Morfolojik Gözlem ve Bakteriyel Hücre Hasar Analizi için Hızlı Bir Teknik Olarak Temas Modu Atomik Kuvvet Mikroskobu

Özet

Burada, atomik kuvvet mikroskobunun (AFM) bakteriyel karakterizasyonu için basit ve hızlı bir yöntem olarak uygulanmasını sunuyoruz ve bakteri boyutu ve şekli, bakteri kültürü biyofilmleri ve nanopartiküllerin bakterisitler olarak aktivitesi gibi ayrıntıları analiz ediyoruz.

Özet

Elektron mikroskobu, hücresel yapıları karakterize etmek için gerekli araçlardan biridir. Bununla birlikte, gözlem için numune hazırlama nedeniyle prosedür karmaşık ve pahalıdır. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), üç boyutlu yüksek çözünürlüğü ve vakum ve numune iletkenliği için herhangi bir gereksinimin bulunmaması nedeniyle çok kullanışlı bir karakterizasyon tekniğidir. AFM, farklı topografyalara ve farklı malzeme türlerine sahip çok çeşitli örnekleri görüntüleyebilir.

AFM, angstrom seviyesinden mikron ölçeğine kadar yüksek çözünürlüklü 3D topografya bilgileri sağlar. Geleneksel mikroskopiden farklı olarak, AFM bir numunenin yüzey topografyasının görüntüsünü oluşturmak için bir prob kullanır. Bu protokolde, bir destek üzerine sabitlenmiş bakterilerin morfolojik ve hücre hasarı karakterizasyonu için bu tip mikroskopinin kullanılması önerilmektedir. Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) ve Pseudomonas hunanensis (sarımsak ampulü örneklerinden izole edilmiş) suşları kullanıldı. Bu çalışmada, bakteri hücreleri belirli kültür ortamlarında yetiştirildi. Hücre hasarını gözlemlemek için, Staphylococcus aureus ve Escherichia coli , farklı konsantrasyonlarda nanopartiküller (NP'ler) ile inkübe edildi.

Bir cam destek üzerine bir damla bakteri süspansiyonu sabitlendi ve görüntüler AFM ile farklı ölçeklerde çekildi. Elde edilen görüntüler bakterilerin morfolojik özelliklerini göstermiştir. Ayrıca, AFM'yi kullanarak, NP'lerin etkisinin neden olduğu hücresel yapıdaki hasarı gözlemlemek mümkündü. elde edilen görüntülere dayanarak, bir destek üzerine sabitlenmiş bakteri hücrelerinin morfolojisini karakterize etmek için AFM ile temas kullanılabilir. AFM ayrıca NP'lerin bakteriler üzerindeki etkilerinin araştırılması için uygun bir araçtır. Elektron mikroskobu ile karşılaştırıldığında, AFM ucuz ve kullanımı kolay bir tekniktir.

Giriş

Farklı bakteri şekilleri ilk olarak 17. yüzyılda Antony van Leeuwenhoek tarafından kaydedilmiştir¹. Bakteriler, antik çağlardan beri, kürelerden dallanan hücrelere kadar çok çeşitli şekillerde var olmuşlardır². Hücre şekli, bakteriyel taksonomistlerin her bir bakteri türünü tanımlaması ve sınıflandırması için, esas olarak gram-pozitif ve gram-negatif filum^3'ün morfolojik olarak ayrılması için temel bir koşuldur. Bakteriyel hücre formlarını belirlediği bilinen çeşitli elementler, bunların hepsi hücre kapaklarında yer alır ve hücre duvarının ve zarının bileşenleri olarak ve ayrıca hücre iskeletinde desteklenir. Bu şekilde, bilim adamları hala bakteriyel hücre formlarının belirlenmesinde rol oynayan kimyasal, biyokimyasal ve fiziksel mekanizmaları ve süreçleri aydınlatmaktadır; bunların hepsi bakteriyel şekilleri tanımlayan gen kümeleri tarafından tanımlanmaktadır ^2,4.

