接触模式原子力显微镜作为形态观察和细菌细胞损伤分析的快速技术

摘要

在这里，我们介绍了原子力显微镜（AFM）作为一种简单快速的细菌表征方法的应用，并分析了诸如细菌大小和形状，细菌培养生物膜以及纳米颗粒作为杀菌剂的活性等细节。

摘要

电子显微镜是表征细胞结构所需的工具之一。然而，由于用于观察的样品制备，该过程既复杂又昂贵。原子力显微镜（AFM）是一种非常有用的表征技术，因为它在三维空间中具有高分辨率，并且对真空和样品电导率没有任何要求。AFM可以对具有不同形貌和不同类型材料的各种样品进行成像。

AFM提供从埃级到微米级的高分辨率3D形貌信息。与传统显微镜不同，AFM使用探针生成样品表面形貌的图像。在该协议中，建议使用这种类型的显微镜来表征固定在支撑物上的细菌的形态学和细胞损伤。使用 金黄色葡萄球菌 （ATCC 25923）、 大肠杆菌 （ATCC 25922）和 湖南假单胞 菌（从大蒜鳞茎样品中分离）的菌株。在这项工作中，细菌细胞在特定培养基中生长。为了观察细胞损伤，将 金黄色葡萄球菌 和 大肠杆菌 与不同浓度的纳米颗粒（NPs）一起孵育。

将一滴细菌悬浮液固定在玻璃支架上，并用AFM以不同比例拍摄图像。获得的图像显示了细菌的形态特征。此外，使用AFM，可以观察到由NPs的作用引起的细胞结构损伤。 基于获得的图像，接触AFM可用于表征固定在载体上的细菌细胞的形态。AFM也是研究NPs对细菌影响的合适工具。与电子显微镜相比，AFM是一种廉价且易于使用的技术。

引言

安东尼·范·列文虎克在17^世纪首次注意到不同的细菌形状1。自古以来，细菌就以多种形状存在，从球体到分支细胞²。细胞形状是细菌分类学家描述和分类每种细菌的基本条件，主要用于革兰氏阳性门和革兰氏阴性门^的形态分离3。已知有几种元素可以决定细菌细胞的形式，所有这些元素都作为细胞壁和膜的组成部分参与细胞覆盖和支持物，以及细胞骨架。通过这种方式，科学家们仍在阐明与确定细菌细胞形式有关的化学，生化和物理机制和过程，所有这些都由定义细菌形状^的基因簇定义^2,4。

此外，科学家已经证明，杆状形状可能是细菌细胞的祖先形式，因为这种细胞形状在细胞显着参数中看起来是最佳的。因此，球菌、螺旋、弧菌、丝状和其他形式被视为对各种环境的适应;事实上，特定的形态已经独立进化了多次，这表明细菌的形状可能是对特定环境的适应^3,5。然而，在整个细菌细胞生命周期中，细胞形状会发生变化，这也是对破坏性^{环境条件的}遗传反应3。细菌细胞的形状和大小强烈决定了细菌的刚度、稳健性和表面体积比，这一特性可用于生物技术过程⁶。

电子显微镜用于研究生物样品，因为其放大倍率可以超越基于光学的显微镜。透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）是为此目的最常用的技术;然而，样品在放入显微镜室之前需要进行一些处理，以获得适当的图像。样品上需要金盖，总图像采集所用的时间不应太长。相比之下，原子力显微镜（AFM）是一种广泛用于表面分析的技术，但也用于生物样品的研究。

表面分析中使用了几种类型的AFM模式，例如接触模式，非接触模式或攻丝，磁力显微镜（MFM），导电AFM，压电力显微镜（PFM），峰值力攻丝（PFT），接触共振和力体积。每种模式都用于材料分析，并提供有关材料表面及其机械和物理性能的不同信息。然而，一些AFM模式用于 体外生物样品的分析，例如PFT，因为PFT允许在液体培养基⁷中获得细胞的形貌和机械数据。

在这项工作中，我们使用了每个旧而简单的AFM模型中包含的最基本的模式 - 接触模式。AFM使用锋利的探针（直径约<50 nm）扫描小于100 μm的区域。探头与样品对齐，以便与与样品相关的力场相互作用。用探头扫描表面以保持力恒定。然后，通过监测悬臂在表面上移动时的运动来生成表面图像。收集的信息提供了表面的纳米机械性能，例如附着力，弹性，粘度和剪切力。

