Strategia basata su CRISPR in un'unica fase per il tagging genico endogeno in Drosophila melanogaster

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo di marcatura genica endogena semplificato per Drosophila, che utilizza una tecnica basata sulla PCR per l'identificazione senza marcatori di modificazioni genetiche di successo, facilitando lo sviluppo di linee knock-in stabili.

Abstract

Lo studio della localizzazione, della dinamica e della regolazione subcellulare delle proteine nelle cellule vive è stato profondamente trasformato dall'avvento di tecniche che consentono il tagging di geni endogeni per produrre proteine di fusione fluorescenti. Questi metodi consentono ai ricercatori di visualizzare il comportamento delle proteine in tempo reale, fornendo preziose informazioni sulle loro funzioni e interazioni all'interno dell'ambiente cellulare. Molti studi attuali di marcatura genica impiegano un processo in due fasi in cui i marcatori visibili, come i cambiamenti del colore degli occhi, vengono utilizzati per identificare gli organismi geneticamente modificati nella prima fase e il marcatore visibile viene asportato nella seconda fase. Qui, presentiamo un protocollo in un'unica fase per eseguire un marcatura genica endogena precisa e rapida in Drosophila melanogaster, che consente lo screening di linee ingegnerizzate senza il marcatore oculare visibile, offrendo un vantaggio significativo rispetto ai metodi passati. Per lo screening di eventi di marcatura genica di successo, impieghiamo una tecnica basata sulla PCR per genotipizzare i singoli moscerini analizzando un piccolo segmento della loro zampa centrale. Le mosche che superano i criteri di screening vengono quindi utilizzate per produrre stock stabili. Qui, descriviamo in dettaglio la progettazione e la costruzione di plasmidi di editing CRISPR e metodi per lo screening e la conferma di linee ingegnerizzate. Insieme, questo protocollo migliora significativamente l'efficienza del tagging genico endogeno in Drosophila e consente studi sui processi cellulari in vivo.

Introduzione

Le proteine fluorescenti sono emerse come potenti strumenti per visualizzare la localizzazione, la dinamica e le interazioni proteina-proteina nelle cellule all'interno degli organismi viventi ^1,2. L'etichettatura di geni endogeni con proteine fluorescenti consente l'imaging dal vivo a lungo termine dei processi cellulari con risoluzione subcellulare. Inoltre, queste tecniche di marcatura genica endogena presentano diversi vantaggi rispetto agli approcci di sovraespressione e immunocolorazione. Ad esempio, la sovraespressione delle proteine potrebbe portare a un misfolding proteico, a interazioni proteina-proteina non specifiche e a un'errata localizzazione³. Ad oggi, i ricercatori sono stati in grado di creare vaste librerie di geni endogeni fusi a proteine fluorescenti per alcuni organismi modello, come il lievito in gemmazione, che possono subire un'efficiente ricombinazione omologa⁴. Nel caso di Drosophila melanogaster, sono stati messi a punto vari strumenti come le MiMICs⁵, le trappole enhancer⁶ basate su trasposoni e i fosmidi⁷ per marcare i geni in modo fluorescente.

Lo sviluppo di strumenti basati su CRISPR-Cas9 ha reso possibile eseguire in modo efficiente l'editing del genoma, compresa la marcatura di proteine endogene, in un'ampia gamma di organismi modello ^8,9. Cas9 è un enzima guidato dall'RNA che scinde il DNA a doppio filamento in modo altamente efficiente e specifico⁸, che può quindi essere riparato da una via di giunzione non omologa (NHEJ) che porta a mutazioni puntiformi o delezioni. In alternativa, la via di riparazione diretta dall'omologia (HDR) consente l'integrazione del DNA eterologo nel cromosoma.

I metodi precedenti per la marcatura genica basata su CRISPR nell'organismo modello, Drosophila melanogaster, si sono basati su un processo in due fasi 10,11,12. Ciò comporta l'utilizzo di un marcatore del colore degli occhi distinguibile, Dsred, per rilevare eventi HDR di successo. Successivamente, il marcatore Dsred verrebbe asportato utilizzando il sistema di ricombinazione Cre/loxP. Per semplificare e accelerare questo processo, qui presentiamo un metodo più semplice ed efficiente. Questo approccio aggira la necessità di genotipizzazione letale e consente lo screening diretto dei singoli moscerini. In particolare, impieghiamo un approccio basato sulla PCR per estrarre il DNA da un piccolo segmento della zampa centrale della mosca, consentendoci di genotipizzare i singoli moscerini. In particolare, questa procedura non compromette la vitalità, il movimento o le capacità riproduttive della mosca campionata. Solo gli individui appropriati, identificati attraverso questo metodo, vengono ulteriormente sviluppati in stock stabili.

