Drosophila melanogaster'de Endojen Gen Etiketleme için Tek Adımlı CRISPR Tabanlı Strateji

Özet

Burada, başarılı genetik modifikasyonların işaretsiz tanımlanması için PCR tabanlı bir teknik kullanan ve stabil knock-in hatlarının geliştirilmesini kolaylaştıran Drosophila için basitleştirilmiş bir endojen gen etiketleme protokolü sunuyoruz.

Özet

Canlı hücrelerde protein hücre altı lokalizasyonu, dinamikleri ve regülasyonu üzerine yapılan çalışmalar, floresan füzyon proteinleri üretmek için endojen genlerin etiketlenmesine izin veren tekniklerin ortaya çıkmasıyla derinden dönüştürülmüştür. Bu yöntemler, araştırmacıların protein davranışını gerçek zamanlı olarak görselleştirmelerini sağlayarak, hücresel ortamdaki işlevleri ve etkileşimleri hakkında değerli bilgiler sağlar. Mevcut birçok gen etiketleme çalışması, ilk adımda genetiği değiştirilmiş organizmaları tanımlamak için göz rengi değişiklikleri gibi görünür belirteçlerin kullanıldığı ve ikinci adımda görünür işaretleyicinin eksize edildiği iki aşamalı bir süreç kullanır. Burada, Drosophila melanogaster'de hassas ve hızlı endojen gen etiketlemesi gerçekleştirmek için tek adımlı bir protokol sunuyoruz, bu da görünür göz işaretleyicisi olmadan tasarlanmış hatların taranmasını sağlar ve geçmiş yöntemlere göre önemli bir avantaj sunar. Başarılı gen etiketleme olaylarını taramak için, orta bacaklarından küçük bir segmenti analiz ederek tek tek sinekleri genotiplemek için PCR tabanlı bir teknik kullanıyoruz. Tarama kriterlerini geçen sinekler daha sonra istikrarlı stoklar üretmek için kullanılır. Burada, CRISPR düzenleme plazmitlerinin tasarımını ve yapımını ve mühendislik hatlarının taranması ve doğrulanması için yöntemleri detaylandırıyoruz. Birlikte, bu protokol Drosophila'da endojen gen etiketlemesinin etkinliğini önemli ölçüde artırır ve in vivo hücresel süreçlerin incelenmesini sağlar.

Giriş

Floresan proteinler, canlı organizmalardaki hücrelerde protein lokalizasyonunu, dinamiklerini ve protein-protein etkileşimlerini görselleştirmek için güçlü araçlar olarak ortaya çıkmıştır ^1,2. Endojen genlerin floresan proteinlerle etiketlenmesi, hücresel süreçlerin hücre altı çözünürlükle uzun süreli canlı görüntülenmesini sağlar. Ayrıca, bu endojen gen etiketleme teknikleri, aşırı ekspresyon ve immün boyama yaklaşımlarına kıyasla çeşitli avantajlara sahiptir. Örneğin, proteinlerin aşırı ekspresyonu, proteinin yanlış katlanmasına, spesifik olmayan protein-protein etkileşimlerine ve yanlış lokalizasyona^{yol açabilir 3}. Bugüne kadar, araştırmacılar, verimli homolog rekombinasyona maruz kalabilen tomurcuklanan maya gibi birkaç model organizma için floresan proteinlere kaynaşmış endojen genlerin geniş kütüphanelerini oluşturabildiler⁴. Drosophila melanogaster durumunda, genleri floresan olarak etiketlemek için MiMICs⁵, transpozon tabanlı arttırıcı tuzaklar⁶ ve fosmidler⁷ gibi çeşitli araçlar tasarlanmıştır.

