Одношаговая стратегия мечения эндогенных генов у Drosophila melanogaster на основе CRISPR

Резюме

В данной работе мы представляем упрощенный протокол эндогенного мечения генов дрозофилы, в котором используется метод на основе ПЦР для безмаркерной идентификации успешных генетических модификаций, способствующий развитию стабильных линий knock-in.

Аннотация

Изучение субклеточной локализации, динамики и регуляции белков в живых клетках претерпело глубокие изменения с появлением методов, позволяющих маркировать эндогенные гены для получения флуоресцентных белков слияния. Эти методы позволяют исследователям визуализировать поведение белков в режиме реального времени, предоставляя ценную информацию об их функциях и взаимодействиях в клеточной среде. Многие современные исследования по мечению генов используют двухступенчатый процесс, в котором видимые маркеры, такие как изменения цвета глаз, используются для идентификации генетически модифицированных организмов на первом этапе, а видимый маркер удаляется на втором этапе. Здесь мы представляем одноэтапный протокол для выполнения точной и быстрой эндогенной мечки генов у Drosophila melanogaster, который позволяет проводить скрининг инженерных линий без видимого маркера глаза, что дает значительное преимущество по сравнению с предыдущими методами. Для скрининга успешных событий генной мечки мы используем метод генотипирования отдельных мух на основе ПЦР, анализируя небольшой сегмент их средней ноги. Мухи, прошедшие отбор, затем используются для получения стабильных запасов. В этой статье мы подробно расскажем о проектировании и создании плазмид для редактирования CRISPR, а также о методах скрининга и подтверждения инженерных линий. В совокупности этот протокол значительно повышает эффективность эндогенного мечения генов у дрозофилы и позволяет изучать клеточные процессы in vivo.

Введение

Флуоресцентные белки стали мощными инструментами для визуализации локализации, динамики и белок-белковых взаимодействий в клетках живых организмов ^1,2. Мечение эндогенных генов флуоресцентными белками позволяет в течение длительного времени визуализировать клеточные процессы в реальном времени с субклеточным разрешением. Кроме того, эти эндогенные методы мечения генов имеют ряд преимуществ по сравнению с подходами к гиперэкспрессии и иммуноокрашиванию. Например, чрезмерная экспрессия белков может привести к неправильному сворачиванию белков, неспецифическим белок-белковым взаимодействиям и неправильной локализации³. На сегодняшний день исследователям удалось создать обширные библиотеки эндогенных генов, слитых с флуоресцентными белками для нескольких модельных организмов, таких как почковающиеся дрожжи, которые могут подвергаться эффективной гомологичной^{рекомбинации}. В случае с Drosophila melanogaster были разработаны различные инструменты, такие как MiMICs⁵, энхансерные ловушки^на основе транспозонов 6 и fosmids⁷ для флуоресцентного мечения генов.

Разработка инструментов на основе CRISPR-Cas9 позволила эффективно выполнять редактирование генома, в том числе мечение эндогенных белков, в широком диапазоне модельных организмов ^8,9. Cas9 представляет собой РНК-управляемый фермент, который расщепляет двухцепочечную ДНК высокоэффективным и специфичным^{образом8}, которая затем может быть восстановлена с помощью негомологичного пути присоединения концов (NHEJ), приводящего к точечным мутациям или делециям. В качестве альтернативы, гомологический путь репарации (HDR) позволяет интегрировать гетерологичную ДНК в хромосому.

