Estrategia basada en CRISPR de un solo paso para el etiquetado de genes endógenos en Drosophila melanogaster

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo simplificado de etiquetado de genes endógenos para Drosophila, que utiliza una técnica basada en PCR para la identificación sin marcadores de modificaciones genéticas exitosas, lo que facilita el desarrollo de líneas knock-in estables.

Resumen

El estudio de la localización, dinámica y regulación de proteínas subcelulares en células vivas se ha transformado profundamente con el advenimiento de técnicas que permiten el marcaje de genes endógenos para producir proteínas de fusión fluorescentes. Estos métodos permiten a los investigadores visualizar el comportamiento de las proteínas en tiempo real, proporcionando información valiosa sobre sus funciones e interacciones dentro del entorno celular. Muchos estudios actuales de etiquetado genético emplean un proceso de dos pasos en el que los marcadores visibles, como los cambios en el color de los ojos, se utilizan para identificar organismos modificados genéticamente en el primer paso, y el marcador visible se extirpa en el segundo paso. Aquí, presentamos un protocolo de un solo paso para realizar un etiquetado genético endógeno preciso y rápido en Drosophila melanogaster, que permite la detección de líneas diseñadas sin el marcador ocular visible, lo que ofrece una ventaja significativa sobre los métodos anteriores. Para detectar eventos exitosos de marcaje de genes, empleamos una técnica basada en PCR para genotipar moscas individuales mediante el análisis de un pequeño segmento de su pata media. Las moscas que superan los criterios de selección se utilizan para producir poblaciones estables. Aquí, detallamos el diseño y la construcción de plásmidos de edición CRISPR y los métodos para el cribado y la confirmación de líneas de ingeniería. En conjunto, este protocolo mejora significativamente la eficiencia del marcaje de genes endógenos en Drosophila y permite estudios de procesos celulares in vivo.

Introducción

Las proteínas fluorescentes han surgido como herramientas poderosas para visualizar la localización de proteínas, la dinámica y las interacciones proteína-proteína en células dentro de organismos vivos ^1,2. El marcaje de genes endógenos con proteínas fluorescentes permite obtener imágenes en vivo a largo plazo de los procesos celulares con resolución subcelular. Además, estas técnicas de marcaje de genes endógenos tienen varias ventajas en comparación con los enfoques de sobreexpresión e inmunotinción. Por ejemplo, la sobreexpresión de proteínas puede conducir a un mal plegamiento de proteínas, interacciones inespecíficas proteína-proteína y mala localización³. Hasta la fecha, los investigadores han sido capaces de crear vastas bibliotecas de genes endógenos fusionados con proteínas fluorescentes para unos pocos organismos modelo, como la levadura en ciernes, que puede someterse a una^{recombinación} homóloga eficiente. En el caso de Drosophila melanogaster, se han ideado varias herramientas como MiMICs⁵, trampas potenciadoras^basadas en transposones 6 y fosmids⁷ para marcar genes de forma fluorescente.

El desarrollo de herramientas basadas en CRISPR-Cas9 ha hecho posible realizar de manera eficiente la edición del genoma, incluido el etiquetado de proteínas endógenas, en una amplia gama de organismos modelo ^8,9. Cas9 es una enzima guiada por ARN que escinde el ADN bicatenario de una manera altamente eficiente y específica⁸, que luego puede ser reparado por una vía de unión de extremos no homóloga (NHEJ) que conduce a mutaciones puntuales o deleciones. Alternativamente, la vía de reparación dirigida por homología (HDR) permite la integración del ADN heterólogo en el cromosoma.

Los métodos anteriores para el etiquetado de genes basado en CRISPR en el organismo modelo, Drosophila melanogaster, se han basado en un proceso de dos pasos 10,11,12. Esto implica el uso de un marcador de color de ojos discernible, Dsred, para detectar eventos HDR exitosos. Posteriormente, el marcador Dsred se extirparía mediante el sistema de recombinación Cre/loxP. Para agilizar y agilizar este proceso, aquí te presentamos un método más sencillo y eficiente. Este enfoque evita la necesidad de genotipado letal y permite la detección directa de moscas individuales. Específicamente, empleamos un enfoque basado en PCR para extraer ADN de un pequeño segmento de la pata media de la mosca, lo que nos permite genotipar moscas individuales. Cabe destacar que este procedimiento no compromete la vitalidad, el movimiento o las capacidades reproductivas de la mosca muestreada. Solo los individuos apropiados, identificados a través de este método, se convierten en poblaciones estables.