CRISPR-Cas9 tabanlı araçların geliştirilmesi, çok çeşitli model organizmalarda^endojen proteinlerin etiketlenmesi de dahil olmak üzere genom düzenlemesini verimli bir şekilde gerçekleştirmeyi mümkün kılmıştır ^8,9. Cas9, çift sarmallı DNA'yı oldukça verimli ve spesifik bir şekilde parçalayan^RNA kılavuzlu bir enzimdir 8, daha sonra nokta mutasyonlarına veya delesyonlara yol açan homolog olmayan bir uç birleştirme (NHEJ) yolu ile onarılabilir. Alternatif olarak, homolojiye yönelik onarım (HDR) yolu, heterolog DNA'nın kromozoma entegrasyonuna izin verir.

Model organizma Drosophila melanogaster'de CRISPR tabanlı gen etiketleme için geçmiş yöntemler, iki aşamalı bir sürece^{dayanmaktadır} 10,11,12. Bu, başarılı HDR olaylarını tespit etmek için fark edilebilir bir göz rengi işaretleyicisi olan Dsred'in kullanılmasını içerir. Daha sonra, Dsred markörü Cre / loxP rekombinasyon sistemi kullanılarak eksize edilecektir. Bu süreci kolaylaştırmak ve hızlandırmak için burada daha basit ve daha verimli bir yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşım, ölümcül genotipleme ihtiyacını ortadan kaldırır ve bireysel sineklerin doğrudan taranmasına izin verir. Spesifik olarak, sineğin orta bacağının küçük bir bölümünden DNA çıkarmak için PCR tabanlı bir yaklaşım kullanıyoruz ve bu da tek tek sinekleri genotiplememize izin veriyor. Özellikle, bu prosedür, örneklenen sineğin canlılığını, hareketini veya üreme yeteneklerini tehlikeye atmaz. Yalnızca bu yöntemle belirlenen uygun kişiler, istikrarlı hisse senetlerine dönüştürülür.

Burada, endojen genlerin floresan raportörlerle etiketlendiği floresan protein etiketli sinekler üretmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, istenen herhangi bir florofor etiketini endojen bir genin N- veya C- terminaline kaynaştırmak için CRISPR-Cas9 genom düzenlemesini kullanır. Aşağıda, gRNA plazmitlerinin ve bir donör plazmidinin tasarımını ve yapımını, CRISPR pozitif sinekleri seçmek için tek adımlı tarama stratejisini ve kararlı çizgiler oluşturma adımlarını açıklıyoruz. Spesifik olarak, endojen bir çekirdek saat Drosophila genini, dönemi, C-terminalinde bir florofor ile etiketleme stratejilerini açıklıyoruz. Ayrıca, etiketli proteinin işlevsel olduğunu doğrulamak için yapılması gereken kontrol deneylerini ve bozulmamış Drosophila beyinleri¹³ içindeki canlı saat nöronlarında Periyot proteinini görselleştirmek için canlı görüntüleme tekniklerini kısaca açıklıyoruz. Burada açıklanan protokol, CRISPR-Cas9 genom düzenlemesi ile belirli DNA bitlerinin silinmesi ve eklenmesi için tarama adaylarına da geniş ölçüde uygulanabilir.

Protokol

1. Gen düzenleme reaktiflerinin tasarımı ve yapımı

NOT: Endojen etiketleme yapmak için, istenen genin çeşitli izoformlarını tanımlamak esastır. Deneyin özel hedeflerine bağlı olarak, bir floresan etiketi dahili olarak veya seçilen protein izoformlarının N- veya C-terminallerine dahil edilebilir. Optimum CRISPR aracılı düzenleme için, iki sgRNA'yı amaçlanan knock-in bölgesine uygun şekilde yakın konumlandırmak çok önemlidir. Daha sonra, homolog rekombinasyon yoluyla düzenlemeyi mümkün kılmak için, floresan etiketi ile birlikte hedef gene homolog dizileri kapsayan bir donör vektörü hazırlanmalıdır. Aşağıda bu süreçler için adım adım bir kılavuz bulunmaktadır (Şekil 1).