Прошлые методы мечения генов на основе CRISPR в модельном организме Drosophila melanogaster основывались на двухступенчатом процессе 10,11,12. Для этого используется различимый маркер цвета глаз Dsred для обнаружения успешных событий HDR. После этого маркер Dsred иссекался с помощью системы рекомбинации Cre/loxP. Чтобы упростить и ускорить этот процесс, мы представляем более простой и эффективный метод. Такой подход позволяет избежать необходимости в летальном генотипировании и позволяет проводить прямой скрининг отдельных мух. В частности, мы используем подход, основанный на ПЦР, для извлечения ДНК из небольшого сегмента средней ноги мухи, что позволяет нам генотипировать отдельных мух. Примечательно, что эта процедура не ставит под угрозу жизнеспособность, подвижность или репродуктивные возможности отобранной мухи. Только подходящие особи, выявленные с помощью этого метода, в дальнейшем развиваются в стабильные стаи.

Здесь мы представляем подробный протокол генерации мух, меченных флуоресцентными белками, у которых эндогенные гены помечены флуоресцентными репортерами. Этот метод использует редактирование генома CRISPR-Cas9 для слияния любой желаемой флуорофорной метки с N- или C-концом эндогенного гена. Ниже мы опишем проектирование и конструирование плазмид гРНК и плазмиды-донора, стратегию одноэтапного скрининга для отбора CRISPR-положительных мух и шаги по установлению стабильных линий. В частности, мы описываем стратегии маркировки эндогенных основных часов гена дрозофилы, и точка, с помощью флуорофора на С-конце. Мы также кратко описываем контрольные эксперименты, которые необходимо выполнить, чтобы подтвердить, что меченый белок является функциональным, и методы визуализации в реальном времени для визуализации белка Period в нейронах живых часов в интактном мозге дрозофилы ¹³. Протокол, описанный здесь, также широко применим для скрининга кандидатов на делеции и вставки определенных фрагментов ДНК путем редактирования генома CRISPR-Cas9.

протокол

1. Проектирование и конструирование реагентов для редактирования генов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения эндогенного мечения необходимо идентифицировать различные изоформы нужного гена. В зависимости от конкретных целей эксперимента, флуоресцентная метка может быть встроена либо внутри, либо на N- или C-концах выбранной изоформы белка. Для оптимального CRISPR-опосредованного редактирования крайне важно расположить две сгРНК достаточно близко к предполагаемому сайту вбивания. Впоследствии, чтобы обеспечить возможность редактирования посредством гомологичной рекомбинации, необходимо подготовить донорский вектор, включающий последовательности, гомологичные гену-мишени, вместе с флуоресцентной меткой. Ниже приведено пошаговое руководство по этим процессам (рисунок 1).

