Microscopia de Força Atômica em Modo de Contato como Técnica Rápida para Observação Morfológica e Análise de Danos Celulares Bacterianos

Resumo

Aqui, apresentamos a aplicação da microscopia de força atômica (AFM) como um método simples e rápido para caracterização bacteriana e analisamos detalhes como o tamanho e a forma bacteriana, biofilmes de cultura bacteriana e a atividade de nanopartículas como bactericidas.

Resumo

A microscopia eletrônica é uma das ferramentas necessárias para caracterizar estruturas celulares. No entanto, o procedimento é complicado e dispendioso devido ao preparo da amostra para observação. A microscopia de força atômica (AFM) é uma técnica de caracterização muito útil devido à sua alta resolução em três dimensões e à ausência de qualquer requisito para vácuo e condutividade da amostra. O AFM pode obter imagens de uma grande variedade de amostras com diferentes topografias e diferentes tipos de materiais.

O AFM fornece informações de topografia 3D de alta resolução desde o nível de angstrom até a escala de mícrons. Ao contrário da microscopia tradicional, o AFM usa uma sonda para gerar uma imagem da topografia da superfície de uma amostra. Neste protocolo, sugere-se o uso deste tipo de microscopia para a caracterização morfológica e de dano celular de bactérias fixadas em um suporte. Foram utilizadas cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas hunanensis (isoladas de amostras de bulbo de alho). Neste trabalho, células bacterianas foram cultivadas em meios de cultura específicos. Para observar danos celulares, Staphylococcus aureus e Escherichia coli foram incubados com diferentes concentrações de nanopartículas (NPs).

Uma gota de suspensão bacteriana foi fixada em um suporte de vidro, e as imagens foram obtidas com AFM em diferentes escalas. As imagens obtidas mostraram as características morfológicas das bactérias. Além disso, empregando AFM, foi possível observar o dano à estrutura celular causado pelo efeito de NPs. Com base nas imagens obtidas, o AFM de contato pode ser usado para caracterizar a morfologia de células bacterianas fixadas em um suporte. O AFM também é uma ferramenta adequada para a investigação dos efeitos dos NPs sobre bactérias. Comparada à microscopia eletrônica, a MFA é uma técnica barata e fácil de usar.

Introdução

Diferentes formas bacterianas foram observadas pela primeira vez por Antony van Leeuwenhoek no século 17¹. As bactérias existem em uma grande diversidade de formas desde a antiguidade, variando de esferas a células ramificadas². A forma celular é condição fundamental para que taxonomistas de bactérias descrevam e classifiquem cada espécie bacteriana, principalmente para a separação morfológica dos filos gram-positivos e^{gram-negativos3}. Vários elementos são conhecidos por determinar as formas celulares bacterianas, todos os quais estão envolvidos nas coberturas e suporte celular como componentes da parede e membrana celular, bem como no citoesqueleto. Dessa forma, os cientistas ainda estão elucidando os mecanismos e processos químicos, bioquímicos e físicos implicados na determinação das formas celulares bacterianas, todas definidas por agrupamentos de genes que definem as formas bacterianas ^2,4.

Além disso, os cientistas mostraram que a forma da haste é provavelmente a forma ancestral das células bacterianas, uma vez que essa forma de célula parece ideal em parâmetros significativos para as células. Assim, cocos, espirais, vibrios, filamentosos e outras formas são considerados como adaptações a vários ambientes; De fato, morfologias particulares evoluíram independentemente várias vezes, sugerindo que as formas das bactérias poderiam ser adaptações a ambientes particulares ^3,5. No entanto, ao longo do ciclo de vida celular da bactéria, a forma celular muda, e isso também ocorre como uma resposta genética a condições ambientais prejudiciais³. A forma e o tamanho das células bacterianas determinam fortemente a rigidez, robustez e relação superfície/volume das bactérias, e essa característica pode ser explorada para processos biotecnológicos⁶.

A microscopia eletrônica é usada para estudar amostras biológicas devido à alta magnificação que pode ser alcançada além dos microscópios baseados em luz. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) e a microscopia eletrônica de varredura (MEV) são as técnicas mais utilizadas para este fim; no entanto, as amostras requerem alguns tratamentos antes de serem colocadas na câmara do microscópio para obter imagens apropriadas. Uma capa dourada nas amostras é necessária, e o tempo usado para a aquisição total da imagem não deve ser muito longo. Em contraste, a microscopia de força atômica (AFM) é uma técnica amplamente utilizada na análise de superfícies, mas também é empregada no estudo de amostras biológicas.

