Drosophila melanogaster의 내인성 유전자 태깅을 위한 원스텝 CRISPR 기반 전략

요약

여기에서는 성공적인 유전자 변형의 마커 없는 식별을 위해 PCR 기반 기술을 활용하여 안정적인 knock-in 라인의 개발을 촉진하는 초파리에 대한 단순화된 내인성 유전자 태깅 프로토콜을 제시합니다.

초록

살아있는 세포에 있는 단백질 subcellular 국소화, 동역학 및 규칙에 대한 학문은 형광 융합 단백질을 생성하기 위하여 내인성 유전자의 표를 붙이는 것을 허용하는 기술의 출현에 의해 근본적으로 변형되었습니다. 이러한 방법을 통해 연구자들은 단백질 거동을 실시간으로 시각화하여 세포 환경 내에서 단백질의 기능과 상호 작용에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 현재 많은 유전자 태그 연구는 첫 번째 단계에서 눈 색깔 변화와 같은 가시 마커를 사용하여 유전자 변형 유기체를 식별하고 두 번째 단계에서 가시 마커를 제거하는 2단계 프로세스를 사용합니다. 여기에서는 눈에 보이는 아이 마커 없이 조작된 라인을 스크리닝할 수 있는 Drosophila melanogaster에서 정확하고 신속한 내인성 유전자 태깅을 수행하기 위한 원스텝 프로토콜을 제시하여 기존 방법에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 성공적인 유전자 태그 부착 이벤트를 스크리닝하기 위해 PCR 기반 기술을 사용하여 중간 다리의 작은 부분을 분석하여 개별 파리의 유전자형을 분석합니다. 스크리닝 기준을 통과한 파리는 안정적인 주식을 생산하는 데 사용됩니다. 여기에서는 CRISPR 편집 플라스미드의 설계 및 구성과 엔지니어링 라인의 스크리닝 및 확인 방법에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 Drosophila 에서 내인성 유전자 태깅의 효율성을 크게 향상시키고 생체 내 세포 과정 연구를 가능하게 합니다.

서문

형광 단백질은 살아있는 유기체 내 세포의 단백질 국소화, 역학 및 단백질-단백질 상호 작용을 시각화하기 위한 강력한 도구로 부상했습니다 ^1,2. 형광 단백질로 내인성 유전자를 태깅하면 세포 내 분해능으로 세포 과정의 장기 라이브 이미징이 가능합니다. 또한, 이러한 내인성 유전자 표지 기술은 과발현 및 면역염색 접근법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 예를 들어, 단백질의 과발현은 단백질 잘못 접힘, 비특이적 단백질-단백질 상호작용 및 잘못된 국소화를 유발할 수 있다³. 현재까지 연구자들은 효율적인 상동 재조합을 겪을 수 있는 신진 효모와 같은 몇 가지 모델 유기체를 위해 형광 단백질에 융합된 내인성 유전자의 방대한 라이브러리를 만들 수 있었다⁴. Drosophila melanogaster의 경우, 유전자를 형광 태깅하기 위해 MiMICs⁵, transposon 기반 enhancer traps⁶ 및 fosmids⁷과 같은 다양한 도구가 고안되었습니다.

CRISPR-Cas9 기반 도구의 개발로 광범위한 모델 유기체 ^8,9에서 내인성 단백질 태깅을 포함한 게놈 편집을 효율적으로 수행할 수 있게 되었습니다. Cas9은 매우 효율적이고 특이적인 방식으로 이중 가닥 DNA를 절단하는 RNA 유도 효소입니다^.8 그런 다음 점 돌연변이 또는 결실로 이어지는 비상동 말단 결합(NHEJ) 경로에 의해 복구될 수 있습니다. 대안적으로, 상동성 유도 복구(homology-directed repair, HDR) 경로는 이종 DNA를 염색체에 통합할 수 있도록 합니다.

모델 유기체인 Drosophila melanogaster에서 CRISPR 기반 유전자 태깅을 위한 과거의 방법은 2단계 프로세스 10,11,12에 의존했습니다. 여기에는 식별 가능한 눈 색깔 마커인 Dsred를 사용하여 성공적인 HDR 이벤트를 감지하는 작업이 포함됩니다. 그 후, Dsred 마커는 Cre/loxP 재조합 시스템을 사용하여 절제됩니다. 이 프로세스를 간소화하고 신속하게 처리하기 위해 여기서는 더 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 이 접근법은 치명적인 유전형 분석의 필요성을 피하고 개별 파리를 직접 스크리닝할 수 있습니다. 특히, PCR 기반 접근법을 사용하여 파리의 중간 다리의 작은 부분에서 DNA를 추출하여 개별 파리의 유전자형을 분석할 수 있습니다. 주목할 만한 점은, 이 절차는 표본을 채취한 파리의 활력, 움직임 또는 번식 능력을 손상시키지 않는다는 것입니다. 이 방법을 통해 식별된 적절한 개인만이 안정적인 주식으로 더욱 발전합니다.