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la generazione di mosche marcate con proteine fluorescenti in cui i geni endogeni sono marcati con reporter fluorescenti. Questa tecnica utilizza l'editing del genoma CRISPR-Cas9 per fondere qualsiasi tag fluoroforo desiderato al terminale N o C di un gene endogeno. Di seguito, descriviamo la progettazione e la costruzione di plasmidi gRNA e di un plasmide donatore, la strategia di screening in un'unica fase per selezionare i moscerini positivi a CRISPR e i passaggi per stabilire linee stabili. In particolare, descriviamo strategie per marcare un gene endogeno dell'orologio centrale della Drosophila, punto, con un fluoroforo al C-terminale. Descriviamo anche brevemente gli esperimenti di controllo che devono essere eseguiti per confermare che la proteina marcata è funzionale e tecniche di imaging dal vivo per visualizzare la proteina del periodo nei neuroni dell'orologio vivo all'interno di cervelli intatti di Drosophila ¹³. Il protocollo qui descritto è anche ampiamente applicabile ai candidati allo screening per le delezioni e gli inserimenti di specifici frammenti di DNA mediante l'editing del genoma CRISPR-Cas9.

Protocollo

1. Progettazione e costruzione di reagenti per l'editing genetico

NOTA: Per effettuare la marcatura endogena è fondamentale identificare le varie isoforme del gene desiderato. A seconda degli obiettivi specifici dell'esperimento, un tag fluorescente può essere incorporato internamente o ai termini N o C dell'isoforma proteica selezionata. Per un editing ottimale mediato da CRISPR, è fondamentale posizionare i due sgRNA adeguatamente vicini al sito knock-in previsto. Successivamente, per consentire l'editing attraverso la ricombinazione omologa, è necessario preparare un vettore donatore che comprenda sequenze omologhe al gene bersaglio, insieme al tag fluorescente. Di seguito è riportata una guida dettagliata a questi processi (Figura 1).