Aquí, presentamos un protocolo detallado para generar moscas marcadas con proteínas fluorescentes en el que los genes endógenos se marcan con reporteros fluorescentes. Esta técnica utiliza la edición del genoma CRISPR-Cas9 para fusionar cualquier etiqueta de fluoróforo deseada con el terminal N o C de un gen endógeno. A continuación, describimos el diseño y la construcción de plásmidos de ARNg y un plásmido de donante, la estrategia de cribado de un solo paso para seleccionar moscas positivas para CRISPR y los pasos para establecer líneas estables. Específicamente, describimos estrategias para marcar un gen endógeno de Drosophila, punto, con un fluoróforo en el terminal C. También describimos brevemente los experimentos de control que deben realizarse para confirmar que la proteína marcada es funcional y las técnicas de imagen en vivo para visualizar la proteína Period en neuronas de reloj vivo dentro de cerebros intactos de Drosophila ¹³. El protocolo descrito aquí también es ampliamente aplicable a los candidatos para la deleción e inserción de fragmentos específicos de ADN mediante la edición del genoma CRISPR-Cas9.

Protocolo

1. Diseño y construcción de reactivos de edición génica

NOTA: Para llevar a cabo el marcaje endógeno, es imprescindible identificar las distintas isoformas del gen deseado. Dependiendo de los objetivos específicos del experimento, se puede incorporar una etiqueta fluorescente internamente o en el extremo N o C de la(s) isoforma(s) de proteína seleccionada(s). Para una edición óptima mediada por CRISPR, es crucial colocar los dos sgRNAs adecuadamente cerca del sitio de knock-in previsto. Posteriormente, para permitir la edición a través de la recombinación homóloga, se debe preparar un vector donante que abarque secuencias homólogas al gen diana, junto con la etiqueta fluorescente. A continuación se muestra una guía paso a paso de estos procesos (Figura 1).

