합니다.
   3. 후방 피하
      1. 쥐를 엎드린 채 (등쪽이 위로 향하게) 돌리고 큰 가위를 사용하여 피부 바로 아래에서 너무 깊게 자르지 않도록주의하면서 등 (이 부위의 피부가 두껍습니다)의 피부를 두피까지 자릅니다 (그림 2D).
      2. 피부와 조직을 연결하는 근막을 잘라냅니다. 지방은 interscapular 영역에 있습니다. 갈색 지방과 피하 지방을 구별/분리하기 위해 메모해 두십시오. 갈색 지방은 척추에 더 가깝습니다 (그림 2E).
      3. PBS에서 10mL의 1mg/mL BSA와 함께 해당 50mL 원뿔형 튜브에 지방을 분리하고 넣습니다.

그림 2: 다양한 지방 조직 저장소의 분리 . (A) 사타구니 지방 조직의 절제에 필요한 초기 절개. (B) 사타구니 지방 저장소의 위치. (C) 부고환 지방 저장소의 위치, 접근에 필요한 외피의 절개에 주목. (D) 마우스가 추가 지방에 접근하기 쉬운 상태로 배치되면 추가 절개가 필요합니다. (E) 후방 피하 지방 저장소의 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 미세혈관 단편 격리 프로토콜

1. 쥐에서 절제된 지방이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브를 바이오후드에 넣습니다.
2. 집게를 사용하여 지방을 표준 100mm 페트리 접시에 넣습니다(조직을 수분을 유지하기 위해 PBS에 ~0.5mL의 1mg/mL BSA 포함).
3. 지방에서 눈에 보이는 혈관과 근육/외부 조직을 청소하고 제거합니다.
4. ~10분 동안 가위로 지방을 다집니다(10mL 피펫으로 옮길 수 있을 만큼 충분히 다집니다).
5. PBS에 ~0.5mL의 1mg/mL BSA를 추가하여 덩어리를 확인합니다. 필요한 경우 계속 다지십시오.
6. 다진 지방을 10mL 피펫이 있는 멸균 250mL 플라스크에 옮깁니다.
   알림: 피펫을 사용하여 볼륨을 기록하십시오.
7. 최종 부피가 20mL가 되도록 충분한 BSA(1mg/mL)를 추가합니다.
8. PBS에 4mg/mL BSA를 콜라게나제(콜라게나제 최종 농도: 6mg/mL)에 추가합니다(즉, 콜라게나제 72mg의 경우 12mL, 콜라게나제 144mg의 경우 24mL).
   알림: 시간에 민감하므로 다지기가 완료될 때까지 추가하지 마십시오.
9. 원뿔형 튜브를 부드럽게 흔들어 균질한 용액을 확인하고 0.22μm 나일론 네트 필터로 용액을 여과하여 멸균합니다.
10. 부고환 지방의 경우 ~8-10분 동안 소화합니다. 사타구니 및 후방 피하 지방의 경우 37°C 수조에서 ~15-20분 동안 소화하고 플라스크를 전체적으로 원을 그리며 흔듭니다(지방이 몇 덩어리만 남아 있는 곳에 도달하는 순간 멈춥니다).
11. 소화된 지방을 50mL 원추형 튜브(~30mL/튜브가 있어야 함)에 옮기고 튜브에 "소화된 지방"이라고 표시합니다.
12. 튜브를 400 x g 에서 4분 동안 돌립니다. 방사 후 펠릿은 빨간색이어야 합니다(그림 3A).
13. 스핀하는 동안 멸균 37μM 스크린과 500μM 스크린을 PBS에 5mL의 1mg/mL BSA가 포함된 멸균 페트리 접시에 넣어 사용하기 전에 미리 담급니다.
14. 스핀 후 상층액을 "폐기물"이라고 표시된 50mL 원추형 튜브에 디캔팅합니다. 표면 지방을 제거하고 MVF로 만든 펠릿을 방해하지 않도록 부드럽게 디캔테이션을 수행합니다.
15. PBS에 1mg/mL BSA 10mL를 펠릿("소화된 지방")이 들어 있는 튜브에 추가합니다. 펠릿을 2x (위아래로 피펫) 분쇄합니다.
16. 파편을 방해하지 않도록 펠릿을 너무 거칠게 만들지 마십시오.
17. 플라스틱 스크린 홀더 위의 새 페트리 접시에 500μM 스크린을 놓습니다(그림 3B).
18. 동심원을 사용하여 500μM 스크린을 통해 "소화된 펠릿" 튜브에서 피펫 10mL를 추출합니다(그림 3C).
19. PBS에서 5mg/mL BSA의 1mL를 추가로 사용하여 필터를 세척합니다. 원하는 세포는 페트리 접시로 걸러집니다. 따라서 500μM 스크린을 버리고 여과된 액체는 페트리 접시 내부에 저장합니다.
20. 37μM 스크린을 플라스틱 스크린 홀더 위의 새 페트리 접시에 넣습니다.
21. 37μM 스크린을 사용하기 전에 피펫을 교체하여 덩어리를 제거하십시오.
22. 1차 여과로부터 얻어진 액체를 동심원을 이용하여 37 μM 스크린을 통해 피펫화하였다.
23. PBS에서 5mg/mL BSA의 1mL를 추가로 사용하여 필터를 세척합니다. 원하는 세포는 필터에 남아 있으므로 여과된 액체는 버리지만 37μM 스크린은 저장합니다.
24. 37μM 스크린을 PBS에 5mg/mL BSA 1mL가 들어 있는 새 페트리 접시에 밀어 넣습니다.
25. 접시를 원뿔형 홀더에 대고 두드려 흔들어 조각을 제거합니다. 액체/세포가 페트리 접시에서 쏟아질 수 있으므로 너무 세게 흔들지 마십시오.
26. PBS에서 5mg/mL BSA의 1mL를 추가로 사용하여 필터를 헹굽니다. 원하는 세포는 페트리 접시의 액체 용액에 남아 있습니다. 37 μM 스크린과 액체를 함유한 제거된 단편을 다음 단계를 위해 페트리 접시 내부에 저장한다.
27. 액체를 함유하는 BSA+ 단편을 멸균된 50 mL 코니컬 튜브로 옮긴다.
28. 37μM 스크린의 헹굼을 여러 번 더 반복하고(PBS에서 ~5mL의 1mg/mL BSA를 사용할 때마다) 원뿔형 튜브에 추가합니다. 수집된 총 부피가 ~15-20mL가 될 때까지 반복합니다. 궁극적으로, 원하는 세포는 페트리 접시의 액체 용액에서 수집되어 원추형 튜브에 배치됩니다. 이 시점에서, 최종 헹굼 후 37 μM 스크린을 버리고 50 mL 코니컬 튜브 내부에 액체가 포함된 제거된 단편을 저장한다.
29. 가위를 사용하여 200μL 피펫 팁의 끝을 잘라냅니다. 50mL 튜브를 부드럽게 흔들고 20μL의 샘플 2개를 제거한 다음 깨끗한 35mm 페트리 접시에 넣습니다.
30. 페트리 접시의 각 샘플에서 절편 수를 계산하여 분리된 MVF의 총 수를 구합니다.
    총 조각 수 =
31. 액체가 포함된 나머지 분리된 단편을 400 x g 의 50mL 원뿔형 튜브에 4분 동안 회전시켜 MVF를 수집합니다.

