形態学的観察および細菌細胞損傷解析のための迅速技術としての接触モード原子間力顕微鏡法

要約

ここでは、細菌の特性評価のための簡単で迅速な方法としての原子間力顕微鏡(AFM)の応用を紹介し、細菌のサイズと形状、細菌培養バイオフィルム、殺菌剤としてのナノ粒子の活性などの詳細を分析します。

要約

電子顕微鏡は、細胞構造を特徴付けるために必要なツールの1つです。しかし、観察のための試料調製のため、手順は複雑で費用がかかります。原子間力顕微鏡(AFM)は、3次元での分解能が高く、真空やサンプルの導電率を必要としないため、非常に有用な特性評価技術です。AFMは、さまざまなトポグラフィーとさまざまな種類の材料でさまざまなサンプルをイメージングできます。

AFMは、オングストロームレベルからミクロンスケールまでの高解像度の3Dトポグラフィー情報を提供します。従来の顕微鏡とは異なり、AFMはプローブを使用してサンプルの表面トポグラフィーの画像を生成します。このプロトコルでは、このタイプの顕微鏡の使用は、支持体上に固定された細菌の形態学的および細胞損傷の特性評価のために示唆されている。 黄色ブドウ 球菌(ATCC 25923)、 大腸菌 (ATCC 25922)、および シュードモナス・フナネンシス (ニンニク球根サンプルから分離)の株を使用しました。この研究では、細菌細胞を特定の培地で増殖させました。細胞の損傷を観察するために、 黄色ブドウ 球菌と 大腸菌 を異なる濃度のナノ粒子(NP)とともにインキュベートしました。

一滴の細菌懸濁液をガラス支持体上に固定し、AFMを用いて異なるスケールで画像を撮影した。得られた画像は、細菌の形態学的特徴を示した。また、AFMを採用して、NPsの効果による細胞構造の損傷を観察することができた。 得られた画像に基づいて、接触AFMを使用して、支持体上に固定された細菌細胞の形態を特徴付けることができる。AFMは、細菌に対するNPの影響を調査するための適切なツールでもあります。電子顕微鏡と比較して、AFMは安価で使いやすい技術です。

概要

さまざまな細菌の形は、17世紀にアントニーファンレーウェンフックによって最初に注目されました¹。細菌は古来より球体から枝分かれ細胞まで多種多様な形で存在してきました²。細胞の形状は、細菌分類学者が各細菌種を記述および分類するための基本的な条件であり、主にグラム陽性門とグラム陰性門³の形態学的分離のために。細菌の細胞形態を決定するいくつかの要素が知られており、そのすべてが細胞壁および膜の構成要素として、ならびに細胞骨格において細胞カバーおよび支持体に関与している。このようにして、科学者たちは、細菌の形状を定義する遺伝子のクラスターによって定義される細菌細胞の形態を決定することに関係する化学的、生化学的、物理的メカニズムとプロセスをまだ解明しています^2,4。

さらに、科学者たちは、この細胞の形状が細胞の重要なパラメータで最適に見えるため、桿体の形状が細菌細胞の祖先の形態である可能性が高いことを示しました。したがって、球菌、らせん状、ビブリオ状、糸状、およびその他の形態は、さまざまな環境への適応と見なされます。実際、特定の形態は独立して何度も進化しており、細菌の形状が特定の環境に適応している可能性があることを示唆しています<....

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プロトコル

1.細菌の分離と同定

1. ニンニク球根分裂組織からの内生株の単離:
   1. 以前に皮をむき、消毒し、カットしたニンニクの球根から2 mmの分裂組織の断片を、豊富な増殖培地としてトリプチカーゼ大豆寒天培地(TSA)に置き、25°Cで1日間インキュベートします。
   2. 細菌コロニーの形態学的違い(形状、サイズ、色、エッジ、透過光、反射光、テクスチャー、粘稠度、および色素産生)に基づいて、観察されたさまざまな形態型を記述し、各形態型の代表的なコロニーを交差ストリーキングすることによって精製します。
   3. 精製されたすべての細菌株を-80°Cの30%グリセロールで保存します。
   4. 16S rDNAのシーケンシングにより、無作為に選択した株(9AP)を同定します。ホフマンとウィンストン^8の方法に従ってDNAを抽出します。
   5. 100 ng の DNA、1 x ポリメラーゼバッファー、4 mM MgCl₂、0.4 mM dNTP、27F/1492r ユニバーサルオリゴヌクレオチド各 10 pmol、および 1 U の DNA ポリメラーゼ⁹ を用いたポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) により、16S rRNA を増幅します。次のサーマルサイクラー条件を使用します:最初の変性のために5分間95°C。続いて、脱....

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結果

黄色ブドウ球菌株とP. hunanensis株の形態とサイズの画像、および両方の株の集団構成を、接触モードで原子間力顕微鏡で撮影しました。黄色ブドウ球菌の画像は、その個体群が球菌の集合体を持つゾーンによって分布していることを示しました(図1A)。規模が大きくなるにつれて、球菌の個体群分布と形態に対する認識が高まりました(?.......

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ディスカッション

顕微鏡法は、生物学的サンプルの構造、サイズ、形態、および細胞配置の調査を可能にする生物学実験室で一般的に使用される技術です。この技術を改善するために、機器の分解能を決定する光学的または電子的特性の点で互いに異なるいくつかのタイプの顕微鏡を使用することができる。

科学研究では、細菌細胞の特性評価には顕微鏡の使用が必要です。例えば、顕?.......

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM EasyScan 2	NanoSurf	discontinued	Measurement Media
bacteriological loop	No aplica	not applicable	instrument for bacterial inoculation
BigDye Terminator v3.1	ThermoFisher Scientific	4337455	Matrix installation kit
Bioedit	not applicable	version 7.2.5	Sequence alignment editor
Cary 60 spectrometer	Agilent Technologies	not applicable
ceftriazone	Merck	not applicable	antibiotic
centrifuge	eppendorf	not applicable	to remove particles that interfere with AFM
ContAI-G Silicon cantilever	BudgetSensors	ContAl-G-10	Measurement Media
eosin and methylene blue agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC 25922	bacterial strain
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8295	PCR of 16S rRNA gene
microplate	Thermo Scientific	10558295	for microdilution analysis
Müller-Hinton broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutrient agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutritious broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Petri dishes	not applicable	not applicable	growth of bacteria
Pseudomonas hunanensis 9AP	not applicable	not applicable	isolated from the garlic bulb by CNRG
Sanger sequencing	Macrogen	not applicable	sequencing service
ScienceDesk Anti-Vibration workstation	ThorLabs
slides	not applicable	not applicable	glass holder for bacterial sample analysis
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection	ATCC 25923	bacterial strain
Thermalcycler	Applied Biosystems	Veriti-4375786	PCR amplification
Trypticasein soy agar	BD	BA-256665	growth media
ultrasonicator	Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC	not applicable	for mixing the nanoparticle dilutions