1. sgRNA'yı aşağıda açıklandığı gibi tasarlayın.
   1. Bu web sitelerini kullanarak Drosophila için sgRNA'lar tasarlayın: http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ veya http://www.flyrnai.org/crispr2/.
   2. Flycrispr web sitesi için, istenen knock-in konumunu (N terminali, C terminali veya ilgilenilen herhangi bir genomik lokus) çevreleyen ±100 bp dizisini girin. Enjeksiyon arka planı olarak nos-Cas9 attP2 kullanıyorsanız, Drosophila melanogaster (nos-Cas9 III, BDSC #78782) genom seçeneğini seçin. Nos-Cas9 sistemi, germ hattına özgü Cas9 ekspresyonunu sağlar.
   3. Guanin ile başlayan sgRNA'lar düzenleme aktivitesini artıracağından, sgRNA ekspresyon verimliliğini artırmak için 5' G seçeneğiyle CRISPR hedeflerini seçin. Ardından, CRISPR Hedeflerini Bul düğmesini tıklayın. Olası sgRNA dizilerinin bir listesi görüntülenecektir.
   4. Her sekans için Değerlendir düğmesine tıklayın. Bu eylem, önceden seçilen genoma dayalı olarak her dizi için olası kapalı hedefleri kontrol eder. Sağlanan listeden, 0 kapalı hedefi olan 2 sgRNA seçin. Bir sgRNA'nın yukarı akışta ve diğerinin vurulma konumuna göre aşağı yönde olduğundan emin olun. İdeal olarak, konumları vurulma bölgesine mümkün olduğunca yakın olmalıdır (<200 bp), ancak birbirleriyle örtüşmemelidir (Şekil 2).
      NOT: Belirli bir hedef gen için uygun sgRNA'ları bulmak bazen zor olabilir. sgRNA'lar ile knock-in konumu arasındaki boşluk ± 200 bp'ye çıkarılabilir. G ile başlamayan sgRNA'ların kullanılması pozitif oranı biraz azaltabilir.
2. Floresan etiket seçimini aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
   1. Floresan etiketler, her biri kendine özgü avantajları ve dezavantajları olan çok çeşitli özellikler sunar ^1,2. Belirli bir proteini etiketlemek için ideal floresan etiketini belirlerken, devreye giren aşağıdaki adımlarda açıklanan temel hususlara dikkat edin.
   2. Doğal protein ekspresyon seviyelerinin tipik olarak aşırı ekspresyon deneylerinde görülenlerden çok daha düşük olduğu göz önüne alındığında ^1,2, parlak ve fotostabil olan ve deney düzeneğine uyan etiketlerle başlayın. Bazı floresan etiketler, özellikle tdTomato ve DsRed gibi belirli RFP'ler, multimerler¹⁴ oluşturma eğilimindedir ve protein agregasyonuna yol açabilir.
   3. Gelişmiş çok yönlülük için, epitop etiketlerini (örneğin, FLAG veya V5), Western Blot veya Co-Immunopresipitasyon gibi biyokimyasal analizlere izin veren esnek bir bağlayıcı kullanarak floresan işaretleyiciye bağlayın.
3. Bağlayıcı tasarımı için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
   1. Optimum işlevsellik için, hem ilgilenilen endojen proteinin hem de floresan etiketin ilgili fonksiyonel formlarına ayrı ayrı katlandığından emin olun. Bunu başarmak için, uzunluğu 2-20 amino asit arasında değişen bir bağlayıcı peptit kullanın. Örneğin, Periyot proteininin son amino asidi ile knock-in floresan proteini mNeonGreen'in ilk amino asidi arasına iki glisin kalıntısı yerleştirin.
   2. Bu bağlayıcı peptit dizilerinin, yapıya esneklik kazandıran glisin ve serin gibi amino asitleri içerdiğinden^{emin olun 15}. Bu, endojen proteinin doğal davranışının ve konumunun değişmeden kalmasını sağlar.
4. Donör vektörünü aşağıda açıklandığı gibi tasarlayın.
   NOT: Donör vektörü, CRISPR bölünmesi ile başlatılan homolojiye yönelik onarım süreci yoluyla floresan etiketi istenen endojen konuma sokar. Bu nedenle, floresan etiketinin yanı sıra, donör vektörü, etiketin her iki tarafında homolog olan dizilere sahip olmalıdır.
