基于CRISPR的一步法黑腹果蝇内源性基因标记策略

摘要

在这里，我们提出了一种简化的果蝇内源性基因标记方案，该方案利用基于PCR的技术对成功的基因修饰进行无标记鉴定，从而促进了稳定的敲入系的开发。

摘要

活细胞中蛋白质亚细胞定位、动力学和调控的研究已经随着允许标记内源性基因以产生荧光融合蛋白的技术的出现而发生了深刻的变化。这些方法使研究人员能够实时可视化蛋白质行为，从而为它们在细胞环境中的功能和相互作用提供有价值的见解。目前许多基因标记研究采用两步过程，其中在第一步中使用可见标记（例如眼睛颜色变化）来识别转基因生物，并在第二步中切除可见标记。在这里，我们提出了一种一步法方案，用于在 黑腹果蝇中进行精确和快速的内源性基因标记，从而可以筛选没有可见眼标记的工程系，与过去的方法相比具有显着优势。为了筛选成功的基因标记事件，我们采用基于PCR的技术，通过分析中腿的一小段来对个体果蝇进行基因分型。通过筛选标准的苍蝇随后用于生产稳定的种群。在这里，我们详细介绍了CRISPR编辑质粒的设计和构建，以及用于筛选和确认工程系的方法。总之，该协议显着提高了 果蝇 中内源性基因标记的效率，并能够研究体内细胞过程。

引言

荧光蛋白已成为可视化生物体内细胞中蛋白质定位、动力学和蛋白质-蛋白质相互作用的强大工具 ^1,2。用荧光蛋白标记内源性基因，可以对具有亚细胞分辨率的细胞过程进行长期实时成像。此外，与过表达和免疫染色方法相比，这些内源性基因标记技术具有多项优势。例如，蛋白质的过表达可能导致蛋白质错误折叠、非特异性蛋白质-蛋白质相互作用和错误定位³。迄今为止，研究人员已经能够为一些模式生物（例如出芽酵母）创建与荧光蛋白融合的大量内源性基因库，这些基因可以进行有效的同源重组⁴。在黑腹果蝇的情况下，已经设计了各种工具，如MiMICs⁵、基于转座子的增强子陷阱⁶和fosmids⁷来荧光标记基因。

基于 CRISPR-Cas9 的工具的开发使得在各种模式生物中有效地进行基因组编辑成为可能，包括标记内源性蛋白质 ^8,9。Cas9 是一种 RNA 引导的酶，它以高效和特异性的方式切割双链^DNA8，然后可以通过非同源末端连接 （NHEJ） 通路进行修复，从而导致点突变或缺失。或者，同源定向修复 （HDR） 通路允许将异源 DNA 整合到染色体中。

过去在模式生物果蝇黑腹果蝇中基于CRISPR的基因标记方法依赖于两步过程10,11,12。这涉及使用可辨别的眼睛颜色标记 Dsred 来检测成功的 HDR 事件。之后，将使用 Cre/loxP 重组系统切除 Dsred 标记。为了简化和加快这一过程，在这里，我们提出了一种更简单、更有效的方法。这种方法避免了对致命基因分型的需要，并允许直接筛选单个果蝇。具体来说，我们采用基于PCR的方法从果蝇中腿的一小部分提取DNA，使我们能够对单个果蝇进行基因分型。值得注意的是，此过程不会损害采样苍蝇的活力、运动或繁殖能力。只有通过这种方法确定的适当个体才能进一步发展为稳定的种群。

在这里，我们提出了一个用于生成荧光蛋白标记果蝇的详细方案，其中内源性基因用荧光报告基因标记。该技术使用 CRISPR-Cas9 基因组编辑将任何所需的荧光团标签融合到内源性基因的 N 端或 C 端。下面，我们描述了gRNA质粒和供体质粒的设计和构建，选择CRISPR阳性果蝇的一步筛选策略，以及建立稳定细胞系的步骤。具体来说，我们描述了在C末端用荧光团标记内源性核心时钟 果蝇 基因 周期的策略。我们还简要描述了需要进行的对照实验，以确认标记的蛋白质是功能性的，以及实时成像技术，以可视化完整 果蝇 大脑中活时钟神经元中的周期蛋白¹³。这里描述的方案也广泛适用于通过CRISPR-Cas9基因组编辑筛选特定DNA片段的缺失和插入的候选者。