Existem vários tipos de modos de AFM usados na análise de superfície, como modo de contato, modo sem contato ou macheamento, microscopia de força magnética (MFM), AFM condutivo, microscopia de força piezoelétrica (MAP), pico de força tapping (PFT), ressonância de contato e volume de força. Cada modo é utilizado na análise de materiais e fornece diferentes informações sobre a superfície dos materiais e suas propriedades mecânicas e físicas. Entretanto, alguns modos de MFA são utilizados para a análise de amostras biológicas in vitro, como o TFP, pois o TFP permite a obtenção de dados topográficos e mecânicos das células em meio líquido⁷.

Neste trabalho, usamos o modo mais básico incluído em cada modelo antigo e simples de AFM - o modo de contato. O AFM usa uma sonda afiada (cerca de <50 nm de diâmetro) para escanear áreas inferiores a 100 μm. A sonda é alinhada à amostra para interagir com os campos de força associados à amostra. A superfície é escaneada com a sonda para manter a força constante. Em seguida, uma imagem da superfície é gerada monitorando o movimento do cantilever à medida que ele se move pela superfície. As informações coletadas fornecem as propriedades nanomecânicas da superfície, como aderência, elasticidade, viscosidade e cisalhamento.

No modo de contato AFM, o cantilever é escaneado em toda a amostra em uma deflexão fixa. Isso permite determinar a altura das amostras (Z), o que representa uma vantagem sobre as outras técnicas de microscópio eletrônico. O software AFM permite a geração de uma varredura de imagem 3D pela interação entre a ponta e a superfície da amostra, sendo que a deflexão da ponta é correlacionada com a altura da amostra através de um laser e um detector.

No modo estático (modo contato) com força constante, a saída apresenta duas imagens diferentes: a altura (topografia z) e o sinal de deflexão ou erro. O modo estático é um modo de imagem simples e valioso, especialmente para amostras robustas no ar que podem lidar com as altas cargas e forças de torção exercidas pelo modo estático. O modo de deflexão ou erro é operado no modo de força constante. No entanto, a imagem de topografia é reforçada pela adição do sinal de deflexão à estrutura da superfície. Neste modo, o sinal de deflexão também é referido como o sinal de erro, pois a deflexão é o parâmetro de realimentação; Quaisquer características ou morfologia que aparecem neste canal são devidas ao "erro" no loop de feedback ou, melhor, devido ao loop de feedback necessário para manter um setpoint de deflexão constante.

O design exclusivo do AFM o torna compacto - pequeno o suficiente para caber em uma mesa - ao mesmo tempo em que tem resolução alta o suficiente para resolver etapas atômicas. O equipamento AFM tem um custo menor do que o equipamento para outros microscópios eletrônicos, e os custos de manutenção são mínimos. O microscópio não requer um laboratório com condições especiais, como uma sala limpa ou um espaço isolado; ele só precisa de uma mesa livre de vibrações. Para AFM, as amostras não precisam passar por preparação elaborada como para outras técnicas (capa de ouro, emagrecimento); apenas uma amostra seca tem de ser anexada ao porta-amostras.

Usamos o modo de contato AFM para observar as morfologias bacterianas e os efeitos das NPs. A população e a morfologia celular das bactérias fixadas em um suporte podem ser observadas, assim como o dano celular produzido pelas nanopartículas sobre as espécies bacterianas. As imagens obtidas pelo modo de contato AFM confirmam que é uma ferramenta poderosa e não limitada por reagentes e procedimentos complicados, tornando-se um método simples, rápido e econômico para caracterização bacteriana.