1. Спроектируйте сгРНК, как описано ниже.
   1. Спроектируйте sgRNA для дрозофилы , используя эти веб-сайты: http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ или http://www.flyrnai.org/crispr2/.
   2. Для веб-сайта flycrispr введите последовательность ±100.н., окружающую желаемое место выбивания (N-терминал, C-терминал или любой интересующий геномный локус). Если в качестве фона для инъекции используется nos-Cas9 attP2, выберите вариант генома Drosophila melanogaster (nos-Cas9 III, BDSC #78782). Система Nos-Cas9 обеспечивает специфичную для зародышевой линии экспрессию Cas9.
   3. Чтобы повысить эффективность экспрессии sgRNA, выбирайте мишени CRISPR с опцией 5' G , так как sgRNA, которые начинаются с гуанина, усиливают активность редактирования. Затем нажмите кнопку Find CRISPR Targets . Отобразится список возможных последовательностей sgRNA.
   4. Для каждой последовательности нажмите кнопку Оценить . Это действие проверяет наличие потенциальных мишеней для каждой последовательности на основе ранее выбранного генома. Из предложенного списка выберите 2 сгРНК с 0 отклонениями от мишеней. Убедитесь, что одна sgRNA находится выше по течению, а другая — вниз по течению относительно места вбивания. В идеале их расположение должно быть как можно ближе к месту выбивания (<200.н.), но они не должны перекрывать друг друга (рис. 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда может быть трудно найти подходящие sgRNA для данного гена-мишени. Зазор между сгРНК и местом выбивания может быть увеличен до ± 200.н. Использование сгРНК, не инициирующих G, может немного снизить частоту положительных результатов.
2. Выполните выбор флуоресцентной метки, как описано ниже.
   1. Флуоресцентные метки обладают разнообразными характеристиками, каждая из которых имеет свои уникальные преимущества и недостатки ^1,2. При определении идеальной флуоресцентной метки для мечения конкретного белка учитывайте ключевые моменты, описанные в следующих шагах.
   2. Учитывая, что естественные уровни экспрессии белка, как правило, намного ниже, чем те, которые наблюдаются в экспериментах^с гиперэкспрессией ^1,2, начните с меток, которые являются яркими и фотостабильными и соответствуют экспериментальной установке. Некоторые флуоресцентные метки, в частности, некоторые RFP, такие как tdTomato и DsRed, имеют тенденцию образовывать мультимеры¹⁴ и могут приводить к агрегации белков.
   3. Для повышения универсальности прикрепляйте эпитопные метки (например, FLAG или V5) к флуоресцентному маркеру с помощью гибкого линкера, который позволяет проводить биохимические анализы, такие как вестерн-блот или коиммунопреципитация.
3. Для разработки компоновщика выполните действия, описанные ниже.
   1. Для оптимальной функциональности убедитесь, что эндогенный белок и флуоресцентная метка складываются отдельно в соответствующие функциональные формы. Для этого используют пептид-линкер длиной от 2 до 20 аминокислот. Например, поместите два остатка глицина между последней аминокислотой белка Period и первой аминокислотой флуоресцентного белка mNeonGreen.
   2. Убедитесь, что эти пептидные последовательности линкера содержат аминокислоты, такие как глицин и серин, которые придают гибкость структуре¹⁵. Это гарантирует, что естественное поведение и расположение эндогенного белка остаются неизменными.
4. Спроектируйте вектор-донор, как описано ниже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Донорский вектор вводит флуоресцентную метку в желаемое эндогенная локацию посредством процесса репарации, направленной на гомологию, который инициируется расщеплением CRISPR. Таким образом, помимо флуоресцентной метки, донорский вектор должен обладать гомологичными последовательностями с обеих сторон метки.
   1. Начните разработку донорского вектора с организации последовательности ДНК пептида-линкера и флуоресцентной метки и убедитесь, что гомологичные последовательности расположены по бокам обоих концов (плечи гомологии). Для достижения оптимальных результатов убедитесь, что плечи гомологии охватывают не менее 800 нуклеотидов с каждой стороны предполагаемого места вдавливания (рис. 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Недавние исследования показывают, что плечи гомологии могут быть короче (100-200.н.)¹⁶.