研究方案

1. 基因编辑试剂的设计与构建

注意:要进行内源性标记，必须鉴定所需基因的各种亚型。根据实验的具体目标，荧光标签可以在内部或在所选蛋白质亚型的 N 端或 C 端掺入。为了获得最佳的CRISPR介导的编辑，将两个sgRNA适当地定位在预期的敲入位点附近至关重要。随后，为了能够通过同源重组进行编辑，应制备包含与靶基因同源的序列以及荧光标签的供体载体。以下是这些过程的分步指南（图 1）。

1. 如下所述设计sgRNA。
   1. 使用以下网站设计 果蝇 的sgRNA:http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ 或 http://www.flyrnai.org/crispr2/。
   2. 对于flycrispr网站，输入所需敲入位置（N端、C端或任何感兴趣的基因组位点）周围的序列±100 bp）。如果使用 nos-Cas9 attP2 作为注射背景，请选择基因组选项黑 腹果蝇 （nos-Cas9 III， BDSC #78782）。Nos-Cas9 系统可确保种系特异性 Cas9 表达。
   3. 为了提高 sgRNA 表达效率，请选择 具有 5' G 选项的 CRISPR 靶标 ，因为以鸟嘌呤开头的 sgRNA 将增强编辑活性。然后，单击 "查找 CRISPR 靶标 "按钮。将显示可能的 sgRNA 序列列表。
   4. 对于每个序列，单击 "评估 "按钮。此操作根据先前选择的基因组检查每个序列的任何潜在脱靶点。从提供的列表中，选择 2 个 偏离靶标为 0 的 sgRNA。确保一个 sgRNA 位于上游，另一个相对于敲入位置位于下游。理想情况下，它们的位置应尽可能靠近敲入位点（<200 bp），但它们不能相互重叠（图2）。
      注意:有时可能很难为给定的靶基因找到合适的sgRNA。sgRNA与敲入位点之间的间隙可以增加到±200 bp。使用不以 G 启动的 sgRNA 可能会略微降低阳性率。
2. 如下所述执行荧光标签选择。
   1. 荧光标签具有多种特性，每种特性都有其独特的优点和缺点^1,2。在确定用于标记特定蛋白质的理想荧光标签时，请注意以下步骤中描述的关键考虑因素。
   2. 鉴于天然蛋白质表达水平通常远低于过表达实验 ^1,2 中的表达水平，请从明亮且光稳定且适合实验设置的标签开始。一些荧光标签，特别是某些 RFP，如 tdTomato 和 DsRed，倾向于形成多聚体¹⁴，并可能导致蛋白质聚集。
   3. 为了增强多功能性，使用柔性接头将表位标签（例如 FLAG 或 V5）连接到荧光标记物，从而进行蛋白质印迹或免疫共沉淀等生化分析。
3. 对于链接器设计，请按照下面描述的步骤操作。
   1. 为了获得最佳功能，请确保目标内源性蛋白和荧光标签分别折叠成各自的功能形式。为此，请使用长度为 2-20 个氨基酸的连接肽。例如，在 Period 蛋白的最后一个氨基酸和敲入荧光蛋白 mNeonGreen 的第一个氨基酸之间放置两个甘氨酸残基。
   2. 确保这些连接肽序列包含甘氨酸和丝氨酸等氨基酸，这赋予结构^灵活性15。这确保了内源性蛋白质的自然行为和位置保持不变。
4. 如下所述设计供体载体。
   注意:供体载体通过同源定向修复过程将荧光标签引入所需的内源性位置，该过程由CRISPR切割启动。因此，除了荧光标签外，供体载体还必须具有标签两侧同源的序列。
   1. 通过组织连接肽的DNA序列和荧光标签来开始供体载体设计，并确保两端（同源臂）两侧有同源序列。为获得最佳结果，请确保同源臂在预期敲入位点的每一侧包含至少 800 个核苷酸（图 2）。
      注:最近的报告表明，同源臂可以更短（100-200 bp）¹⁶。
   2. 确保供体质粒中的任何PAM序列都经过修饰，使得蛋白质的氨基酸序列保持不变。如果 PAM 序列位于 UTR 中，请将其完全删除。
   3. START 和 STOP 密码子的位置取决于标签的位置。对于内部标记，请确保荧光标记与靶基因的编码序列在框架中。对于 N 末端标记，将荧光标签放在内源性起始密码子之前。对于 C 末端标记，将荧光标签放置在自然终止密码子之前，并确保仅保留单个起始密码子，以避免潜在的翻译问题。
5. 合成sgRNA和供体质粒，如下所述。
   1. 对于 sgRNA 质粒的创建，请遵循 U6-gRNA 克隆指南，该指南可在 flycrispr.org/protocols/grna/ 上找到。采用基于替代性限制性内切酶的克隆方法（在提供的资源中称为策略 C）将 gRNA 序列插入 pU6-BbsI-chiRNA 质粒 （Addgene， #45946） 中。