Protocolo

1. Isolamento e identificação bacteriana

1. Isolamento de uma cepa endofítica de meristemas de bulbo de alho:
   1. Colocar fragmentos de 2 mm de meristemas de bulbos de alho previamente descascados, desinfectados e cortados em ágar de soja tripticase (TSA) como meio de crescimento rico e incubar a 25 °C por 1 dia.
   2. Com base nas diferenças morfológicas das colônias bacterianas - forma, tamanho, cor, borda, luz transmitida, luz refletida, textura, consistência e produção de pigmentos - descrever os diferentes morfotipos observados e purificar cruzando uma colônia representativa de cada morfotipo.
   3. Preservar todas as estirpes bacterianas purificadas em glicerol a 30% a −80 °C.
   4. Identificar uma cepa selecionada aleatoriamente (9AP) por sequenciamento do 16S rDNA. Extrair o DNA seguindo o método de Hoffman e Winston⁸.
   5. Amplificar o 16S rRNA por reação em cadeia da polimerase (PCR) com 100 ng de DNA, 1x tampão polimerase, 4 mM MgCl₂, 0,4 mM dNTPs, 10 pmol cada de 27F/1492r oligonucleotídeos universais e 1 U de DNA polimerase⁹. Use as seguintes condições de termociclador: 95 °C por 5 min para a desnaturalização inicial; seguido por 35 ciclos de 1 min a 94 °C como temperatura de desnaturalização, 1 min a 56 °C como temperatura de hibridização e 1 min a 72 °C como temperatura de extensão; e depois 10 min a 72 °C como extensão final.
   6. Sequenciamento capilar do produto da PCR usando os mesmos oligonucleotídeos; utilizar o método dideoxi-terminal com o kit de instalação da matriz para sequenciamento capilar¹⁰ e realizar eletroforese em sistema multicapilar automatizado¹¹.
   7. Editar manualmente as sequências, comparar a sequência com a biblioteca do GenBank usando uma busca BLAST e identificar provisoriamente a cepa com o padrão-ouro de pelo menos 98,7% de identidade com a espécie mais próxima^12,13.
      NOTA: A cepa 9AP foi identificada como pertencente à espécie Pseudomonas hunanensis, com identidade de 99,86% com a sequência da cepa P. hunanensis LV (JX545210).

2. Preparo de amostra bacteriana para observação morfológica por AFM

1. Em condições estéreis, coloque uma gota da suspensão bacteriana (Pseudomonas hunanensis, Staphylococcus aureus) em uma lâmina de vidro.
2. Fixe as amostras na lâmina por aquecimento a seco. Passe a lâmina suavemente sobre uma chama várias vezes até que a amostra esteja seca.
   NOTA: A fixação de amostras é uma técnica de rotina em microbiologia para observar organismos procarióticos fixos e simular sua estrutura como células vivas o mais próximo possível.
3. Coloque as amostras fixas em uma placa de Petri e leve-as ao equipamento AFM para observação.
   OBS: Como as amostras podem ser alteradas pelas condições climáticas ao longo do tempo, reserve um tempo máximo de 24 h para análise no equipamento AFM. Manter as amostras livres de poeira.

3. Efeito antibacteriano das nanopartículas de MgO contra bactérias

NOTA: A síntese e caracterização de NPs de MgO foram publicadas anteriormente¹⁴. Neste trabalho, a atividade antibacteriana dos nanomateriais foi estimada com base no manual do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) utilizando métodos de macrodiluição e microdiluição para inibição^15,16.