Ek olarak, bilim adamları, çubuk şeklinin muhtemelen bakteri hücrelerinin atasal formu olduğunu göstermiştir, çünkü bu hücre şekli hücre açısından önemli parametrelerde en uygun görünmektedir. Bu nedenle, koklar, spiral, vibrio, filamentli ve diğer formlar çeşitli ortamlara adaptasyonlar olarak kabul edilir; Gerçekten de, belirli morfolojiler bağımsız olarak birçok kez evrimleşmiştir, bu da bakteri şekillerinin belirli ortamlara adaptasyonlar olabileceğini düşündürmektedir ^3,5. Bununla birlikte, bakteriyel hücre yaşam döngüsü boyunca, hücre şekli değişir ve bu aynı zamanda zararlı çevresel koşullara karşı genetik bir yanıt olarak da ortaya çıkar³. Bakteri hücresi şekli ve boyutu, bakterilerin sertliğini, sağlamlığını ve yüzey-hacim oranını güçlü bir şekilde belirler ve bu özellik biyoteknolojik işlemler için kullanılabilir⁶.

Elektronik mikroskopi, ışık bazlı mikroskopların ötesine ulaşılabilen yüksek büyütme nedeniyle biyolojik örnekleri incelemek için kullanılır. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) bu amaçla en sık kullanılan tekniklerdir; Bununla birlikte, numuneler uygun görüntüleri elde etmek için mikroskop odasına yerleştirilmeden önce bazı tedaviler gerektirir. Numuneler üzerinde altın bir kapak gereklidir ve toplam görüntü elde etmek için kullanılan süre çok uzun olmamalıdır. Buna karşılık, atomik kuvvet mikroskobu (AFM), yüzeylerin analizinde yaygın olarak kullanılan bir tekniktir, ancak biyolojik örneklerin incelenmesinde de kullanılmaktadır.

Yüzey analizinde kullanılan temas modu, temassız mod veya kılavuz çekme, manyetik kuvvet mikroskobu (MFM), iletken AFM, piezoelektrik kuvvet mikroskobu (PFM), tepe kuvveti kılavuz çekme (PFT), temas rezonansı ve kuvvet hacmi gibi çeşitli AFM modları vardır. Her mod, malzemelerin analizinde kullanılır ve malzemelerin yüzeyi ve mekanik ve fiziksel özellikleri hakkında farklı bilgiler sağlar. Bununla birlikte, PFT gibi biyolojik örneklerin in vitro analizi için bazı AFM modları kullanılır, çünkü PFT, sıvı bir ortamdaki hücreler hakkında topografik ve mekanik verilerin elde edilmesine izin verir⁷.

Bu çalışmada, her eski ve basit AFM modelinde bulunan en temel modu kullandık - temas modu. AFM, 100 μm'den küçük alanları taramak için keskin bir prob (yaklaşık <50 nm çapında) kullanır. Prob, numuneyle ilişkili kuvvet alanlarıyla etkileşime girmek için numuneye hizalanır. Kuvveti sabit tutmak için yüzey prob ile taranır. Daha sonra, konsol yüzey boyunca hareket ederken hareketinin izlenmesiyle yüzeyin bir görüntüsü oluşturulur. Toplanan bilgiler, yüzeyin yapışma, elastikiyet, viskozite ve kesme gibi nano-mekanik özelliklerini sağlar.

AFM temas modunda, konsol numune boyunca sabit bir sapmada taranır. Bu, numunelerin yüksekliğini (Z) belirlemeye izin verir ve bu, diğer elektronik mikroskop tekniklerine göre bir avantajı temsil eder. AFM yazılımı, uç ve numune yüzeyi arasındaki etkileşimle bir 3D görüntü taramasının oluşturulmasına izin verir ve uç sapması, bir lazer ve dedektör aracılığıyla numunenin yüksekliği ile ilişkilendirilir.

Sabit kuvvetle statik modda (temas modu), çıkış iki farklı görüntü sunar: yükseklik (z topografyası) ve sapma veya hata sinyali. Statik mod, özellikle statik modun uyguladığı yüksek yükleri ve burulma kuvvetlerini kaldırabilen havadaki sağlam numuneler için değerli, basit bir görüntüleme modudur. Sapma veya hata modu sabit kuvvet modunda çalıştırılır. Bununla birlikte, topografya görüntüsü, yüzey yapısına sapma sinyali eklenerek daha da geliştirilmiştir. Bu modda, sapma sinyali, sapma geri besleme parametresi olduğu için hata sinyali olarak da adlandırılır; Bu kanalda görünen herhangi bir özellik veya morfoloji, geri besleme döngüsündeki "hata" dan veya daha doğrusu, sabit bir sapma ayar noktasını korumak için gereken geri besleme döngüsünden kaynaklanmaktadır.