   2. 在 DH5a E 中变换。 大肠杆菌 （NEB，C2987H） 遵循制造商提供的标准转化方案。为了进行验证，使用T3或T7标准测序引物对得到的克隆进行Sanger测序。
   3. 为了创建供体质粒，从商业供应商（例如 IDT）处获取具有所需供体序列的双链 DNA。将其集成到 pBlueScriptII SK（-） 多个克隆位点中。对供体质粒进行测序，以确保 sgRNA 或 PAM 序列被正确修饰，并且质粒中不存在 SNP。
      注意:使用pBlueScriptII进行整合的替代方法是分别PCR同源臂和荧光标签片段，并使用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly等技术将它们整合到骨架中。
6. 使用以下注入和交叉方案。
   1. 为了获得种系编辑的果蝇，将gRNA质粒和供体质粒共同注射到适当的Cas9背景中（例如，nos-Cas9 III，BDSC 78782）。如果使用商业注射服务，请按照供应商的说明进行质粒制备。
      注:通常，gRNA质粒浓度应超过0.5μg/μL，供体质粒浓度应高于1.0μg/μL。从发送质粒样本到接受注射胚胎的常见时间线约为 2 周。本文介绍了一种使用 FM7/L 平衡菌株筛选 X 染色体上基因编辑事件的策略。对于第二条或第三条染色体上的基因，使用适当的平衡菌株。
   2. 对于注射苍蝇（G0）的收集，用二氧化碳麻醉并将雄性苍蝇和处女雌性分开。通过将每个 G0 雄性与至少两个 FM7/L 处女雌性配对在单独的窄 CT 食品瓶中建立苍蝇杂交。将交叉的小瓶放入通风的培养箱中，保持在25°C和~60%湿度下，直到F1苍蝇闭合（FM7 / L是最常用的X染色体平衡器）。同样，将每只 G0 雌性与 FM7/Y 雄性苍蝇配对。
   3. 麻醉并从 G0 雄性和雌性杂交中收集至少 10 个处女雌性后代 （F0）。从 G0 雌性杂交中，收集至少 10 只雄性 F1 苍蝇（图 3A）。确保每只 F1 苍蝇都标有其亲本的详细信息并单独存储。继续执行筛选步骤。
7. 使用以下单腿PCR方案。
   1. 引物创建:设计包含靶基因编辑位点的引物对。理想情况下，引物的熔解温度应相似，约为55°C。
   2. 裂解缓冲液制备:为每个果蝇样品制备 10 μL 裂解缓冲液。缓冲液由 10 mM Tris （pH 8.2）、1 mM EDTA （pH 8.0）、25 mM NaCl 和 400 μg/mL 蛋白酶 K 组成。确保缓冲液在整个腿部解剖过程中保持低温（图3B）。
   3. 管设置:准备玻璃毛细管，一端填充蔗糖琼脂食物（2%琼脂和4%蔗糖），并将其放入96孔深孔板中，该板将被称为苍蝇酒店（图3C）。
   4. 腿部解剖:将二氧化碳麻醉垫放在立体显微镜下，麻醉一只候选苍蝇并切断其中一条腿。将腿放入裂解缓冲液中，确保完全浸泡。无需浸渍腿，直接进行裂解方案步骤（图3B）。用一把细金属镊子夹住苍蝇翅膀，将苍蝇移到苍蝇旅馆，立即用纱线密封管子。
   5. 对照样品:在相同的腿部解剖程序后，可以使用两只野生型果蝇作为阴性对照。稀释的供体质粒作为阳性对照。
   6. 解剖后护理:将苍蝇旅馆饲养在通风的培养箱中，保持在25°C和~60%的湿度下。虽然苍蝇可以在一夜之间存活，但建议在同一天完成后续步骤和交配。
   7. 裂解方案:将断腿置于37°C热循环仪中的裂解缓冲溶液中90分钟，然后95°C5分钟，最后保持在4°C。 这将从每只苍蝇的单腿中提取足够的DNA（图3B）。
   8. PCR反应:按照制造商的指示组织PCR反应，利用1.5μL蝇腿裂解物作为DNA源。
   9. 凝胶电泳:将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。根据条带大小解释凝胶的结果。通常，阴性对照果蝇将表现出较低的条带，而阳性质粒对照将显示出较高的条带。确保特定条带大小与原始供体质粒设计一致。雌性阳性果蝇将显示两条条带，因为它们是杂合子，而雄性阳性果蝇将显示一条条带（图3B）。
      注意:通常，一天内可以筛查 70 只苍蝇。确保在 4 到 5 个不同的 G0 杂交中识别至少 10 个阳性 F1 苍蝇，因为某些 F1 可能由于脱靶突变而不育。
8. 进行以下PCR后交叉设置。
   1. 根据凝胶结果，从苍蝇旅馆中选择阳性果蝇，并将它们与平衡果蝇（用于标记X染色体基因的FM7 / L）单独杂交以产生F2世代。一旦 F2 世代出现，建立兄弟姐妹杂交以创建纯合稳定种群（图 3D）。
   2. 使用纯合母液对编辑位点进行 Sanger 测序，以确保准确性。与野生型苍蝇回交验证的飞线以去除背景突变。使用单腿PCR方案筛选每一代。