1. Estimativa da atividade inibitória mínima (CIM) e bactericidas (CMB)
   1. Pré-crescimento das cepas
      1. Inocular uma quantidade adequada de Escherichia coli ou Staphylococcus aureus em caldo nutritivo para obter uma concentração final de 1 × 10⁸ UFC/mL.
      2. Incubar a suspensão a 37 °C (± 2 °C) durante 18-24 h.
   2. Pós-crescimento de cepas aclimatizadas
      1. Mergulhe uma alça bacteriológica estéril na suspensão, tocando o fundo do tubo.
      2. Realizar streaking com a alça em ágar azul de eosina e metileno e ágar nutriente.
      3. Incubar as placas de ágar a 37 °C (± 2 °C) durante 24 horas.
   3. Seleção de colônias para a preparação do inóculo padronizado
      1. Pegue de três a cinco colônias com o mesmo tipo morfológico tocando o topo da colônia na placa de Petri com uma alça bacteriológica.
      2. Transfira e mergulhe a seleção em 3-5 mL de caldo Müller-Hinton.
      3. Incubar a 37 °C (± 2 °C) para atingir uma turbidez de 1 × 10⁸ UFC/mL ou 2 × 10⁸ UFC/mL.
         OBS: Neste trabalho, os padrões de turbidez de McFarland foram utilizados como referência para as suspensões bacteriológicas; especificamente, o padrão 0,5 corresponde aproximadamente a uma suspensão homogênea de E. coli de 1,5 × 10⁸ células/mL. Um espectrofotômetro UV-Vis foi usado para medir a turbidez.
      4. Tome 1 mL e adicione a 9 mL de caldo estéril. Tomar 200 μL desta diluição e adicioná-la a 19,8 mL de caldo estéril para obter uma concentração final de 5 × 10⁵ UFC/mL.
   4. Concentrações requeridas de nanopartículas de MgO
      1. Use um ultrasonicator para a preparação das soluções.
      2. Suspender o nanomaterial em água estéril com o dobro da concentração necessária para obter soluções seriadas.
      3. Adicione essas suspensões a tubos estéreis contendo caldo Müller-Hinton para atingir a nova faixa de concentrações necessárias para o experimento.
         NOTA: As seguintes concentrações de MgO NPs foram aplicadas para microdiluição: 30 ppm, 60 ppm, 120 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1.000 ppm, 2.000 ppm, 3.000 ppm, 4.000 ppm e 8.000 ppm.
   5. Preparação da microdiluição¹⁵
      1. Prepare uma nova e estéril placa de microtitulação de 96 poços (microplaca). Etiquetar a coluna nº 12 da microplaca como coluna de esterilidade; coluna de rótulo nº 11 como uma coluna de controle de crescimento.
      2. Adicionar 120 μL das suspensões de nanopartículas com as diferentes concentrações às colunas n.º 1-10.
      3. Inocular 120 μL de bactérias (5 × 10⁵ UFC/mL) nos poços nas colunas nº 1-10.
         NOTA: Para este estudo, as linhas G e H foram controles com ceftriaxona nas concentrações sugeridas pelos padrões CLSI: 8 ppm, 4 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0,5 ppm, 0,25 ppm, 0,125 ppm, 0,06 ppm e 0,03 ppm.
      4. Incubar a microplaca de 96 poços durante 24 h a 37 °C (35 °C ± 2 °C). Por fim, analise os poços.
2. Observação das alterações morfo-estruturais induzidas por nanopartículas de MgO nas linhagens bacterianas por AFM
   1. Retirar 250 μL dos poços dos testes de microdiluição, misturar com 750 μL de água estéril e centrifugar a 2.000 × g de 2 min a 5 min a 5 °C.
   2. Lavar os precipitados três vezes com 1 mL de água estéril de cada vez e, ao final das lavagens, adicionar 500 μL de água a eles.
   3. Para obter as imagens de AFM, retirar 10-20 μL da suspensão final de cada poço de partida, realizar um esfregaço em uma lâmina previamente limpa por ultrassom (30 min) e secar em temperatura ambiente por 1 h.

4. Medições de AFM

NOTA: Aqui, o microscópio de força atômica em modo de contato foi montado em uma estação de trabalho antivibratória que permitiu o isolamento do microscópio de quaisquer fontes vibracionais mecânicas e manteve o sistema nivelado. A interferência elétrica é diminuída com filtros de linha e proteção contra surtos. O AFM usado aqui alinha automaticamente o feixe de laser ao fotodetector.