AFM'nin benzersiz tasarımı, onu kompakt hale getirir - bir masa üstüne sığacak kadar küçük - aynı zamanda atomik adımları çözmek için yeterince yüksek çözünürlüğe sahiptir. AFM ekipmanı, diğer elektronik mikroskoplar için ekipmandan daha düşük bir maliyete sahiptir ve bakım maliyetleri minimumdur. Mikroskop, temiz oda veya izole edilmiş bir alan gibi özel koşullara sahip bir laboratuvar gerektirmez; sadece titreşimsiz bir masaya ihtiyaç duyar. AFM için, numunelerin diğer tekniklerde (altın örtü, zayıflama) olduğu gibi ayrıntılı bir hazırlıktan geçmesi gerekmez; numune tutucuya sadece kuru bir numune takılmalıdır.

Bakteriyel morfolojileri ve NP'lerin etkilerini gözlemlemek için AFM temas modunu kullanıyoruz. Bir desteğe sabitlenmiş bakterilerin popülasyonu ve hücresel morfolojisinin yanı sıra nanopartiküllerin bakteri türleri üzerinde ürettiği hücresel hasar da gözlemlenebilir. AFM temas modu ile elde edilen görüntüler, güçlü bir araç olduğunu ve reaktifler ve karmaşık prosedürlerle sınırlı olmadığını doğrulayarak, bakteriyel karakterizasyon için basit, hızlı ve ekonomik bir yöntem haline getirmektedir.

Protokol

1. Bakteriyel izolasyon ve tanımlama

1. Sarımsak ampulü meristemlerinden endofitik bir suşun izolasyonu:
   1. Daha önce soyulmuş, dezenfekte edilmiş ve kesilmiş sarımsak ampullerinden 2 mm'lik meristem parçalarını zengin bir büyüme ortamı olarak triptikaz soya agar (TSA) üzerine yerleştirin ve 1 gün boyunca 25 ° C'de inkübe edin.
   2. Bakteri kolonilerinin morfolojik farklılıklarına dayanarak - şekil, boyut, renk, kenar, iletilen ışık, yansıyan ışık, doku, tutarlılık ve pigment üretimi - farklı gözlemlenen morfotipleri tanımlar ve her morfotipin temsili bir kolonisini çapraz çizerek arındırır.
   3. Tüm saflaştırılmış bakteri suşlarını -80 ° C'de% 30 gliserol içinde saklayın.
   4. 16S rDNA'yı dizileyerek rastgele seçilmiş bir suşu (9AP) tanımlayın. Hoffman ve Winston^8'in yöntemini izleyerek DNA'yı çıkarın.
   5. 16S rRNA'yı 100 ng DNA, 1x polimeraz tamponu, 4 mM MgCl₂, 0.4 mM dNTP'ler, 27F / 1492r üniversal oligonükleotidlerin her biri 10 pmol ve 1 U DNA polimeraz⁹ ile polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile yükseltin. Aşağıdaki termal döngüleyici koşullarını kullanın: İlk vatandaşlıktan çıkarma için 5 dakika boyunca 95 ° C; bunu denaturalizasyon sıcaklığı olarak 94 ° C'de 1 dakika, hibridizasyon sıcaklığı olarak 56 ° C'de 1 dakika ve uzatma sıcaklığı olarak 72 ° C'de 1 dakika olmak üzere 35 döngü izler; ve daha sonra son uzatma olarak 72 ° C'de 10 dakika.
   6. Aynı oligonükleotidleri kullanarak PCR ürününü kılcal dizilim; Kılcal dizileme¹⁰ için matris kurulum kiti ile dideoksi-terminal yöntemini kullanın ve otomatik bir çok kılcal sistem^11'de elektroforez gerçekleştirin.
   7. Dizileri manuel olarak düzenleyin, BLAST araması kullanarak diziyi GenBank kütüphanesiyle karşılaştırın ve en yakın tür^12,13 ile en az% ^98,7 kimlik altın standardıyla suşu geçici olarak tanımlayın.
      NOT: 9AP suşu Pseudomonas hunanensis türüne ait olarak tanımlanmıştır ve P. hunanensis LV (JX545210) suşu dizisi ile %99.86 kimlik göstermiştir.