1. Progettare l'sgRNA come descritto di seguito.
   1. Progetta sgRNA per Drosophila utilizzando questi siti web: http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ o http://www.flyrnai.org/crispr2/.
   2. Per il sito web flycrispr, inserire la sequenza ±100 bp che circonda la posizione di knock-in desiderata (terminale N, terminale C o qualsiasi locus genomico di interesse). Se si utilizza nos-Cas9 attP2 come sfondo per l'iniezione, scegliere l'opzione genoma Drosophila melanogaster (nos-Cas9 III, BDSC #78782). Il sistema Nos-Cas9 garantisce l'espressione di Cas9 specifica per la linea germinale.
   3. Per migliorare l'efficienza dell'espressione di sgRNA, selezionare i bersagli CRISPR con l'opzione 5' G , poiché gli sgRNA che iniziano con una guanina miglioreranno l'attività di editing. Quindi, fai clic sul pulsante Trova obiettivi CRISPR . Verrà visualizzato un elenco di possibili sequenze di sgRNA.
   4. Per ogni sequenza, fate clic sul pulsante Valuta . Questa azione verifica la presenza di potenziali bersagli per ogni sequenza in base al genoma selezionato in precedenza. Dall'elenco fornito, scegli 2 sgRNA che hanno 0 target off. Assicurarsi che un sgRNA sia a monte e l'altro a valle rispetto alla posizione di knock-in. Idealmente, le loro posizioni dovrebbero essere il più vicino possibile al sito di knock-in (<200 bp), ma non devono sovrapporsi l'una all'altra (Figura 2).
      NOTA: A volte potrebbe essere difficile trovare sgRNA appropriati per un determinato gene bersaglio. Il divario tra gli sgRNA e la posizione knock-in può essere aumentato fino a ± 200 bp. L'uso di sgRNA che non iniziano con G potrebbe ridurre leggermente il tasso di positività.
2. Eseguire la selezione del tag fluorescente come descritto di seguito.
   1. I tag fluorescenti offrono una vasta gamma di caratteristiche, ognuna con i propri vantaggi e svantaggi^{unici 1,2}. Quando si determina il tag fluorescente ideale per marcare una proteina specifica, è necessario prestare attenzione alle considerazioni chiave descritte nei passaggi seguenti che entrano in gioco.
   2. Dato che i livelli naturali di espressione proteica sono in genere molto più bassi di quelli osservati negli esperimenti di sovraespressione ^1,2, iniziare con i tag che sono luminosi e fotostabili e che si adattano alla configurazione sperimentale. Alcuni tag fluorescenti, in particolare alcune RFP come tdTomato e DsRed, tendono a formare multimeri¹⁴ e possono portare all'aggregazione proteica.
   3. Per una maggiore versatilità, è possibile collegare i tag dell'epitopo (ad esempio, FLAG o V5) al marcatore fluorescente utilizzando un linker flessibile, che consente analisi biochimiche come Western Blot o Co-Immunoprecipitazione.
3. Per la progettazione del linker, seguire la procedura descritta di seguito.
   1. Per una funzionalità ottimale, assicurarsi che sia la proteina endogena di interesse che il tag fluorescente si ripieghino separatamente nelle rispettive forme funzionali. Per raggiungere questo obiettivo, utilizzare un peptide linker di lunghezza compresa tra 2 e 20 amminoacidi. Ad esempio, posizionare due residui di glicina tra l'ultimo amminoacido della proteina Mestruale e il primo amminoacido della proteina fluorescente knock-in mNeonGreen.
   2. Assicurarsi che queste sequenze peptidiche linker comprendano aminoacidi come la glicina e la serina, che conferiscono flessibilità alla struttura¹⁵. Ciò garantisce che il comportamento naturale e la posizione della proteina endogena rimangano inalterati.
4. Progettare il vettore donatore come descritto di seguito.
   NOTA: Il vettore donatore introduce il tag fluorescente nella posizione endogena desiderata attraverso il processo di riparazione diretta dall'omologia, che viene avviato dalla scissione CRISPR. Pertanto, oltre al tag fluorescente, il vettore donatore deve possedere sequenze omologhe su entrambi i lati del tag.
   1. Iniziare la progettazione del vettore donatore organizzando la sequenza di DNA del peptide linker e del tag fluorescente e assicurarsi che vi siano sequenze omologhe che fiancheggiano entrambe le estremità (bracci omologici). Per ottenere risultati ottimali, assicurarsi che i bracci di omologia comprendano almeno 800 nucleotidi su ciascun lato del sito di knock-in previsto (Figura 2).
      NOTA: Recenti studi suggeriscono che i bracci di omologia possono essere più corti (100-200 bp)¹⁶.
   2. Assicurarsi che tutte le sequenze PAM all'interno del plasmide donatore siano modificate in modo tale che la sequenza aminoacidica della proteina risultante rimanga invariata. Se la sequenza PAM si trova nell'UTR, rimuoverla completamente.
   3. Il posizionamento del codone START e STOP dipende dalla posizione del tag. Per l'etichettatura interna, assicurarsi che l'etichetta fluorescente sia inquadrata con la sequenza codificante del gene bersaglio. Per l'etichettatura N-terminale, posizionare il tag fluorescente prima del codone di inizio endogeno. Per l'etichettatura C-terminale, posizionare il tag fluorescente prima del codone di stop naturale e assicurarsi di mantenere un solo codone di inizio per evitare potenziali problemi di traduzione.
5. Sintetizzare sgRNA e plasmidi donatori come descritto di seguito.
   1. Per la creazione di plasmidi di sgRNA, seguire le linee guida per il clonaggio di U6-gRNA, disponibili all'indirizzo flycrispr.org/protocols/grna/. Impiegare l'approccio di clonaggio alternativo basato su enzimi di restrizione (indicato come strategia C nella risorsa fornita) per inserire la sequenza di gRNA nel plasmide pU6-BbsI-chiRNA (Addgene, #45946).
   2. Trasforma in DH5a E. ( NEB, C2987H) secondo i protocolli di trasformazione standard forniti dal fabbricante. Per la verifica, eseguire il sequenziamento Sanger sui cloni risultanti utilizzando primer di sequenziamento standard T3 o T7.
   3. Per la creazione di plasmidi donatori, acquisire DNA a doppio filamento con la sequenza donatrice desiderata da fornitori commerciali (ad es. IDT). Integrarlo nel sito di clonazione multipla pBlueScriptII SK(-). Sequenziare il plasmide del donatore per garantire che le sequenze di sgRNA o PAM siano modificate correttamente e che non siano presenti SNP nel plasmide.