结果

在我们的实验中，我们通常发现筛选所有染色体（X、II、III）上的各种内源性标记基因的成功率为 ~20%-30%。这个过程的效率可能因多种因素而异，例如gRNA选择、基因性质和注射质量。在这里，我们说明了我们用 mNeonGreen 荧光团¹³ 标记内源期基因的策略的结果。位于黑腹果蝇X染色体上的周期基因在生物钟中起着关键作用。果蝇?...

讨论

结果展示了一种简化的、简单的基于CRISPR的一步法策略，用于标记 果蝇的内源性基因。在方案中，我们使用两种gRNA来更有效地诱导DNA双链断裂和同源重组。将gRNA和供体质粒注射到果蝇胚胎中，果蝇胚胎在其种系中表达Cas9酶。这些胚胎随后在标准条件下培养直到成年，此时它们与平衡蝇杂交以产生第一代（F1）后代。对每个F1标本的中腿进行PCR基因分型，以筛选转基因果蝇。与目前使用两?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA pH8.0	Invitrogen	AM9260G
5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)	NEB	C2987H
96-well deep well plate	BRAND	701354
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
BbsI-HF	NEB	R3539S
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
D-Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
EcoRI-HF	NEB	R3101S
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A142-212
Prolong Glass Antifade Mounting Medium	Invitrogen	P36982
Proteinase K	QIAGEN	19131
Schneider's Drosophila Medium	Gibco	21720001
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
T4 DNA ligase	NEB	M0202S
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
XbaI	NEB	R0145S