2. AFM tarafından morfolojik gözlem için bakteriyel numune hazırlama

1. Steril koşullar altında, bir cam slayt üzerine bir damla bakteri süspansiyonu (Pseudomonas hunanensis, Staphylococcus aureus) yerleştirin.
2. Slayttaki numuneleri kuru ısıtma ile sabitleyin. Numune kuruyana kadar sürgüyü yavaşça bir alevin üzerinden birkaç kez geçirin.
   NOT: Örneklerin sabitlenmesi, sabit prokaryotik organizmaları gözlemlemek ve yapılarını canlı hücreler olarak mümkün olduğunca yakından simüle etmek için mikrobiyolojide rutin bir tekniktir.
3. Sabit numuneleri bir Petri kabına yerleştirin ve gözlem için AFM ekipmanına götürün.
   NOT: Numuneler zaman içinde hava koşullarına göre değiştirilebildiğinden, AFM ekipmanında analiz için maksimum 24 saatlik bir süre ayırın. Numuneleri tozdan uzak tutun.

3. MgO nanopartiküllerinin bakterilere karşı antibakteriyel etkisi

NOT: MgO NP'lerin sentezi ve karakterizasyonu daha önce yayınlanmıştır¹⁴. Bu çalışmada, nanomalzemelerin antibakteriyel aktivitesi, inhibisyon için makrodilüsyon ve mikrodilüsyon yöntemleri kullanılarak Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) el kitabına dayanarak tahmin edilmiştir^15,16.

1. Minimum inhibitör aktivite (MIC) ve bakterisitlerin (CMB) tahmini
   1. Suşların önceden büyümesi
      1. 1 × 10⁸ CFU / mL'lik nihai bir konsantrasyon elde etmek için uygun miktarda Escherichia coli veya Staphylococcus aureus'u besleyici et suyuna aşılayın.
      2. Süspansiyonu 18-24 saat boyunca 37 ° C'de (± 2 ° C) inkübe edin.
   2. İklimlendirilmiş suşların büyümesi sonrası
      1. Steril bir bakteriyolojik döngüyü süspansiyona daldırın, tüpün dibine dokunun.
      2. Eozin ve metilen mavisi agar ve besin agar üzerinde döngü ile çizgi çizin.
      3. Agar plakalarını 24 saat boyunca 37 ° C'de (± 2 ° C) inkübe edin.
   3. Standartlaştırılmış inokulumun hazırlanması için kolonilerin seçimi
      1. Petri kabındaki koloninin tepesine bakteriyolojik bir döngü ile dokunarak aynı morfolojik tipte üç ila beş koloni alın.
      2. Seçimi 3-5 mL Müller-Hinton suyuna aktarın ve daldırın.
      3. 1 × 10⁸ CFU/mL veya 2 × 10⁸ CFU/mL bulanıklık elde etmek için 37 °C'de (± 2 °C) inkübe edin.
         NOT: Bu çalışmada, bakteriyolojik süspansiyonlar için referans olarak McFarland bulanıklık standartları kullanılmıştır; spesifik olarak, 0.5 standardı yaklaşık olarak 1.5 × 10⁸ hücre / mL'lik homojen bir E. coli süspansiyonuna karşılık gelir. Bulanıklığı ölçmek için bir UV-Vis spektrofotometresi kullanıldı.
      4. 1 mL alın ve 9 mL steril et suyuna ekleyin. Bu seyreltmenin 200 μL'sini alın ve 5 × 10⁵ CFU / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 19.8 mL steril et suyuna ekleyin.
   4. MgO nanopartiküllerinin gerekli konsantrasyonları
      1. Çözeltilerin hazırlanması için bir ultrasonicator kullanın.
      2. Nanomalzemeyi steril suda, seri çözeltiler elde etmek için gereken konsantrasyonun iki katı konsantrasyonda askıya alın.
      3. Bu süspansiyonları, deney için gereken yeni konsantrasyon aralığını elde etmek için Müller-Hinton suyu içeren steril tüplere ekleyin.
         NOT: Mikrodilüsyon için aşağıdaki MgO NP konsantrasyonları uygulanmıştır: 30 ppm, 60 ppm, 120 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1.000 ppm, 2.000 ppm, 3.000 ppm, 4.000 ppm ve 8.000 ppm.
   5. Mikroseyreltmenin hazırlanması¹⁵
      1. Yeni ve steril bir 96 delikli mikrotitre plakası (mikroplaka) hazırlayın. Mikroplakanın 12 numaralı etiket sütunu sterilite sütunu olarak; etiket sütunu No. 11 bir büyüme kontrol sütunu olarak.
      2. 1-10 numaralı sütunlara farklı konsantrasyonlarda nanopartikül süspansiyonlarının 120 μL'sini ekleyin.
      3. 120 μL bakteriyi (5 × 10⁵ CFU/mL) 1-10 numaralı sütunlardaki kuyucuklara aşılayın.
         NOT: Bu çalışma için, G satırı ve H satırı, CLSI standartları tarafından önerilen konsantrasyonlarda seftriakson ile kontrol edildi: 8 ppm, 4 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0.5 ppm, 0.25 ppm, 0.125 ppm, 0.06 ppm ve 0.03 ppm.
      4. 96 delikli mikroplakayı 37 °C'de (35 °C ± 2 °C) 24 saat boyunca inkübe edin. Son olarak, kuyuları analiz edin.
2. AFM ile bakteri suşlarında MgO nanopartikül kaynaklı morfo-yapısal değişikliklerin gözlenmesi
   1. Mikroseyreltme testlerinin kuyucuklarından 250 μL alın, 750 μL steril su ile karıştırın ve 5 ° C'de 2 dakika ila 5 dakika arasında 2.000 × g'da santrifüj yapın.
   2. Çökeltileri her seferinde 1 mL steril su ile üç kez yıkayın ve yıkamaların sonunda bunlara 500 μL su ekleyin.
   3. AFM görüntülerini elde etmek için, her bir başlangıç kuyusunun son süspansiyonunun 10-20 μL'sini alın, daha önce ultrasonla temizlenmiş bir slaytta (30 dakika) bir yayma yapın ve oda sıcaklığında 1 saat kurutun.