1. Diseñe el sgRNA como se describe a continuación.
   1. Diseñe sgRNAs para Drosophila utilizando estos sitios web: http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ o http://www.flyrnai.org/crispr2/.
   2. Para el sitio web de flycrispr, ingrese la secuencia ±100 pb que rodea la ubicación deseada del knock-in (terminal N, terminal C o cualquier locus genómico de interés). Si utiliza el nos-Cas9 attP2 como fondo de inyección, elija la opción de genoma Drosophila melanogaster (nos-Cas9 III, BDSC #78782). El sistema Nos-Cas9 garantiza la expresión de Cas9 específica de la línea germinal.
   3. Para mejorar la eficiencia de la expresión de sgRNA, seleccione los objetivos CRISPR con la opción 5' G , ya que los sgRNA que comienzan con una guanina mejorarán la actividad de edición. A continuación, haz clic en el botón Buscar objetivos CRISPR . Se mostrará una lista de posibles secuencias de sgRNA.
   4. Para cada secuencia, haga clic en el botón Evaluar . Esta acción comprueba si hay posibles objetivos fuera de lugar para cada secuencia en función del genoma previamente seleccionado. De la lista proporcionada, elija 2 sgRNAs que tengan 0 objetivos apagados. Asegúrese de que un sgRNA esté aguas arriba y el otro aguas abajo en relación con la ubicación del knock-in. Idealmente, sus posiciones deben estar lo más cerca posible del sitio del knock-in (<200 pb), pero no deben superponerse entre sí (Figura 2).
      NOTA: A veces puede ser difícil encontrar sgRNAs apropiados para un gen diana determinado. El espacio entre los sgRNAs y la ubicación del knock-in se puede aumentar a ± 200 pb. El uso de sgRNAs que no se inician con G podría disminuir ligeramente la tasa de positivos.
2. Realice la selección de etiquetas fluorescentes como se describe a continuación.
   1. Las etiquetas fluorescentes ofrecen una amplia gama de características, cada una de las cuales tiene sus ventajas e inconvenientes únicos ^1,2. A la hora de determinar la etiqueta fluorescente ideal para etiquetar una proteína específica, tenga en cuenta las consideraciones clave descritas en los siguientes pasos que entran en juego.
   2. Dado que los niveles de expresión natural de proteínas suelen ser mucho más bajos que los observados en los experimentos de sobreexpresión ^1,2, comience con las etiquetas que son brillantes y fotoestables y que se ajustan a la configuración experimental. Algunas etiquetas fluorescentes, específicamente ciertas RFP como tdTomato y DsRed, tienden a formar multímeros¹⁴ y pueden conducir a la agregación de proteínas.
   3. Para una mayor versatilidad, vincule las etiquetas de epítopos (p. ej., FLAG o V5) al marcador fluorescente utilizando un enlazador flexible, que permite realizar análisis bioquímicos como Western Blot o coinmunoprecipitación.
3. Para el diseño del vinculador, siga los pasos que se describen a continuación.
   1. Para una funcionalidad óptima, asegúrese de que tanto la proteína endógena de interés como la etiqueta fluorescente se plieguen por separado en sus respectivas formas funcionales. Para lograr esto, use un péptido enlazador que tenga una longitud de 2 a 20 aminoácidos. Por ejemplo, coloque dos residuos de glicina entre el último aminoácido de la proteína Period y el primer aminoácido de la proteína fluorescente knock-in mNeonGreen.
   2. Asegúrese de que estas secuencias de péptidos enlazadores comprendan aminoácidos como la glicina y la serina, que imparten flexibilidad a la estructura¹⁵. Esto asegura que el comportamiento natural y la ubicación de la proteína endógena permanezcan inalterados.
4. Diseñe el vector donante como se describe a continuación.
   NOTA: El vector donante introduce la etiqueta fluorescente en la ubicación endógena deseada a través del proceso de reparación dirigida por homología, que se inicia mediante la escisión CRISPR. Como tal, además de la etiqueta fluorescente, el vector donante debe poseer secuencias que sean homólogas en ambos lados de la etiqueta.
   1. Comience el diseño del vector donante organizando la secuencia de ADN del péptido enlazador y la etiqueta fluorescente y asegúrese de que haya secuencias homólogas flanqueando ambos extremos (brazos de homología). Para obtener resultados óptimos, asegúrese de que los brazos de homología abarquen al menos 800 nucleótidos a cada lado del sitio de inserción previsto (Figura 2).
      NOTA: Informes recientes sugieren que los brazos de homología pueden ser más cortos (100-200 pb)¹⁶.
   2. Asegúrese de que todas las secuencias de PAM dentro del plásmido donante se modifiquen de tal manera que la secuencia de aminoácidos de la proteína resultante permanezca sin cambios. Si la secuencia PAM se encuentra en la UTR, elimínela por completo.
   3. La posición de los codones START y STOP depende de la ubicación de la etiqueta. Para el marcaje interno, asegúrese de que la etiqueta fluorescente esté en el marco con la secuencia codificante del gen diana. Para el marcaje N-terminal, coloque la etiqueta fluorescente antes del codón de inicio endógeno. Para el etiquetado C-terminal, sitúe la etiqueta fluorescente antes del codón de parada natural y asegúrese de conservar un solo codón de inicio para evitar posibles problemas de traducción.
5. Sintetizar sgRNA y plásmidos donantes como se describe a continuación.
   1. Para la creación de plásmidos de ARNsg, siga las pautas de clonación de ARNg U6, que se pueden encontrar en flycrispr.org/protocols/grna/. Emplee el enfoque alternativo de clonación basado en enzimas de restricción (denominado estrategia C en el recurso proporcionado) para insertar la secuencia de ARNg en el plásmido pU6-BbsI-chiRNA (Addgene, #45946).
   2. Transforma en DH5a E. coli (NEB, C2987H) siguiendo los protocolos de transformación estándar proporcionados por el fabricante. Para la verificación, realice la secuenciación Sanger en los clones resultantes utilizando cebadores de secuenciación estándar T3 o T7.
   3. Para la creación de plásmido de donante, adquiera ADN bicatenario con la secuencia de donante deseada de proveedores comerciales (por ejemplo, IDT). Intégrelo en el sitio de clonación múltiple pBlueScriptII SK(-). Secuenciar el plásmido donante para asegurarse de que las secuencias de sgRNA o PAM se modifiquen correctamente y que no haya SNP presentes en el plásmido.