在AFM接触模式下，悬臂以固定偏转扫描样品。这允许人们确定样品的高度（Z），这代表了与其他电子显微镜技术相比的优势。AFM软件允许通过尖端和样品表面之间的相互作用生成3D图像扫描，并且尖端偏转通过激光和检测器与样品的高度相关联。

在恒定力的静态模式（接触模式）下，输出呈现两种不同的图像:高度（z形貌）和偏转或误差信号。静态模式是一种有价值的简单成像模式，特别是对于空气中的坚固样品，可以处理静态模式施加的高负载和扭转力。偏转或误差模式在恒力模式下运行。然而，通过在表面结构中添加偏转信号来进一步增强形貌图像。在这种模式下，偏转信号也称为误差信号，因为偏转是反馈参数;该通道中出现的任何特征或形态都是由于反馈回路中的"误差"，或者更确切地说，是由于保持恒定偏转设定点所需的反馈回路。

AFM的独特设计使其紧凑 - 足够小，可以放在桌面上 - 同时还具有足够高的分辨率来解析原子步骤。AFM设备比其他电子显微镜设备成本更低，维护成本最低。显微镜不需要具有特殊条件的实验室，例如洁净室或隔离空间;它只需要一张无振动的办公桌。对于AFM，样品不需要像其他技术（金盖，减肥）那样进行精心准备;只需将干样品连接到样品架上。

我们使用AFM接触模式来观察细菌形态和NPs的影响。可以观察到固定在载体上的细菌的种群和细胞形态，以及纳米颗粒对细菌物种产生的细胞损伤。通过AFM接触模式获得的图像证实它是一种强大的工具，不受试剂和复杂程序的限制，使其成为一种简单，快速和经济的细菌表征方法。

研究方案

1. 细菌分离与鉴定

1. 从大蒜鳞茎分生组织中分离内生菌株:
   1. 将先前去皮，消毒和切好的大蒜鳞茎的2mm分生组织碎片置于胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）上作为丰富的生长培养基，并在25°C下孵育1天。
   2. 根据细菌菌落的形态差异——形状、大小、颜色、边缘、透射光、反射光、质地、稠度和色素产生——描述观察到的不同形态型，并通过交叉条纹纯化每种形态型的代表性菌落。
   3. 将所有纯化的细菌菌株保存在-80°C的30%甘油中。
   4. 通过对 16S rDNA 进行测序来鉴定随机选择的菌株 （9AP）。按照霍夫曼和温斯顿⁸的方法提取DNA。
   5. 通过聚合酶链反应 （PCR） 扩增 16S rRNA，与 100 ng DNA、1x 聚合酶缓冲液、4 mM MgCl₂、0.4 mM dNTP、27F/1492r 通用寡核苷酸各 10 pmol和 1 U DNA 聚合酶⁹。使用以下热循环仪条件:95°C5分钟进行初始变性;然后以35个循环，在94°C下1分钟作为变性温度，在56°C下1分钟作为杂交温度，在72°C下1分钟作为延伸温度;然后在72°C下10分钟作为最终延伸。
   6. 使用相同的寡核苷酸对PCR产物进行毛细管测序;将双脱氧终端法与用于毛细管测序的基质安装套件^{一起使用，并在}自动多毛细管系统¹¹中进行电泳。
   7. 手动编辑序列，使用BLAST搜索将序列与GenBank文库进行比较，并初步鉴定具有至少98.7%与最接近物种^12,13的金标准鉴定菌株。
      注意:菌株9AP被鉴定为属于湖南假单胞菌物种，与菌株湖南假单胞菌LV（JX545210）的序列的同一性为99.86%。

2. 通过AFM进行形态学观察的细菌样品制备

1. 在无菌条件下，将一滴细菌悬浮液（湖南假单胞菌， 金黄色葡萄球菌） 放在载玻片上。
2. 通过干加热将样品固定在载玻片上。将载玻片轻轻地放在火焰上几次，直到样品干燥。
   注意:样品固定是微生物学中的常规技术，用于观察固定的原核生物并尽可能模拟其作为活细胞的结构。
3. 将固定样品放入培养皿中，并将它们带到AFM设备进行观察。
   注意:由于样品可能会随时间推移而改变天气条件，因此请留出最长24小时的时间在AFM设备中进行分析。保持样品无灰尘。