      NOTA: Un'alternativa all'integrazione con pBlueScriptII è quella di PCR i bracci di omologia e i segmenti di tag fluorescenti separatamente e consolidarli nella spina dorsale utilizzando tecniche come il Golden Gate Assembly o il Gibson Assembly.
6. Utilizzare il seguente schema di iniezione e incrocio.
   1. Per acquisire moscerini modificati con linea germinale, co-iniettare plasmidi di gRNA e il plasmide donatore nel background Cas9 appropriato (ad esempio, nos-Cas9 III, BDSC 78782). Se si utilizzano servizi di iniezione commerciali, seguire le istruzioni del fornitore per eseguire la preparazione del plasmide.
      NOTA: In genere, la concentrazione del plasmide di gRNA deve superare 0,5 μg/μL e la concentrazione del plasmide del donatore deve essere superiore a 1,0 μg/μL. Una tempistica comune dall'invio di campioni di plasmidi alla ricezione degli embrioni iniettati è di circa 2 settimane. Una strategia per lo screening di eventi di editing genetico sul cromosoma X che impiega il ceppo bilanciatore FM7/L è presentata qui. Per i geni sul secondo o terzo cromosoma, utilizzare i ceppi bilanciatori appropriati.
   2. Per la raccolta delle mosche iniettate (G0), anestetizzare con anidride carbonica e separare le mosche maschi e le femmine vergini. Stabilire incroci di mosca accoppiando ogni maschio G0 con almeno due femmine vergini FM7/L in singole fiale di cibo CT strette. Mettere le fiale incrociate in un'incubatrice ventilata mantenuta a 25°C e ~60% di umidità fino a quando F1 non vola vicino (FM7/L è il bilanciatore del cromosoma X più comunemente usato). Allo stesso modo, accoppia ogni femmina G0 con mosche maschi FM7/Y.
   3. Anestetizzare e raccogliere almeno 10 femmine vergini (F1) da incroci maschili e femminili G0. Dagli incroci femminili G0, raccogli almeno 10 mosche F1 maschi (Figura 3A). Assicurati che ogni mosca F1 sia etichettata con i dettagli della sua parentela e conservata separatamente. Procedere alla fase di screening.
7. Utilizzare il seguente protocollo PCR a gamba singola.
   1. Creazione di primer: progettare una coppia di primer che comprenda il sito di editing del gene bersaglio. Idealmente, le temperature di fusione dei primer dovrebbero essere simili, intorno ai 55°C.
   2. Preparazione del tampone di lisi: Preparare 10 μL di tampone di lisi per ogni campione di mosca. Il tampone è costituito da 10 mM di Tris (pH 8,2), 1 mM di EDTA (pH 8,0), 25 mM di NaCl e 400 μg/mL di proteinasi K. Preparare il tampone di lisi come miscela principale, quindi distribuire 10 μL in ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti. Assicurarsi che il tampone rimanga freddo durante tutto il processo di dissezione della gamba (Figura 3B).
   3. Configurazione delle provette: Preparare le provette capillari di vetro, riempiendo un'estremità con cibo a base di saccarosio (2% di agar e 4% di saccarosio) e posizionarle in una piastra a 96 pozzetti profondi, che verrà indicata come hotel mosca (Figura 3C).
   4. Dissezione della gamba: posizionare il tampone per anestesia con anidride carbonica sotto uno stereomicroscopio, anestetizzare una mosca candidata e recidere una delle gambe centrali. Posizionare la gamba nel tampone di lisi, assicurando un'immersione completa. Non è necessario macerare la gamba, procedere direttamente alla fase del protocollo di lisi (Figura 3B). Tenere l'ala della mosca con un paio di pinze di metallo fine, spostare la mosca nell'hotel della mosca e sigillare immediatamente il tubo con del filo.
   5. Campioni di controllo: due mosche wild-type possono essere utilizzate come controlli negativi seguendo la stessa procedura di dissezione delle zampe. Un plasmide donatore diluito funge da controllo positivo.
   6. Cura post-dissezione: Alloggiare l'hotel della mosca in un'incubatrice ventilata mantenuta a 25 °C e ~60% di umidità. Sebbene le mosche possano sopravvivere durante la notte, si consiglia di completare i passaggi successivi e l'accoppiamento entro lo stesso giorno.
   7. Protocollo di lisi: Mettere le gambe recise nella soluzione tampone di lisi in un termociclatore impostato a 37 °C per 90 minuti, seguito da 95 °C per 5 minuti, infine tenuto a 4 °C. In questo modo si estrarrà una quantità sufficiente di DNA dalla singola zampa di ogni mosca (Figura 3B).
   8. Reazione PCR: Organizzare la reazione PCR come indicato dal produttore, utilizzando 1,5 μL di lisato di zampe di mosca come fonte di DNA.
   9. Elettroforesi su gel: Sottoporre i prodotti PCR all'elettroforesi su gel di agarosio. Interpreta i risultati del gel in base alle dimensioni della fascia. In genere, i moscerini di controllo negativi mostreranno una banda più bassa e i controlli plasmidici positivi mostreranno una banda più alta. Assicurarsi che le dimensioni specifiche della banda siano coerenti con il design originale del plasmide del donatore. Le femmine di mosche positive mostreranno due bande in quanto eterozigoti, mentre i maschi positivi presenteranno una singola banda (Figura 3B).
      NOTA: Di solito, lo screening di 70 mosche è realizzabile in un solo giorno. Assicurarsi di identificare un minimo di 10 mosche F1 positive in 4 o 5 incroci G0 distinti, poiché alcune mosche F1 potrebbero essere sterili a causa di mutazioni fuori bersaglio.
8. Eseguire il seguente set-up incrociato post-PCR.
   1. Sulla base dei risultati del gel, selezionare i moscerini positivi dall'hotel del moscerino e incrociarli singolarmente con i moscerini bilanciatori (FM7/L per marcare i geni del cromosoma X) per produrre la generazione F2. Una volta emersa la generazione F2, stabilire incroci di pari livello per creare ceppi stabili omozigoti (Figura 3D).
   2. Utilizzare supporti omozigoti per il sequenziamento Sanger del sito di editing per garantire l'accuratezza. Linee di mosca convalidate con backcross con mosche wild-type per rimuovere le mutazioni di fondo. Eseguire lo screening di ogni generazione utilizzando il protocollo PCR a gamba singola.