      NOTA: Una alternativa a la integración mediante pBlueScriptII es la PCR de los brazos de homología y los segmentos de etiqueta fluorescente por separado y consolidarlos en la red troncal utilizando técnicas como el ensamblaje Golden Gate o el ensamblaje Gibson.
6. Utilice el siguiente esquema de inyección y cruce.
   1. Para adquirir moscas editadas en la línea germinal, coinyecte plásmidos de ARNg y el plásmido donante en el fondo Cas9 apropiado (p. ej., nos-Cas9 III, BDSC 78782). Si utiliza servicios de inyección comercial, siga las instrucciones del proveedor para realizar la preparación del plásmido.
      NOTA: Normalmente, la concentración de plásmidos de ARNg debe superar los 0,5 μg/μL y la concentración de plásmidos del donante debe ser superior a 1,0 μg/μL. Un plazo común desde el envío de muestras de plásmidos hasta la recepción de embriones inyectados es de aproximadamente 2 semanas. Aquí se presenta una estrategia para detectar eventos de edición de genes en el cromosoma X empleando la cepa balanceadora FM7/L. Para los genes del segundo o tercer cromosoma, emplee las cepas de equilibrio adecuadas.
   2. Para la recolección de moscas inyectadas (G0), anestesiar con dióxido de carbono y separar moscas macho y hembras vírgenes. Establecer cruces de moscas emparejando cada macho G0 con al menos dos hembras vírgenes FM7/L en viales individuales estrechos de alimento CT. Coloque los viales cruzados en una incubadora ventilada mantenida a 25 ° C y ~ 60% de humedad hasta que las moscas F1 se cierren (FM7 / L es el equilibrador del cromosoma X más utilizado). Del mismo modo, empareje cada hembra G0 con moscas macho FM7/Y.
   3. Anestesiar y recolectar al menos 10 crías de hembras vírgenes (F1) de cruces de machos y hembras G0. A partir de cruces de hembras G0, reúna al menos 10 moscas F1 macho (Figura 3A). Asegúrese de que cada mosca F1 esté etiquetada con los detalles de su parentesco y almacenada por separado. Continúe con el paso de selección.
7. Utilice el siguiente protocolo de PCR de una sola pierna.
   1. Creación de cebadores: Diseñe un par de cebadores que abarquen el sitio de edición del gen diana. Lo ideal es que las temperaturas de fusión de las imprimaciones sean similares, en torno a los 55°C.
   2. Preparación del tampón de lisis: Prepare 10 μL de tampón de lisis para cada muestra de mosca. El tampón consta de 10 mM de Tris (pH 8,2), 1 mM de EDTA (pH 8,0), 25 mM de NaCl y 400 μg/mL de proteinasa K. Prepare el tampón de lisis como una mezcla maestra, luego distribuya 10 μL en cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos. Asegúrese de que el tampón permanezca frío durante todo el proceso de disección de la pierna (Figura 3B).
   3. Configuración del tubo: Prepare tubos capilares de vidrio, llenando un extremo con alimento de sacarosa-agar (2% de agar y 4% de sacarosa), y colóquelos en una placa de 96 pocillos profundos, que se denominará el hotel de moscas (Figura 3C).
   4. Disección de la pierna: Coloque la almohadilla de anestesia de dióxido de carbono bajo un microscopio estereoscópico, anestesie una mosca candidata y corte una de las patas medias. Coloque la pierna en el tampón de lisis, asegurando una inmersión completa. No es necesario macerar la pierna, se procede directamente al paso del protocolo de lisis (Figura 3B). Sostenga el ala de la mosca con un par de pinzas de metal fino, mueva la mosca al hotel de la mosca y selle el tubo con hilo inmediatamente.
   5. Muestras de control: Se pueden usar dos moscas de tipo salvaje como controles negativos siguiendo el mismo procedimiento de disección de patas. Un plásmido de donante diluido sirve como control positivo.
   6. Cuidados posteriores a la disección: Aloje el hotel de moscas en una incubadora ventilada mantenida a 25 °C y ~60% de humedad. Si bien las moscas pueden sobrevivir durante la noche, se recomienda completar los pasos posteriores y el apareamiento en el mismo día.
   7. Protocolo de lisis: Colocar las patas cortadas en la solución tampón de lisis en un termociclador ajustado a 37 °C durante 90 min, seguido de 95 °C durante 5 min, finalmente mantenido a 4 °C. Esto extraerá suficiente ADN de la pata de cada mosca (Figura 3B).
   8. Reacción de PCR: Organice la reacción de PCR según las instrucciones del fabricante, utilizando 1,5 μL del lisado de patas de mosca como fuente de ADN.
   9. Electroforesis en gel: Someter los productos de PCR a electroforesis en gel de agarosa. Interprete los resultados del gel en función del tamaño de la banda. Por lo general, las moscas de control negativo exhibirán una banda más baja y los controles de plásmidos positivos mostrarán una banda más alta. Asegúrese de que los tamaños de banda específicos sean consistentes con el diseño original del plásmido del donante. Las moscas hembras positivas mostrarán dos bandas ya que son heterocigóticas, y las masculinas positivas presentarán una sola banda (Figura 3B).
      NOTA: Por lo general, se puede realizar la detección de 70 moscas en un solo día. Asegúrese de identificar un mínimo de 10 moscas F1 positivas en 4 o 5 cruces G0 distintos, ya que ciertas F1 pueden ser estériles debido a mutaciones fuera del objetivo.
8. Realice la siguiente configuración cruzada posterior a la PCR.
   1. Con base en los resultados del gel, seleccione las moscas positivas del hotel de moscas y crucéelas individualmente con moscas balanceadoras (FM7/L para marcar genes del cromosoma X) para producir la generación F2. Una vez que emerja la generación F2, establezca cruces de hermanos para crear poblaciones estables homocigóticas (Figura 3D).
   2. Utilice material homocigótico para la secuenciación Sanger del sitio de edición para garantizar la precisión. Líneas de mosca validadas por retrocruzamiento con moscas de tipo salvaje para eliminar las mutaciones de fondo. Realice pruebas de detección en cada generación mediante el protocolo de PCR de una sola pierna.