그림 3: MVF의 분리. (A) 지방 조직의 소화 후, 스핀다운 후 펠릿과 상청액을 포함하는 MVF의 분리 묘사. (B) MVF의 여과 및 포획을 위한 공급품의 배치. (C) 여과/세척 단계를 위한 동심원 방법의 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 피브린 하이드로겔의 형성

1. 계산 예:
   참고: 아래는 ~15,000-20,000 MVF/mL로 시딩된 MVF와 2:5에서 피브리노겐:트롬빈 겔 비율에 대한 계산이며, 피브리노겐은 20mg/mL 농도로 사용됩니다.
   1. 5개의 250 μL 젤을 만들기 위해서는 총 1,250 μL의 부피가 필요합니다. 따라서 항상 피펫팅 오류를 고려하여 1.5mL의 젤을 충분히 만드십시오.
      1. 다음과 같이 필요한 피브리노겐의 양을 계산하십시오.
         , X₁ = 428.57 μL의 피브리노겐
      2. 다음과 같이 필요한 트롬빈의 양을 계산하십시오.
         , X₂ = 트롬빈 1,071.43μL
      3. 필요한 부피 428.57 μL의 경우 다음과 같이 500 μL의 피브리노겐을 만듭니다.
         20mg/mL * 0.5mL = 피브리노겐 10mg. 500μL의 DMEM에서 이를 재현탁합니다.
      4. 각 젤을 얻으려면 다음과 같이 피브리노겐과 트롬빈의 부피를 계산하십시오.
         1. 피브리노겐 :
            , X₁ = 71.43 μL의 피브리노겐 (DMEM에서) + MVF
         2. 트롬빈:
            , X₂ = 트롬빈 178.57μL
2. MVF 피브린 겔 주조
   1. 50mL 원뿔형 튜브에서 스펀다운 조각에 있는 대부분의 액체를 디캔팅합니다. 피펫을 사용하여 원뿔형 튜브의 가장자리에 걸린 소량의 액체를 제거합니다.
   2. 젤이 만들어질 웰에 트롬빈을 추가합니다(그림 4A).
   3. 200 μL 피펫 팁의 끝을 클립하고 피브리노겐을 사용하여 MVF를 부드럽게 재현탁하여 겔에서 ~15,000-20,000 MVF/mL의 최종 밀도를 얻습니다.
   4. 200μL 피펫 팁의 끝을 클립하고 MVF+피브리노겐을 트롬빈 용액에 부드럽게 넣습니다. 균질한 혼합물을 보장하기 위해 빠르게 위아래로 피펫합니다. 모든 젤이 만들어질 때까지 반복합니다(그림 4B).
   5. 웰 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5%_CO2)에 ~15분 동안 놓아 겔 가교를 허용합니다(그림 4C).
   6. 각 웰에 100-150 μL의 성장 배지를 추가합니다.