여기에서는 형광 리포터로 내인성 유전자를 표지하는 형광 단백질 표지 파리를 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 CRISPR-Cas9 게놈 편집을 사용하여 원하는 형광단 태그를 내인성 유전자의 N 또는 C 말단에 융합합니다. 아래에서는 gRNA 플라스미드와 donor plasmid의 설계 및 구성, CRISPR 양성 파리를 선별하기 위한 원스텝 스크리닝 전략, 안정적인 계통을 확립하기 위한 단계에 대해 설명합니다. 구체적으로, 내인성 코어 클럭 초파리 유전자(endogenous core clock Drosophila gene, period)에 C-말단의 형광단(fluorophore)을 태그하는 전략을 설명합니다. 또한 태그된 단백질이 기능적인지 확인하기 위해 수행해야 하는 대조군 실험과 온전한 초파리 뇌 내의 생체 시계 뉴런에서 기간 단백질을 시각화하기 위한 라이브 이미징 기술에 대해 간략하게 설명합니다¹³. 여기에 설명된 프로토콜은 CRISPR-Cas9 게놈 편집에 의한 DNA의 특정 비트의 삭제 및 삽입을 위한 후보 물질 스크리닝에도 광범위하게 적용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 유전자 편집 시약의 설계 및 구축

참고: 내인성 태깅을 수행하려면 원하는 유전자의 다양한 동형을 식별하는 것이 필수적입니다. 실험의 특정 목표에 따라 형광 태그를 내부적으로 또는 선택한 단백질 동형의 N- 또는 C-말단에 통합할 수 있습니다. 최적의 CRISPR 매개 편집을 위해서는 두 개의 sgRNA를 의도한 knock-in 부위에 적절하게 가깝게 배치하는 것이 중요합니다. 그 후, 상동 재조합을 통한 편집을 가능하게 하기 위해, 형광 태그와 함께 표적 유전자와 상동성 서열을 포함하는 donor 벡터를 준비해야 합니다. 다음은 이러한 프로세스에 대한 단계별 가이드입니다(그림 1).