1. Ligue o computador e o AFM e selecione o modo Contato, as sondas contAI-G e as opções Auto Slope nas ferramentas de software. Os valores padrão do controlador Z são Setpoint = 20 nM, P-Gain = 10.000, I-Gain = 1.000, D-Gain = 0 e Tip voltage = 0 mV.
2. Coloque as amostras no modo de contato AFM usando uma cabeça de varredura de 70 μm. Foram utilizados balanços de silicone ContAI-G com constante de mola de 0,13 N/m.
3. Use um dispositivo de câmera montado em duas lentes integradas à cabeça de varredura para obter uma visão rápida da superfície da área sob a sonda.
4. Execute manualmente um deslocamento no plano XY para escolher a área desejada. A sonda é feita para se aproximar eletronicamente da amostra de superfície até que as condições de contato sejam atingidas. Ajuste eletronicamente o plano de medição XY do scanner e a superfície da amostra reduzindo as inclinações nas direções XY.
5. Use os parâmetros padrão do software: 1 linha por segundo a 256 pontos por linha.
6. Primeiro, execute uma faixa de varredura completa de uma área de 70 μm x 70 μm; Em seguida, selecione uma área menor usando a ferramenta Zoom. O AFM otimiza o intervalo do gráfico em Z automaticamente.
   NOTA: Ao diminuir as linhas por segundo de tempo, o tempo total de varredura aumenta, a qualidade da varredura é mais definida e algum ruído da medição também é eliminado.
7. Para selecionar uma nova área da amostra, retraia o cantilever eletronicamente e mova a amostra ao longo do plano XY. Realize uma nova varredura usando o procedimento descrito nas etapas 4.5 e 4.6.
   NOTA: As varreduras obtidas são mostradas em uma escala de barra de cor única, na qual as cores claras são associadas a altitudes mais altas e as cores escuras são associadas a altitudes mais profundas. O software AFM gera uma visão 3D da varredura que permite a apreciação dos detalhes da superfície medida.
8. Execute o processamento de dados usando o nivelamento linha por linha no menu Ferramentas da imagem na seleção de filtro, que é o método de nivelamento mais usado e mais simples.
   Observação : esse método de nivelamento pega cada linha horizontal ou vertical produzida na imagem AFM e a ajusta a uma equação polinomial.
9. Otimize a altura máxima e mínima na barra de cores à direita para obter a melhor resolução de imagem.
10. Execute a análise de imagem usando o menu Análise na barra de ferramentas. Determine as alturas e distâncias selecionando os pontos iniciais e finais assim que a ferramenta desejada for selecionada.
    Observação : os usuários devem tentar os diferentes filtros do menu Ferramentas para evitar artefatos de imagem de ponta devido ao nivelamento usado no processo de nivelamento. Os artefatos de imagem aparecem como linhas de raia e são mostrados em algumas das imagens AFM.

Resultados

Imagens da morfologia e tamanho das cepas de S. aureus e P. hunanensis , bem como a organização populacional de ambas as linhagens, foram obtidas por microscopia de força atômica em modo de contato. As imagens de S. aureus mostraram que sua população estava distribuída por zonas com agregados de cocos (Figura 1A). Com o aumento da escala, houve maior valorização da distribuição populacional e morfologia dos cocos (Figura 1B...

Discussão

A microscopia é uma técnica comumente utilizada em laboratórios biológicos que permite a investigação da estrutura, tamanho, morfologia e arranjo celular de amostras biológicas. Para aprimorar essa técnica, podem ser utilizados diversos tipos de microscópios que diferem entre si em suas características ópticas ou eletrônicas, que determinam o poder de resolução do instrumento.

Na pesquisa científica, o uso da microscopia é necessário para a caracterização de células bacteri...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM EasyScan 2	NanoSurf	discontinued	Measurement Media
bacteriological loop	No aplica	not applicable	instrument for bacterial inoculation
BigDye Terminator v3.1	ThermoFisher Scientific	4337455	Matrix installation kit
Bioedit	not applicable	version 7.2.5	Sequence alignment editor
Cary 60 spectrometer	Agilent Technologies	not applicable
ceftriazone	Merck	not applicable	antibiotic
centrifuge	eppendorf	not applicable	to remove particles that interfere with AFM
ContAI-G Silicon cantilever	BudgetSensors	ContAl-G-10	Measurement Media
eosin and methylene blue agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC 25922	bacterial strain
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8295	PCR of 16S rRNA gene
microplate	Thermo Scientific	10558295	for microdilution analysis
Müller-Hinton broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutrient agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutritious broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Petri dishes	not applicable	not applicable	growth of bacteria
Pseudomonas hunanensis 9AP	not applicable	not applicable	isolated from the garlic bulb by CNRG
Sanger sequencing	Macrogen	not applicable	sequencing service
ScienceDesk Anti-Vibration workstation	ThorLabs
slides	not applicable	not applicable	glass holder for bacterial sample analysis
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection	ATCC 25923	bacterial strain
Thermalcycler	Applied Biosystems	Veriti-4375786	PCR amplification
Trypticasein soy agar	BD	BA-256665	growth media
ultrasonicator	Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC	not applicable	for mixing the nanoparticle dilutions