3. MgO纳米粒子对细菌的抗菌作用

注意:MgO NPs的合成和表征已在¹⁴之前发表。在这项工作中，根据临床和实验室标准协会（CLSI）手册使用宏观稀释和微量稀释方法估计纳米材料的抗菌活性^15,16。

1. 估算最小抑菌活性 （MIC） 和杀菌剂 （CMB）
   1. 菌株的预生长
      1. 将适量的 大肠杆菌 或 金黄色葡萄球菌 接种到营养肉汤中，得到终浓度为1 × 10⁸ CFU/mL。
      2. 将悬浮液在37°C（±2°C）孵育18-24小时。
   2. 适应菌株的生长后
      1. 将无菌细菌学环浸入悬浮液中，接触管底部。
      2. 用环在伊红和亚甲蓝琼脂和营养琼脂上进行条纹。
      3. 将琼脂平板在37°C（±2°C）孵育24小时。
   3. 选择用于制备标准化接种物的菌落
      1. 通过用细菌环触摸培养皿中菌落的顶部，取三到五个具有相同形态类型的菌落。
      2. 将所选内容转移并浸入 3-5 mL Müller-Hinton 肉汤中。
      3. 在 37 °C （± 2 °C） 下孵育，以达到 1 × 10 8 CFU/mL 或 2 × 10⁸ CFU/mL 的浊度。
         注意:在这项工作中，麦克法兰浊度标准液被用作细菌悬浮液的参考;具体而言，0.5标准品大约对应于1.5×10⁸个细胞/mL的均匀大肠杆菌悬浮液。使用紫外-可见分光光度计测量浊度。
      4. 取 1 mL，加入 9 mL 无菌肉汤中。取 200 μL 该稀释液，并将其添加到 19.8 mL 无菌肉汤中，以获得 5 × 10⁵ CFU/mL 的终浓度。
   4. 所需浓度的氧化镁纳米颗粒
      1. 使用超声仪制备溶液。
      2. 将纳米材料悬浮在无菌水中，浓度为获得连续溶液所需浓度的两倍。
      3. 将这些悬浮液添加到含有Müller-Hinton肉汤的无菌管中，以达到实验所需的新浓度范围。
         注意:以下MgO NPs浓度用于微量稀释:30 ppm，60 ppm，120 ppm，250 ppm，500 ppm，1,000 ppm，2,000 ppm，3,000 ppm，4,000 ppm和8,000 ppm。
   5. 微量稀释液的制备¹⁵
      1. 准备一个新的无菌96孔微量滴定板（微孔板）。将微孔板的第12号柱标记为无菌柱;将第 11 列标记为生长对照列。
      2. 将 120 μL 不同浓度的纳米颗粒悬浮液加入第 1-10 列。
      3. 将 120 μL 细菌 （5 × 10⁵ CFU/mL） 接种到第 1-10 列的孔中。
         注意:对于本研究，G行和H行是CLSI标准建议浓度的头孢曲松对照:8 ppm，4 ppm，2 ppm，1 ppm，0.5 ppm，0.25 ppm，0.125 ppm，0.06 ppm和0.03 ppm。
      4. 将96孔微孔板在37°C（35°C±2°C）下孵育24小时。最后，分析井。
2. 通过AFM观察MgO纳米颗粒诱导的细菌菌株形态结构变化
   1. 从微量稀释测试的孔中取出250μL，与750μL无菌水混合，并在5°C下以2,000×g离心2分钟至5分钟。
   2. 每次用 1 mL 无菌水洗涤沉淀物 3 次，洗涤结束时，向其中加入 500 μL 水。
   3. 为了获得AFM图像，取10-20μL每个起始孔的最终悬浮液，在先前通过超声波清洁的载玻片上涂片（30分钟），并在室温下干燥1小时。

4. 原子力显微镜测量

注意:在这里，处于接触模式的原子力显微镜安装在防振工作站上，该工作站允许显微镜与任何机械振动源隔离并保持系统水平。线路滤波器和电涌保护可减少电气干扰。这里使用的AFM自动将激光束对准光电探测器。