1. 아래에 설명된 대로 sgRNA를 설계합니다.
   1. http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ 또는 http://www.flyrnai.org/crispr2/ 웹사이트를 사용하여 초파리 에 대한 sgRNA를 설계합니다.
   2. flycrispr 웹 사이트의 경우 원하는 knock-in 위치(N 말단, C 말단 또는 관심 게놈 자리)를 둘러싼 서열 ±100bp를 입력합니다. nos-Cas9 attP2를 주입 배경으로 사용하는 경우 게놈 옵션 Drosophila melanogaster(nos-Cas9 III, BDSC #78782)를 선택합니다. Nos-Cas9 시스템은 생식세포 특이적 Cas9 발현을 보장합니다.
   3. sgRNA 발현 효율을 높이려면 구아닌으로 시작하는 sgRNA가 편집 활성을 향상시키기 때문에 5' G 옵션이 있는 CRISPR 표적 을 선택하십시오. 그런 다음 Find CRISPR Targets 버튼을 클릭합니다. 가능한 sgRNA 염기서열 목록이 표시됩니다.
   4. 각 시퀀스에 대해 [평가] 버튼을 클릭합니다. 이 작업은 이전에 선택한 게놈을 기반으로 각 염기서열에 대한 잠재적인 오프 타겟을 확인합니다. 제공된 목록에서 off-target이 0인 2개의 sgRNA를 선택합니다. knock-in 위치를 기준으로 한 sgRNA는 업스트림에 있고 다른 하나는 다운스트림에 있는지 확인합니다. 이상적으로는 위치가 가능한 한 넉인 부위에 가까워야 하지만(<200bp) 서로 겹치지 않아야 합니다(그림 2).
      참고: 주어진 표적 유전자에 적합한 sgRNA를 찾는 것이 때때로 어려울 수 있습니다. sgRNA와 knock-in 위치 사이의 간격은 ± 200bp까지 증가할 수 있습니다. G로 시작하지 않는 sgRNA를 사용하면 양성률이 약간 감소할 수 있습니다.
2. 아래 설명에 따라 형광 태그 선택을 수행합니다.
   1. 형광 태그는 다양한 특성을 제공하며, 각각 고유한 장점과 단점이 있습니다 ^1,2. 특정 단백질을 라벨링하기 위한 이상적인 형광 태그를 결정할 때 다음 단계에 설명된 주요 고려 사항을 확인하십시오.
   2. 천연 단백질 발현 수준이 일반적으로 과발현 실험 ^1,2에서 볼 수 있는 수준보다 훨씬 낮다는 점을 감안할 때, 밝고 광안정성이 있으며 실험 설정에 맞는 태그로 시작하십시오. 일부 형광 태그, 특히 tdTomato 및 DsRed와 같은 특정 RFP는 멀티머(^multimer)14를 형성하는 경향이 있으며 단백질 응집을 유도할 수 있다.
   3. 다기능성을 강화하기 위해 유연한 링커를 사용하여 에피토프 태그(예: FLAG 또는 V5)를 형광 마커에 연결하면 Western Blot 또는 Co-Immunoprecipitation과 같은 생화학적 분석이 가능합니다.
3. 링커 설계의 경우 아래에 설명된 단계를 수행합니다.
   1. 최적의 기능을 위해 관심 내인성 단백질과 형광 태그가 각각의 기능적 형태로 개별적으로 접히도록 해야 합니다. 이를 달성하려면 길이가 2-20 아미노산 인 링커 펩타이드를 사용하십시오. 예를 들어, Period 단백질의 마지막 아미노산과 knock-in 형광 단백질 mNeonGreen의 첫 번째 아미노산 사이에 두 개의 글리신 잔기를 배치합니다.
   2. 이들 링커 펩티드 서열이 글리신 및 세린과 같은 아미노산을 포함하는지 확인하고, 이는 구조¹⁵에 유연성을 부여한다. 이렇게 하면 내인성 단백질의 자연적인 거동과 위치가 변경되지 않은 상태로 유지됩니다.
4. 아래에 설명된 대로 기증자 벡터를 설계합니다.
   NOTE: donor 벡터는 CRISPR 분할에 의해 시작되는 상동성 유도 복구 과정을 통해 원하는 내인성 위치에 형광 태그를 도입합니다. 따라서 형광 태그 외에도 donor 벡터는 태그의 양쪽에서 상동적인 서열을 가져야 합니다.
   1. 링커 펩타이드와 형광 태그의 DNA 염기서열을 구성하여 donor 벡터 디자인을 시작하고 양쪽 말단(homology arm) 측면에 상동 염기서열이 있는지 확인합니다. 최적의 결과를 얻으려면 상동성 암이 의도한 knock-in 부위의 각 측면에 최소 800개의 뉴클레오티드를 포함하는지 확인하십시오(그림 2).
      참고: 최근 보고서에 따르면 상동성 암은 더 짧을 수 있습니다(100-200 bp)¹⁶.
   2. donor plasmid 내의 모든 PAM 염기서열이 생성된 단백질의 아미노산 염기서열이 변하지 않는 방식으로 변형되도록 합니다. PAM 시퀀스가 UTR에 있는 경우 완전히 제거합니다.
   3. START 및 STOP 코돈의 위치는 태그의 위치에 따라 다릅니다. 내부 태깅의 경우 형광 태그가 표적 유전자의 코딩 서열과 함께 프레임에 있는지 확인합니다. N-말단 태깅의 경우, 내인성 시작 코돈 앞에 형광 태그를 배치합니다. C-말단 태깅의 경우, 형광 태킹을 자연 정지 코돈 앞에 배치하고 잠재적인 번역 문제를 피하기 위해 단일 시작 코돈만 유지해야 합니다.
5. 아래에 설명된 대로 sgRNA 및 donor plasmid를 합성합니다.
   1. sgRNA 플라스미드 생성을 위해 U6-gRNA 클로닝 가이드라인(flycrispr.org/protocols/grna/)을 따르십시오. gRNA 염기서열을 pU6-BbsI-chiRNA 플라스미드에 삽입하기 위해 선택적 제한 효소 기반 클로닝 접근법(제공된 리소스에서 전략 C라고 함)을 사용합니다(Addgene, #45946).
   2. DH5a E로 변환합니다. 대장균 (NEB, C2987H) 은 제조업체에서 제공한 표준 변형 프로토콜을 따릅니다. 검증을 위해 T3 또는 T7 표준 염기서열분석 프라이머를 사용하여 생성된 클론에 대해 Sanger 염기서열분석을 수행합니다.
   3. donor plasmid를 생성하기 위해 상용 공급업체(예: IDT)에서 원하는 donor 염기서열을 가진 double-stranded DNA를 획득합니다. pBlueScriptII SK(-) 다중 복제 사이트에 통합합니다. donor plasmid의 염기서열을 분석하여 sgRNA 또는 PAM 염기서열이 올바르게 수정되고 plasmid에 SNP가 존재하지 않도록 합니다.