   2. Убедитесь, что все последовательности PAM в донорской плазмиде модифицированы таким образом, чтобы аминокислотная последовательность результирующего белка оставалась неизменной. Если последовательность PAM находится в UTR, удалите ее полностью.
   3. Расположение кодона START и STOP зависит от расположения метки. Для внутреннего мечения убедитесь, что флуоресцентная метка находится в кадре с кодирующей последовательностью целевого гена. Для маркировки N-конца расположите флуоресцентную метку перед эндогенным стартовым кодоном. Для маркировки С-конца расположите флуоресцентную метку перед естественным стоп-кодоном и убедитесь, что сохранен только один начальный кодон, чтобы избежать потенциальных проблем с трансляцией.
5. Синтезируйте sgRNA и донорские плазмиды, как описано ниже.
   1. Для создания плазмиды sgRNC следуйте рекомендациям по клонированию U6-гРНК, которые можно найти на flycrispr.org/protocols/grna/. Используйте альтернативный подход к клонированию на основе фермента рестрикции (в предоставленном ресурсе он называется стратегией C) для вставки последовательности гРНК в плазмиду pU6-BbsI-chiRNA (Addgene, #45946).
   2. Преобразование в DH5a E. coli (NEB, C2987H) в соответствии со стандартными протоколами трансформации, предоставленными производителем. Для верификации проводят секвенирование по Сэнгеру на полученных клонах с использованием праймеров стандартного секвенирования Т3 или Т7.
   3. Для создания донорской плазмиды приобретите двухцепочечную ДНК с желаемой донорской последовательностью у коммерческих поставщиков (например, IDT). Интегрируйте его в сайт множественного клонирования pBlueScriptII SK(-). Секвенирование плазмиды-донора, чтобы убедиться, что последовательности sgRNA или PAM правильно модифицированы и в плазмиде отсутствуют SNP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой интеграции с помощью pBlueScriptII является ПЦР плеч гомологии и сегментов флуоресцентной метки по отдельности и консолидация их в магистраль с помощью таких методов, как сборка Golden Gate или сборка Gibson.
6. Используйте следующую схему впрыска и скрещивания.
   1. Чтобы получить мух с отредактированной зародышевой линией, необходимо совместно ввести плазмиды гРНК и плазмиду-донора в соответствующий фон Cas9 (например, nos-Cas9 III, BDSC 78782). Если вы пользуетесь коммерческими услугами по инъекциям, следуйте инструкциям поставщика для выполнения подготовки плазмиды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, концентрация плазмиды гРНК должна превышать 0,5 мкг/мкл, а концентрация плазмиды донора должна быть выше 1,0 мкг/мкл. Обычно от отправки образцов плазмид до получения введенных эмбрионов проходит примерно 2 недели. Здесь представлена стратегия скрининга событий редактирования генов в Х-хромосоме с использованием балансирного штамма FM7/L. Для генов на второй или третьей хромосоме используйте соответствующие штаммы-балансиры.
   2. Для сбора инъекционных мух (G0) обезболивают углекислым газом и отделяют самцов мух и девственных самок. Установите скрещивание мух, соединив каждого самца G0 по крайней мере с двумя девственными самками FM7/L в отдельных узких пищевых флаконах CT. Поместите скрещенные флаконы в вентилируемый инкубатор при температуре 25°C и влажности ~60% до тех пор, пока F1 не приблизится (FM7/L является наиболее часто используемым балансиром Х-хромосомы). Точно так же соедините каждую самку G0 с самцами FM7/Y.
   3. Обезболить и собрать не менее 10 девственных потомков женского пола (F1) от скрещивания самцов и самок G0. От скрещивания самок G0 соберите не менее 10 самцов мух F1 (рис. 3A). Убедитесь, что каждая муха F1 помечена сведениями о ее происхождении и хранится отдельно. Переходите к этапу скрининга.
7. Используйте следующий протокол ПЦР для одной ноги.
   1. Создание праймера: Разработайте пару праймеров, охватывающих сайт редактирования целевого гена. В идеале температура плавления грунтовок должна быть одинаковой, около 55°C.
   2. Приготовление лизисного буфера: Приготовьте 10 мкл лизисного буфера для каждого образца мухи. Буфер состоит из 10 мМ Tris (рН 8,2), 1 мМ ЭДТА (рН 8,0), 25 мМ NaCl и 400 мкг/мл протеиназы K. Приготовьте буфер для лизиса в виде мастер-смеси, затем распределите по 10 мкл в каждую лунку 96-луночного ПЦР-планшета. Убедитесь, что буфер остается холодным на протяжении всего процесса рассечения ноги (Рисунок 3B).