그림 4 : MVF 피브린 겔의 형성. (A) 5/7 부분 트롬빈 혼합물이 해당 웰에 피펫팅됩니다. (B) 다음으로, 잘린 피펫 팁(MVF를 방해하지 않기 위해)을 사용하여 2/7 부분 피브리노겐+MVF 혼합물을 웰에 피펫팅하고 부드럽게 혼합합니다. (C) 마지막으로, 완성된 모든 겔을 37°C의 인큐베이터에 넣어 배지를 위에 놓기 전에 하이드로겔이 완전히 고형화되도록 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. MVF의 배양 조건

1. 혈관화되지 않은 백색 및 베이지색 지방 조직(+ GM 대조군)을 배양하기 위해, 도 5에 도시된 타임라인¹⁹를 사용한다.
2. 혈관화된 백색 및 베이지색 지방 조직 (+ GM 대조군)의 배양을 위해, 도 6에 도시된 타임라인¹⁹를 사용한다.
3. 하이드로겔은 연구를 위한 배양 기간 동안 인큐베이터(37°C, 5%_CO2)에서 유지되어야 하며, 배지는 격일로 교체되어야 합니다. 분석을 위한 샘플의 고정 및 취급에 대해서는 이전에 발표된 저작물^16,19,20을 참조하십시오.

그림 5: 비혈관화 지방 조직 형성 시기. 이 수치는 Acosta et ^al.19에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 혈관화된 지방 조직 형성 시기. 이 수치는 Acosta et ^al.19에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

베이지색/갈색 지방 조직의 몇 가지 주요 표현형 형태학적 특징이 있습니다: 다안성/작은 지질 방울을 포함하고, 많은 수의 미토콘드리아를 보유하고(생체 내에서 특징적으로 "갈색"으로 보이는 이유), 이에 따라 높은 산소 소비율/미토콘드리아 생물 에너지를 가지며, 혈관이 많이 형성되고, 지방 분해/인슐린 자극 포도당 흡수가 증가하고, 가장 악명 높게, 열 발생 호흡에 관여하는 미토콘?...

토론

갈색 / 베이지 색 지방 조직 공학 분야는 대체로 미성숙 22,23,24,25,26,27,28이며, 대부분의 지방 모델은 백색 지방 조직 ^8,22,31을 위해 개발되고 있습니다 ....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aminocaproic Acid	Sigma Aldrich	A2504-100G	Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL
Blunt-Tipped Scissors	Fisher scientific	12-000-172	Sterilize in autoclave
Bovin Serum Albumin (BSA)	Millipore	126575-10GM	Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL
Collagenase Type 1	Fisher scientific	NC9633623	Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat
Dexamethasone	Thermo Scientific	AC230302500	Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration
Disposable underpads	Fisher scientific	23-666-062	For fluid absorption during surgery
Dissecting Scissors	Fisher scientific	08-951-5	Sterilize in autoclave
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM)	Fisher scientific	11885092
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12)	Sigma Aldrich	D8062
Fetal Bovine Serum	Fisher scientific	16140089	Added in DMEM to 20% v/v.
Fibrinogen	Sigma Aldrich	F8630-25G	Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel
Flask, 250 mL	Fisher scientific	FB500250	Allows for digestion of fat using a large surface area
Forceps	Fisher scientific	50-264-21	Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration
Human MVF	Advanced Solutions Life Scienes, LLC	https://www.advancedsolutions.com/microvessels	Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study.
Indomethacine	Sigma Aldrich	I7378	Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration
Insulin from porcine pancreas	Sigma Aldrich	I5523	Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration
MycoZap	Fisher scientific	NC9023832	Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Fisher scientific	15140122	Added in DMEM to 1% v/v.
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm).	Fisher scientific	351029	3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm).	Fisher scientific	50-202-036	For counting fragments
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Fisher scientific	14-190-250	Diluted to 1x with sterile deionized water.
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)	Fisher scientific	NC0854141
Rosiglitazone	Fisher scientific	R0106200MG	Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration
Scissors	Fine Science Tools	14059-11	1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping
Screen  37 µM	Carolina Biological Supply Company	652222R	Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris
Screen 500 µM	Carolina Biological Supply Company	652222F	Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris
Serrated Hemostat	Fisher scientific	12-000-171	Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision
Steriflip Filter 0.22 μm	Millipore	SE1M179M6
Thrombin	Fisher scientific	6051601KU	Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin
Thyroid hormone (T3)	Sigma Aldrich	T2877	Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats - obese (FA/FA) or lean (FA/+) male	Charles River	https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611	Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.