Resultados

En nuestros experimentos, normalmente encontramos una tasa de éxito de ~20%-30% en la detección de varios genes endógenos marcados en todos los cromosomas (X, II, III). La eficiencia de este proceso puede variar en función de varios factores, como la selección del ARNg, la naturaleza del gen y la calidad de la inyección. Aquí, ilustramos los resultados de nuestra estrategia para marcar el gen del período endógeno con el fluoróforo mNeonGreen¹³. E...

Discusión

Los resultados demuestran una estrategia simplificada y sencilla basada en CRISPR de un solo paso para etiquetar genes endógenos en Drosophila. En el protocolo, utilizamos dos ARNg para inducir la rotura de la doble cadena de ADN y la recombinación homóloga de manera más eficiente. Los ARNg y el plásmido donante se inyectan en embriones de mosca de la fruta, que expresan la enzima Cas9 en su línea germinal. Estos embriones se cultivan posteriormente en condiciones normales hasta la edad adulta, momento en ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA pH8.0	Invitrogen	AM9260G
5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)	NEB	C2987H
96-well deep well plate	BRAND	701354
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
BbsI-HF	NEB	R3539S
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
D-Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
EcoRI-HF	NEB	R3101S
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A142-212
Prolong Glass Antifade Mounting Medium	Invitrogen	P36982
Proteinase K	QIAGEN	19131
Schneider's Drosophila Medium	Gibco	21720001
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
T4 DNA ligase	NEB	M0202S
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
XbaI	NEB	R0145S