Estrategia basada en CRISPR de un solo paso para el etiquetado de genes endógenos en Drosophila melanogaster

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo simplificado de etiquetado de genes endógenos para Drosophila, que utiliza una técnica basada en PCR para la identificación sin marcadores de modificaciones genéticas exitosas, lo que facilita el desarrollo de líneas knock-in estables.

Resumen

El estudio de la localización, dinámica y regulación de proteínas subcelulares en células vivas se ha transformado profundamente con el advenimiento de técnicas que permiten el marcaje de genes endógenos para producir proteínas de fusión fluorescentes. Estos métodos permiten a los investigadores visualizar el comportamiento de las proteínas en tiempo real, proporcionando información valiosa sobre sus funciones e interacciones dentro del entorno celular. Muchos estudios actuales de etiquetado genético emplean un proceso de dos pasos en el que los marcadores visibles, como los cambios en el color de los ojos, se utilizan para identificar organismos modificados genéticamente en el primer paso, y el marcador visible se extirpa en el segundo paso. Aquí, presentamos un protocolo de un solo paso para realizar un etiquetado genético endógeno preciso y rápido en Drosophila melanogaster, que permite la detección de líneas diseñadas sin el marcador ocular visible, lo que ofrece una ventaja significativa sobre los métodos anteriores. Para detectar eventos exitosos de marcaje de genes, empleamos una técnica basada en PCR para genotipar moscas individuales mediante el análisis de un pequeño segmento de su pata media. Las moscas que superan los criterios de selección se utilizan para producir poblaciones estables. Aquí, detallamos el diseño y la construcción de plásmidos de edición CRISPR y los métodos para el cribado y la confirmación de líneas de ingeniería. En conjunto, este protocolo mejora significativamente la eficiencia del marcaje de genes endógenos en Drosophila y permite estudios de procesos celulares in vivo.

Introducción

Las proteínas fluorescentes han surgido como herramientas poderosas para visualizar la localización de proteínas, la dinámica y las interacciones proteína-proteína en células dentro de organismos vivos ^1,2. El marcaje de genes endógenos con proteínas fluorescentes permite obtener imágenes en vivo a largo plazo de los procesos celulares con resolución subcelular. Además, estas técnicas de marcaje de genes endógenos tienen varias ventajas en comparación con los enfoques de sobreexpresión e inmunotinción. Por ejemplo, la sobreexpresión de proteínas puede conducir a un mal plegamiento de proteínas, interacciones i....

Protocolo

1. Diseño y construcción de reactivos de edición génica

NOTA: Para llevar a cabo el marcaje endógeno, es imprescindible identificar las distintas isoformas del gen deseado. Dependiendo de los objetivos específicos del experimento, se puede incorporar una etiqueta fluorescente internamente o en el extremo N o C de la(s) isoforma(s) de proteína seleccionada(s). Para una edición óptima mediada por CRISPR, es crucial colocar los dos sgRNAs adecuadamente cerca del sitio de knock-in previsto. Posteriormente, para permitir la edición a través de la recombinación homóloga, se debe preparar un vector donante que abarque secuencias homólogas al gen dia....

Resultados

En nuestros experimentos, normalmente encontramos una tasa de éxito de ~20%-30% en la detección de varios genes endógenos marcados en todos los cromosomas (X, II, III). La eficiencia de este proceso puede variar en función de varios factores, como la selección del ARNg, la naturaleza del gen y la calidad de la inyección. Aquí, ilustramos los resultados de nuestra estrategia para marcar el gen del período endógeno con el fluoróforo mNeonGreen¹³. E.......

Discusión

Los resultados demuestran una estrategia simplificada y sencilla basada en CRISPR de un solo paso para etiquetar genes endógenos en Drosophila. En el protocolo, utilizamos dos ARNg para inducir la rotura de la doble cadena de ADN y la recombinación homóloga de manera más eficiente. Los ARNg y el plásmido donante se inyectan en embriones de mosca de la fruta, que expresan la enzima Cas9 en su línea germinal. Estos embriones se cultivan posteriormente en condiciones normales hasta la edad adulta, momento en .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA pH8.0	Invitrogen	AM9260G
5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)	NEB	C2987H
96-well deep well plate	BRAND	701354
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
BbsI-HF	NEB	R3539S
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
D-Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
EcoRI-HF	NEB	R3101S
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A142-212
Prolong Glass Antifade Mounting Medium	Invitrogen	P36982
Proteinase K	QIAGEN	19131
Schneider's Drosophila Medium	Gibco	21720001
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
T4 DNA ligase	NEB	M0202S
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
XbaI	NEB	R0145S