   1. Bağlayıcı peptitin ve floresan etiketin DNA dizisini düzenleyerek donör vektör tasarımına başlayın ve her iki ucu (homoloji kolları) çevreleyen homolog dizilerin olduğundan emin olun. En iyi sonuçlar için, homoloji kollarının amaçlanan vuruş bölgesinin her iki tarafında en az 800 nükleotidi kapsadığından emin olun (Şekil 2).
      NOT: Son raporlar, homoloji kollarının daha kısa olabileceğini göstermektedir (100-200 bp)¹⁶.
   2. Donör plazmidi içindeki herhangi bir PAM dizisinin, elde edilen proteinin amino asit dizisi değişmeden kalacak şekilde değiştirildiğinden emin olun. PAM dizisi UTR'de bulunuyorsa, tamamen kaldırın.
   3. BAŞLAT ve DURDUR kodonunun konumu, etiketin konumuna bağlıdır. Dahili etiketleme için, floresan etiketin hedef genin kodlama dizisiyle çerçevede olduğundan emin olun. N-terminal etiketlemesi için, floresan etiketini endojen başlangıç kodonunun önüne yerleştirin. C-terminali etiketlemesi için, floresan etiketini doğal durdurma kodonunun önüne yerleştirin ve olası çeviri sorunlarını önlemek için yalnızca tek bir başlangıç kodonunu tuttuğunuzdan emin olun.
5. Aşağıda açıklandığı gibi sgRNA ve donör plazmitlerini sentezleyin.
   1. sgRNA plazmid oluşturmak için, flycrispr.org/protocols/grna/'da bulunan U6-gRNA klonlama yönergelerini izleyin. gRNA dizisini pU6-BbsI-chiRNA plazmidine eklemek için alternatif kısıtlama enzimi tabanlı klonlama yaklaşımını (sağlanan kaynakta strateji C olarak anılır) kullanın (Addgene, #45946).
   2. DH5a E'de dönüştürün. coli (NEB, C2987H) üretici tarafından sağlanan standart dönüşüm protokollerini takip eder. Doğrulama için, T3 veya T7 standart dizileme primerlerini kullanarak ortaya çıkan klonlar üzerinde Sanger dizilimi gerçekleştirin.
   3. Donör plazmidinin oluşturulması için, ticari tedarikçilerden (örneğin, IDT) istenen donör dizisine sahip çift sarmallı DNA alın. pBlueScriptII SK(-) çoklu klonlama sitesine entegre edin. sgRNA veya PAM dizilerinin doğru şekilde değiştirildiğinden ve plazmidde SNP bulunmadığından emin olmak için donör plazmitini sıralayın.
      NOT: pBlueScriptII kullanarak entegrasyona bir alternatif, homoloji kollarını ve floresan etiket segmentlerini ayrı ayrı PCR yapmak ve Golden Gate Assembly veya Gibson Assembly gibi teknikler kullanarak bunları omurgada birleştirmektir.
6. Aşağıdaki enjeksiyon ve geçiş şemasını kullanın.
   1. Germ hattı düzenlenmiş sinekleri elde etmek için, gRNA plazmitlerini ve donör plazmitini uygun Cas9 arka planına birlikte enjekte edin (örneğin, nos-Cas9 III, BDSC 78782). Ticari enjeksiyon hizmetlerinden yararlanıyorsanız, plazmit hazırlığı yapmak için satıcının talimatlarını izleyin.
      NOT: Tipik olarak, gRNA plazmit konsantrasyonu 0.5 μg/μL'yi aşmalı ve donör plazmit konsantrasyonu 1.0 μg/μL'nin üzerinde olmalıdır. Plazmit örneklerinin gönderilmesinden enjekte edilen embriyoların alınmasına kadar geçen ortak bir zaman çizelgesi yaklaşık 2 haftadır. FM7/L dengeleyici suşunu kullanan X kromozomundaki gen düzenleme olaylarını taramak için bir strateji burada sunulmaktadır. İkinci veya üçüncü kromozomdaki genler için uygun dengeleyici suşları kullanın.
   2. Enjekte edilen sineklerin (G0) toplanması için, karbondioksit ile anestezi uygulayın ve erkek sinekleri ve bakire dişileri ayırın. Her bir G0 erkeğini ayrı ayrı dar CT gıda şişelerinde en az iki FM7 / L bakire dişi ile eşleştirerek sinek çaprazlamaları oluşturun. Çapraz şişeleri, F1 uçana kadar 25 ° C'de ve ~% 60 nemde tutulan havalandırmalı bir inkübatöre yerleştirin (FM7 / L en yaygın kullanılan X kromozomu dengeleyicidir). Benzer şekilde, her G0 dişisini FM7/Y erkek sinekleriyle eşleştirin.