Risultati

Nei nostri esperimenti, abbiamo in genere riscontrato un tasso di successo di ~20%-30% nello screening per vari geni marcati endogeni su tutti i cromosomi (X, II, III). L'efficienza di questo processo può variare in base a diversi fattori, come la selezione del gRNA, la natura del gene e la qualità dell'iniezione. Qui, illustriamo i risultati della nostra strategia per marcare il gene del periodo endogeno con il fluoroforo mNeonGreen¹³. Il gene mestr...

Discussione

I risultati dimostrano una strategia semplificata e semplice basata su CRISPR in un solo passaggio per l'etichettatura dei geni endogeni in Drosophila. Nel protocollo, utilizziamo due gRNA per indurre la rottura del doppio filamento del DNA e la ricombinazione omologa in modo più efficiente. I gRNA e il plasmide donatore vengono iniettati in embrioni di moscerino della frutta, che esprimono l'enzima Cas9 nella loro linea germinale. Questi embrioni vengono successivamente coltivati in condizioni standard fino al...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA pH8.0	Invitrogen	AM9260G
5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)	NEB	C2987H
96-well deep well plate	BRAND	701354
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
BbsI-HF	NEB	R3539S
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
D-Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
EcoRI-HF	NEB	R3101S
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A142-212
Prolong Glass Antifade Mounting Medium	Invitrogen	P36982
Proteinase K	QIAGEN	19131
Schneider's Drosophila Medium	Gibco	21720001
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
T4 DNA ligase	NEB	M0202S
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
XbaI	NEB	R0145S