4. AFM ölçümleri

NOT: Burada, temas modundaki atomik kuvvet mikroskobu, mikroskobun herhangi bir mekanik titreşim kaynağından izole edilmesine izin veren ve sistemi düz tutan bir titreşim önleyici iş istasyonuna monte edilmiştir. Hat filtreleri ve aşırı gerilim koruması ile elektriksel parazit azaltılır. Burada kullanılan AFM, lazer ışınını fotodetektöre otomatik olarak hizalar.

1. Bilgisayarı ve AFM'yi açın, ardından yazılım araçlarında Temas modunu, contAI-G problarını ve Otomatik Eğim seçeneklerini seçin. Z-kontrolörünün varsayılan değerleri Ayar Noktası = 20 nM, P-Kazanç = 10.000, I-Kazanç = 1.000, D-Kazanç = 0 ve Uç voltajı = 0 mV'dir.
2. Numuneleri 70 μm tarama aralığı kafası kullanarak AFM temas moduna yerleştirin. Yay sabiti 0,13 N/m olan ContAI-G silikon konsollar kullandık.
3. Probun altındaki alanın yüzeyinin hızlı bir görünümünü elde etmek için tarama kafasına entegre edilmiş iki lense monte edilmiş bir kamera cihazı kullanın.
4. İstediğiniz alanı seçmek için XY düzleminde manuel olarak bir yer değiştirme gerçekleştirin. Prob, temas koşullarına ulaşılana kadar yüzey numunesine elektronik olarak yaklaşacak şekilde yapılır. XY yönlerindeki eğimleri azaltarak tarayıcının ve numune yüzeyinin XY ölçüm düzlemini elektronik olarak ayarlayın.
5. Yazılımın standart parametrelerini kullanın: satır başına 256 noktada saniyede 1 satır.
6. İlk olarak, 70 μm x 70 μm alanın tam tarama aralığını gerçekleştirin; Ardından, yakınlaştırma aracını kullanarak daha küçük bir alan seçin. AFM, grafik aralığını Z'de otomatik olarak optimize eder.
   NOT: Saniyedeki çizgileri azaltarak, toplam tarama süresi artar, taramanın kalitesi daha fazla tanımlanır ve ölçümden gelen bazı gürültüler de temizlenir.
7. Numuneden yeni bir alan seçmek için, konsolu elektronik olarak geri çekin ve numuneyi XY düzlemi boyunca hareket ettirin. Adım 4.5 ve adım 4.6'da açıklanan yordamı kullanarak yeni bir tarama gerçekleştirin.
   NOT: Elde edilen taramalar, açık renklerin daha yüksek rakımlarla ve koyu renklerin daha derin rakımlarla ilişkilendirildiği tek renkli bir çubuk ölçeğinde gösterilir. AFM yazılımı, ölçülen yüzeyin ayrıntılarının takdir edilmesini sağlayan taramanın 3D görünümünü oluşturur.
8. En çok kullanılan ve en basit tesviye yöntemi olan filtre seçiminde görüntünün Araçlar menüsündeki satır satır seviyelendirmeyi kullanarak veri işlemeyi gerçekleştirin.
   NOT: Bu tesviye yöntemi, AFM görüntüsünde üretilen her yatay veya dikey çizgiyi alır ve bir polinom denklemine sığdırır.
9. En iyi görüntü çözünürlüğünü elde etmek için sağdaki renk çubuğundaki maksimum ve minimum yüksekliği optimize edin.
10. Araçlar çubuğundaki Analiz menüsünü kullanarak görüntü analizini gerçekleştirin. İstediğiniz araç seçildikten sonra başlangıç ve son noktaları seçerek yükseklikleri ve mesafeleri belirleyin.
    NOT: Kullanıcılar, seviyelendirme işleminde kullanılan düzleştirme nedeniyle ipucu-görüntü yapıtlarını önlemek için Araçlar menüsünün farklı filtrelerini denemelidir. Görüntü yapıları çizgi çizgileri olarak görünür ve bazı AFM görüntülerinde gösterilir.