   3. Настройка трубки: Подготовьте стеклянные капиллярные пробирки, заполнив один конец сахарозно-агаровой пищей (2% агара и 4% сахарозы), и поместите их в глубоколуночную тарелку на 96 лунок, которая будет называться «мухо-отель» (рис. 3C).
   4. Рассечение ноги: Поместите угарную анестезиологическую подушку под стереомикроскоп, обезболивайте одну муху-кандидата и отрежьте одну из средних ног. Поместите ножку в лизисный буфер, обеспечив полное погружение. Мацерировать ногу не нужно, сразу приступайте к этапу протокола лизиса (рисунок 3Б). Удерживайте крыло мухи тонкими металлическими щипцами, переместите муху в гостиницу для мух и немедленно запечатайте трубку пряжей.
   5. Контрольные образцы: Две мухи дикого типа могут быть использованы в качестве негативного контроля после одной и той же процедуры рассечения ноги. В качестве положительного контроля выступает разбавленная донорская плазмида.
   6. Уход после вскрытия: Поместите муху в вентилируемый инкубатор при температуре 25 °C и влажности ~60%. Хотя мухи могут выжить в течение ночи, рекомендуется завершить последующие этапы и спаривание в течение того же дня.
   7. Протокол лизиса: Поместите отрубленные ноги в буферный раствор лизиса в амплификатор с температурой 37 °C в течение 90 минут, затем 95 °C в течение 5 минут, наконец, при температуре 4 °C. Это позволит извлечь достаточное количество ДНК из одной ноги каждой мухи (рис. 3B).
   8. ПЦР-реакция: Организуйте реакцию ПЦР в соответствии с инструкциями производителя, используя 1,5 мкл лизата муховых лапок в качестве источника ДНК.
   9. Гель-электрофорез: Подвергнуть ПЦР-продукты электрофорезу в агарозном геле. Интерпретируйте результаты геля в зависимости от размера браслета. Как правило, мухи с отрицательным контролем демонстрируют более низкую полосу, а положительные контрольные плазмиды - более высокую полосу. Убедитесь, что конкретные размеры браслетов соответствуют исходной конструкции донорской плазмиды. Самки положительных мух будут иметь две полосы, так как они гетерозиготны, а самцы будут иметь одну полосу (рис. 3B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, скрининг 70 мух достижим за один день. Убедитесь, что идентифицировано не менее 10 положительных мух F1 в результате 4-5 различных скрещиваний G0, так как некоторые F1 могут быть стерильными из-за мутаций, не попадающих в цель.
8. Выполните следующую перекрестную подготовку после ПЦР.
   1. Основываясь на результатах геля, выберите положительных мух из мухового отеля и индивидуально скрестите их с мухами-балансирами (FM7/L для мечения генов Х-хромосомы) для получения поколения F2. Как только появится поколение F2, установите скрещивание братьев и сестер для создания гомозиготных стабильных подвоев (рис. 3D).
   2. Используйте гомозиготные подвои для секвенирования по Сэнгеру сайта редактирования, чтобы обеспечить точность. Обратное скрещивание проверенных линий мух с мухами дикого типа для удаления фоновых мутаций. Скрининг каждого поколения с использованием протокола ПЦР с одной ногой.

Результаты

В наших экспериментах мы обычно находили ~20%-30% успеха в скрининге различных эндогенных меченых генов на всех хромосомах (X, II, III). Эффективность этого процесса может варьироваться в зависимости от нескольких факторов, таких как отбор гРНК, природа гена и качество инъекц...

Обсуждение

Результаты демонстрируют оптимизированную, простую одношаговую стратегию мечения эндогенных генов дрозофилы, основанную на CRISPR. В протоколе мы используем две гРНК для более эффективного индуцирования двухцепочечного разрыва ДНК и гомологичной рекомбинации. РНК и донорская пла?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA pH8.0	Invitrogen	AM9260G
5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)	NEB	C2987H
96-well deep well plate	BRAND	701354
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
BbsI-HF	NEB	R3539S
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
D-Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
EcoRI-HF	NEB	R3101S
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A142-212
Prolong Glass Antifade Mounting Medium	Invitrogen	P36982
Proteinase K	QIAGEN	19131
Schneider's Drosophila Medium	Gibco	21720001
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
T4 DNA ligase	NEB	M0202S
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
XbaI	NEB	R0145S