   3. Hem G0 erkek hem de dişi melezlerden en az 10 bakire dişi yavruyu (F1) uyuşturun ve toplayın. G0 dişi melezlerinden en az 10 erkek F1 sineği toplayın (Şekil 3A). Her F1 sineğinin ebeveyninin ayrıntılarıyla etiketlendiğinden ve ayrı olarak saklandığından emin olun. Tarama adımına geçin.
7. Aşağıdaki tek bacaklı PCR protokolünü kullanın.
   1. Primer oluşturma: Hedef genin düzenleme bölgesini kapsayan bir primer çifti tasarlayın. İdeal olarak, primerlerin erime sıcaklıkları 55°C civarında benzer olmalıdır.
   2. Lizis tamponu hazırlama: Her sinek numunesi için 10 μL lizis tamponu hazırlayın. Tampon, 10 mM Tris (pH 8.2), 1 mM EDTA (pH 8.0), 25 mM NaCl ve 400 μg/mL Proteinaz K'den oluşur. Bacak diseksiyon işlemi boyunca tamponun soğuk kaldığından emin olun (Şekil 3B).
   3. Tüp kurulumu: Bir ucunu sakaroz-agar yemi (%2 agar ve %4 sakaroz) ile doldurarak cam kılcal tüpler hazırlayın ve bunları sinek oteli olarak adlandırılacak 96 oyuklu derin kuyulu bir plakaya yerleştirin (Şekil 3C).
   4. Bacak diseksiyonu: Karbondioksit anestezi pedini stereo mikroskop altına yerleştirin, bir aday sineği uyuşturun ve orta bacaklardan birini kesin. Bacağı lizis tamponuna yerleştirin ve tamamen daldırın. Bacağı masere etmek, doğrudan lizis protokolü adımına geçmek gerekli değildir (Şekil 3B). Sinek kanadını bir çift ince metal forseps ile tutun, sineği sinek oteline taşıyın ve tüpü hemen iplikle kapatın.
   5. Kontrol örnekleri: Aynı bacak diseksiyon prosedürünü takiben iki vahşi tip sinek negatif kontrol olarak kullanılabilir. Seyreltilmiş bir donör plazmidi pozitif kontrol görevi görür.
   6. Diseksiyon sonrası bakım: Sinek otelini 25 °C ve ~%60 nemde tutulan havalandırmalı bir inkübatörde barındırın. Sinekler gece boyunca hayatta kalabilse de, sonraki adımları tamamlamaları ve aynı gün içinde çiftleşmeleri önerilir.
   7. Lizis protokolü: Kopan bacakları 90 dakika boyunca 37 °C'ye, ardından 5 dakika boyunca 95 °C'ye ayarlanmış ve son olarak 4 °C'de tutulan bir termosiklerde lizis tampon çözeltisine yerleştirin. Bu, her sineğin tek bacağından yeterli DNA'yı çıkaracaktır (Şekil 3B).
   8. PCR reaksiyonu: DNA kaynağı olarak 1.5 μL sinek bacağı lizatı kullanarak PCR reaksiyonunu üretici tarafından talimat verildiği şekilde düzenleyin.
   9. Jel elektroforezi: PCR ürünlerini agaroz jel elektroforezine tabi tutun. Jelden elde edilen sonuçları bant boyutuna göre yorumlayın. Tipik olarak, negatif kontrol sinekleri daha düşük bir bant sergiler ve pozitif plazmit kontrolleri daha yüksek bir bant gösterir. Belirli bant boyutlarının orijinal donör plazmid tasarımıyla tutarlı olduğundan emin olun. Dişi pozitif sinekler heterozigot oldukları için iki bant gösterecek ve erkek pozitifler tek bir bant sunacaktır (Şekil 3B).
      NOT: Genellikle, bir günde 70 sineğin taranması mümkündür. Bazı F1'ler hedef dışı mutasyonlar nedeniyle steril olabileceğinden, 4 ila 5 farklı G0 çaprazlamasında en az 10 pozitif F1 sineği tanımladığınızdan emin olun.
8. Aşağıdaki PCR sonrası çapraz kurulumu gerçekleştirin.
   1. Jel sonuçlarına dayanarak, uçuş otelinden pozitif sinekleri seçin ve F2 neslini üretmek için bunları dengeleyici sineklerle (X kromozom genlerini etiketlemek için FM7/L) ayrı ayrı çaprazlayın. F2 nesli ortaya çıktığında, homozigot kararlı stoklar oluşturmak için kardeş çaprazlamalar oluşturun (Şekil 3D).
   2. Doğruluğu sağlamak için düzenleme sitesinin Sanger sıralaması için homozigot stokları kullanın. Arka plan mutasyonlarını ortadan kaldırmak için vahşi tip sineklerle arka çaprazlama doğrulanmış sinek çizgileri. Tek bacaklı PCR protokolünü kullanarak her nesli tarayın.