Sonuçlar

S. aureus ve P. hunanensis suşlarının morfolojisi ve büyüklüğünün yanı sıra her iki suşun popülasyon organizasyonunun görüntüleri, temas modunda atomik kuvvet mikroskobu ile alındı. S. aureus görüntüleri, popülasyonunun kok agregaları olan bölgelere göre dağıldığını göstermiştir (Şekil 1A). Ölçekteki artışla birlikte, kokların popülasyon dağılımı ve morfolojisi hakkında daha fazla bir takdir vardı (

Tartışmalar

Mikroskopi, biyolojik laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan ve biyolojik örneklerin yapısının, boyutunun, morfolojisinin ve hücresel düzenlemesinin araştırılmasına izin veren bir tekniktir. Bu tekniği geliştirmek için, cihazın çözünürlük gücünü belirleyen optik veya elektronik özellikleri bakımından birbirinden farklı çeşitli mikroskop türleri kullanılabilir.

Bilimsel araştırmalarda, bakteri hücrelerinin karakterizasyonu için mikroskopi kullanımı gerek...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM EasyScan 2	NanoSurf	discontinued	Measurement Media
bacteriological loop	No aplica	not applicable	instrument for bacterial inoculation
BigDye Terminator v3.1	ThermoFisher Scientific	4337455	Matrix installation kit
Bioedit	not applicable	version 7.2.5	Sequence alignment editor
Cary 60 spectrometer	Agilent Technologies	not applicable
ceftriazone	Merck	not applicable	antibiotic
centrifuge	eppendorf	not applicable	to remove particles that interfere with AFM
ContAI-G Silicon cantilever	BudgetSensors	ContAl-G-10	Measurement Media
eosin and methylene blue agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC 25922	bacterial strain
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8295	PCR of 16S rRNA gene
microplate	Thermo Scientific	10558295	for microdilution analysis
Müller-Hinton broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutrient agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutritious broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Petri dishes	not applicable	not applicable	growth of bacteria
Pseudomonas hunanensis 9AP	not applicable	not applicable	isolated from the garlic bulb by CNRG
Sanger sequencing	Macrogen	not applicable	sequencing service
ScienceDesk Anti-Vibration workstation	ThorLabs
slides	not applicable	not applicable	glass holder for bacterial sample analysis
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection	ATCC 25923	bacterial strain
Thermalcycler	Applied Biosystems	Veriti-4375786	PCR amplification
Trypticasein soy agar	BD	BA-256665	growth media
ultrasonicator	Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC	not applicable	for mixing the nanoparticle dilutions