      참고: pBlueScriptII를 사용한 통합의 대안은 상동성 암과 형광 태그 세그먼트를 별도로 PCR하고 Golden Gate Assembly 또는 Gibson Assembly와 같은 기술을 사용하여 백본에 통합하는 것입니다.
6. 다음 주입 및 교차 방식을 사용합니다.
   1. 생식세포 편집 파리를 획득하려면 gRNA 플라스미드와 donor 플라스미드를 적절한 Cas9 배경(예: nos-Cas9 III, BDSC 78782)에 동시 주입합니다. 상용 주사 서비스를 이용하는 경우, 공급업체의 지시에 따라 플라스미드 전처리를 수행합니다.
      참고: 일반적으로 gRNA 플라스미드 농도는 0.5μg/μL를 초과해야 하며, donor 플라스미드 농도는 1.0μg/μL 이상이어야 합니다. 플라스미드 샘플 발송부터 주입된 배아를 받기까지의 일반적인 일정은 약 2주입니다. FM7/L 밸런서 균주를 사용하는 X 염색체에서 유전자 편집 이벤트를 스크리닝하는 전략이 여기에 제시되어 있습니다. 두 번째 또는 세 번째 염색체에 있는 유전자의 경우 적절한 밸런서 균주를 사용하십시오.
   2. 주입된 파리(G0)를 수집하려면 이산화탄소로 마취하고 수컷 파리와 처녀 암컷을 분리합니다. 각각의 좁은 CT 식품 바이알에 각 G0 수컷을 최소 2개의 FM7/L 처녀 암컷과 짝을 지어 파리 교배를 설정합니다. F1이 근접할 때까지 25°C 및 ~60% 습도로 유지되는 통풍이 잘되는 인큐베이터에 교차 바이알을 넣습니다(FM7/L은 가장 일반적으로 사용되는 X 염색체 균형기임). 마찬가지로 각 G0 암컷을 FM7/Y 수컷 파리와 짝을 이룹니다.
   3. G0 수컷과 암컷 교배종에서 최소 10마리의 처녀 암컷 자손(F1)을 마취하고 수집합니다. G0 암컷 교배종에서 최소 10마리의 수컷 F1 파리를 수집합니다(그림 3A). 각 F1 파리에 혈통의 세부 정보가 태그로 지정되고 별도로 저장되는지 확인하십시오. 스크리닝 단계로 진행합니다.
7. 다음 단일 레그 PCR 프로토콜을 사용합니다.
   1. 프라이머 생성: 표적 유전자의 편집 부위를 포함하는 프라이머 쌍을 설계합니다. 이상적으로는 프라이머의 용융 온도가 약 55°C로 비슷해야 합니다.
   2. 용해 완충액 준비: 모든 파리 샘플에 대해 10μL의 용해 완충액을 준비합니다. 완충액은 10mM Tris(pH 8.2), 1mM EDTA(pH 8.0), 25mM NaCl 및 400μg/mL Proteinase K로 구성됩니다. 용해 완충액을 마스터 혼합물로 준비한 다음 10μL를 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 다리 절개 과정 내내 완충액이 차갑게 유지되는지 확인합니다(그림 3B).
   3. 튜브 설정: 유리 모세관을 준비하고 한쪽 끝을 자당-한천 음식(2% 한천 및 4% 자당)으로 채우고 이를 플라이 호텔이라고 하는 96웰 딥 웰 플레이트에 넣습니다(그림 3C).
   4. 다리 해부: 이산화탄소 마취 패드를 실체 현미경 아래에 놓고 후보 파리 하나를 마취하고 중간 다리 중 하나를 절단합니다. 다리를 용해 완충액에 넣어 완전히 잠기도록 합니다. 다리를 침식할 필요는 없으며 용해 프로토콜 단계로 직접 진행합니다(그림 3B). 한 쌍의 미세한 금속 집게로 플라이 윙을 잡고 플라이를 플라이 호텔로 옮기고 즉시 실로 튜브를 밀봉하십시오.
   5. 대조군 샘플: 두 마리의 야생형 파리를 동일한 다리 절개 절차에 따라 음성 대조군으로 사용할 수 있습니다. 희석된 donor plasmid는 positive control 역할을 합니다.
   6. 해부 후 관리: 25°C 및 ~60% 습도로 유지되는 통풍이 잘되는 인큐베이터에 플라이 호텔을 보관합니다. 파리는 하룻밤 동안 생존할 수 있지만 같은 날 후속 단계와 짝짓기를 완료하는 것이 좋습니다.
   7. 용해 프로토콜: 절단된 다리를 37°C로 설정된 열순환기의 용해 완충 용액에 90분 동안 넣은 다음 95°C에서 5분 동안 마지막으로 4°C로 유지합니다. 이렇게 하면 각 파리의 한쪽 다리에서 충분한 DNA가 추출됩니다(그림 3B).
   8. PCR 반응: 1.5μL의 플라이 레그 용해물을 DNA 소스로 사용하여 제조업체의 지시에 따라 PCR 반응을 구성합니다.
   9. 겔 전기영동: PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동에 적용한다. 밴드 크기에 따라 겔의 결과를 해석합니다. 일반적으로 negative control flies는 더 낮은 band를 나타내고 positive plasmid delic은 더 높은 band를 나타냅니다. 특정 밴드 크기가 원래 donor plasmid design과 일치하는지 확인합니다. 암컷 양성 파리는 이형접합(heterozygous)이기 때문에 두 개의 띠를 나타내고, 수컷 양성은 단일 띠를 나타냅니다(그림 3B).
      참고: 일반적으로 하루에 70마리의 파리를 선별할 수 있습니다. 특정 F1은 off-target 돌연변이로 인해 불임일 수 있으므로 4-5개의 뚜렷한 G0 교배에서 최소 10개의 양성 F1 파리를 식별해야 합니다.
8. 다음과 같은 post-PCR 교차 설정을 수행합니다.
   1. 겔 결과를 바탕으로 플라이 호텔에서 양성 파리를 선택하고 밸런서 파리(X 염색체 유전자 태깅을 위한 FM7/L)와 개별적으로 교배하여 F2 세대를 생성합니다. F2 세대가 등장하면 형제 교배를 설정하여 동형접합 안정 주식을 생성합니다(그림 3D).
   2. 정확성을 보장하기 위해 편집 부위의 Sanger 염기서열분석에 동형접합 스톡을 사용합니다. 배경 돌연변이를 제거하기 위해 야생형 파리로 플라이 라인을 백크로스하여 검증했습니다. single-leg PCR 프로토콜을 사용하여 각 세대를 스크리닝합니다.