Sonuçlar

Deneylerimizde, tipik olarak, tüm kromozomlarda (X, II, III) çeşitli endojen etiketli genlerin taranmasında ~% 20 -% 30'luk bir başarı oranı bulduk. Bu işlemin verimliliği, gRNA seçimi, genin doğası ve enjeksiyon kalitesi gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak değişebilir. Burada, endojen dönem genini mNeonGreen florofor¹³ ile etiketleme stratejimizin sonuçlarını gösteriyoruz. D. melanogaster'in X kromozomu üzerinde yer alan...

Tartışmalar

Sonuçlar, Drosophila'daki endojen genleri etiketlemek için aerodinamik, basit, tek adımlı CRISPR tabanlı bir stratejiyi göstermektedir. Protokolde, DNA çift sarmallı kırılmayı ve homolog rekombinasyonu daha verimli bir şekilde indüklemek için iki gRNA kullanıyoruz. gRNA'lar ve donör plazmid, germ hatlarında Cas9 enzimini eksprese eden meyve sineği embriyolarına enjekte edilir. Bu embriyolar daha sonra yetişkinliğe kadar standart koşullar altında yetiştirilir ve bu noktada birinci nesil (F...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA pH8.0	Invitrogen	AM9260G
5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)	NEB	C2987H
96-well deep well plate	BRAND	701354
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
BbsI-HF	NEB	R3539S
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
D-Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
EcoRI-HF	NEB	R3101S
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A142-212
Prolong Glass Antifade Mounting Medium	Invitrogen	P36982
Proteinase K	QIAGEN	19131
Schneider's Drosophila Medium	Gibco	21720001
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
T4 DNA ligase	NEB	M0202S
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
XbaI	NEB	R0145S