1. 打开计算机和 AFM，然后在软件工具中选择接触模式、contAI-G 探头和自动斜率选项。Z 控制器的默认值为设定值 = 20 nM、P 增益 = 10,000、I 增益 = 1,000、D 增益 = 0 和尖端电压 = 0 mV。
2. 使用 70μm扫描范围头将样品置于AFM接触模式。我们使用弹簧常数为 0.13 N/m 的 ContAI-G 硅悬臂。
3. 使用安装在集成在扫描头中的两个镜头上的摄像设备，快速查看探头下方区域的表面。
4. 在XY平面中手动执行位移以选择所需区域。探头以电子方式接近表面样品，直到达到接触条件。通过减小XY方向的斜率，以电子方式调整扫描仪和样品表面的XY测量平面。
5. 使用软件的标准参数: 每秒 1 行，每行 256 点。
6. 首先，执行 70 μm x 70 μm 区域的完整扫描范围;然后，使用 缩放工具选择较小的区域。AFM 自动优化 Z 中的图表范围。
   注意:通过减少每秒行数，总扫描时间增加，扫描质量更加明确，并且还可以清除测量中的一些噪声。
7. 为了从样品中选择新区域，请以电子方式缩回悬臂，然后沿XY平面移动样品。使用步骤 4.5 和步骤 4.6 中所述的过程实现新扫描。
   注意:获得的扫描以单色条形刻度显示，其中浅色与较高的高度相关，深色与较深的高度相关。AFM软件生成扫描的3D视图，可以欣赏被测表面的细节。
8. 使用滤镜选择中图像的工具 菜单中的逐行 调平执行数据处理，这是最常用和最简单的调平方法。
   注意:这种调平方法采用AFM图像中产生的每条水平线或垂直线，并将其拟合为多项式方程。
9. 优化右侧颜色条中的最大和最小高度，以获得最佳图像分辨率。
10. 使用工具栏中的"分析"菜单执行图像 分析 。选择所需工具后，通过选择初始点和终点来确定高度和距离。
    注意:用户必须尝试使用 "工具 "菜单的不同滤镜，以避免由于调平过程中使用的拼合而导致笔尖图像伪影。图像伪影显示为条纹线，并显示在某些 AFM 图像中。

结果

通过原子力显微镜在接触模式下拍摄了 金黄色葡萄球菌 和 湖南假单胞 菌菌株的形态和大小以及两种菌株的种群组织图像。 金黄色葡萄 球菌的图像显示，其种群按球菌聚集区分布（图1A）。随着规模的增加，对球菌的种群分布和形态有了更大的了解（图1B）。显微镜报告显示，金 黄色葡萄球菌的相邻细胞中存在假半球形结?...

讨论

显微镜是生物实验室中常用的一种技术，可用于研究生物样品的结构、大小、形态和细胞排列。为了改进这种技术，可以使用几种类型的显微镜，这些显微镜在光学或电子特性方面彼此不同，这决定了仪器的分辨率。

在科学研究中，需要使用显微镜来表征细菌细胞;例如，显微镜已经证明NaCl影响大肠杆菌菌株的热阻和细胞形态，五味子提取物对金黄色葡萄球菌显示出抗...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM EasyScan 2	NanoSurf	discontinued	Measurement Media
bacteriological loop	No aplica	not applicable	instrument for bacterial inoculation
BigDye Terminator v3.1	ThermoFisher Scientific	4337455	Matrix installation kit
Bioedit	not applicable	version 7.2.5	Sequence alignment editor
Cary 60 spectrometer	Agilent Technologies	not applicable
ceftriazone	Merck	not applicable	antibiotic
centrifuge	eppendorf	not applicable	to remove particles that interfere with AFM
ContAI-G Silicon cantilever	BudgetSensors	ContAl-G-10	Measurement Media
eosin and methylene blue agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC 25922	bacterial strain
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8295	PCR of 16S rRNA gene
microplate	Thermo Scientific	10558295	for microdilution analysis
Müller-Hinton broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutrient agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutritious broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Petri dishes	not applicable	not applicable	growth of bacteria
Pseudomonas hunanensis 9AP	not applicable	not applicable	isolated from the garlic bulb by CNRG
Sanger sequencing	Macrogen	not applicable	sequencing service
ScienceDesk Anti-Vibration workstation	ThorLabs
slides	not applicable	not applicable	glass holder for bacterial sample analysis
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection	ATCC 25923	bacterial strain
Thermalcycler	Applied Biosystems	Veriti-4375786	PCR amplification
Trypticasein soy agar	BD	BA-256665	growth media
ultrasonicator	Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC	not applicable	for mixing the nanoparticle dilutions