결과

우리의 실험에서, 우리는 일반적으로 모든 염색체 (X, II, III)에서 다양한 내인성 태그 유전자 스크리닝에서 ~ 20 % -30 %의 성공률을 발견했습니다. 이 공정의 효율성은 gRNA 선택, 유전자의 특성 및 주입 품질과 같은 여러 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 여기에서는 내인성 기간 유전자에 mNeonGreen 형광단¹³을 태그하는 전략의 결과를 설명합니다. D. ...

토론

이 결과는 초파리의 내인성 유전자를 태깅하기 위한 간소화되고 간단한 CRISPR 기반 전략을 보여줍니다. 프로토콜에서는 두 개의 gRNA를 사용하여 DNA 이중 가닥 절단과 상동 재조합을 보다 효율적으로 유도합니다. gRNA와 donor plasmid는 생식세포에서 Cas9 효소를 발현하는 초파리 배아에 주입됩니다. 이 배아는 이후 성체가 될 때까지 표준 조건에서 배양되며, 성인이 되면 밸런서파리와 교배되어 1...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA pH8.0	Invitrogen	AM9260G
5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)	NEB	C2987H
96-well deep well plate	BRAND	701354
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
BbsI-HF	NEB	R3539S
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
D-Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
EcoRI-HF	NEB	R3101S
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A142-212
Prolong Glass Antifade Mounting Medium	Invitrogen	P36982
Proteinase K	QIAGEN	19131
Schneider's Drosophila Medium	Gibco	21720001
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
T4 DNA ligase	NEB	M0202S
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
XbaI	NEB	R0145S