Атомно-силовая микроскопия в контактном режиме как быстрый метод морфологического наблюдения и анализа повреждений бактериальных клеток

Резюме

Здесь мы представляем применение атомно-силовой микроскопии (АСМ) как простого и быстрого метода характеристики бактерий и анализируем такие детали, как размер и форма бактерий, биопленки бактериальных культур и активность наночастиц в качестве бактерицидов.

Аннотация

Электронная микроскопия является одним из инструментов, необходимых для характеристики клеточных структур. Однако процедура сложная и дорогостоящая из-за подготовки образца к наблюдению. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) является очень полезным методом определения характеристик из-за ее высокого разрешения в трех измерениях и из-за отсутствия каких-либо требований к проводимости вакуума и образца. АСМ может получать изображения широкого спектра образцов с различной рельефностью и различными типами материалов.

АСМ предоставляет 3D-топографическую информацию высокого разрешения от уровня ангстрема до микронного масштаба. В отличие от традиционной микроскопии, АСМ использует зонд для создания изображения топографии поверхности образца. В этом протоколе предлагается использовать этот тип микроскопии для морфологической характеристики и характеристики повреждений клеток бактерий, закрепленных на носителе. Были использованы штаммы Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) и Pseudomonas hunanensis (выделенные из образцов луковиц чеснока). В этой работе бактериальные клетки были выращены в специфических питательных средах. Для наблюдения за повреждением клеток золотистый стафилококк и кишечная палочка инкубировали с различными концентрациями наночастиц (НУП).

Каплю бактериальной суспензии фиксировали на стеклянной подставке, а снимки делали с помощью АСМ в разных масштабах. Полученные изображения показали морфологические характеристики бактерий. Далее, используя АСМ, можно было наблюдать повреждение клеточной структуры, вызванное действием НУП. На основании полученных изображений контактный АСМ может быть использован для характеристики морфологии бактериальных клеток, закрепленных на носителе. АСМ также является подходящим инструментом для исследования воздействия НП на бактерии. По сравнению с электронной микроскопией, АСМ является недорогим и простым в использовании методом.

Введение

Различные формы бактерий были впервые отмечены Антони ван Левенгуком в 17 веке¹. Бактерии существовали в большом разнообразии форм с древних времен, начиная от сфер и заканчивая ветвящимися клетками². Форма клеток является фундаментальным условием для бактериальных таксономистов при описании и классификации каждого вида бактерий, главным образом для морфологического разделения грамположительных и грамотрицательных типов³. Известно, что несколько элементов определяют формы бактериальных клеток, все из которых участвуют в клеточных покровах и опорах в качестве компонентов клеточной стенки и мембраны, а также в цитоскелете. Таким образом, ученые все еще выясняют химические, биохимические и физические механизмы и процессы, участвующие в определении форм бактериальных клеток, все из которых определяются кластерами генов, определяющих формы бактерий ^2,4.

Кроме того, ученые показали, что форма палочки, вероятно, является предковой формой бактериальных клеток, поскольку эта форма клеток кажется оптимальной по значимым для клеток параметрам. Таким образом, кокки, спирали, вибрионы, нитевидные и другие формы рассматриваются как приспособления к различным средам; Действительно, определенные морфологии развивались независимо несколько раз, предполагая, что формы бактерий могут быть адаптацией к определенным средам ^3,5. Однако на протяжении всего жизненного цикла бактериальной клетки форма клетки изменяется, и это также происходит как генетическая реакция на вредные условия окружающей среды³. Форма и размер бактериальных клеток в значительной степени определяют жесткость, прочность и отношение поверхности к объему бактерий, и эта характеристика может быть использована для биотехнологических процессов⁶.

Электронная микроскопия используется для изучения биологических образцов из-за большого увеличения, которое может быть достигнуто за пределами световых микроскопов. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) и сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) являются наиболее часто используемыми методами для этой цели; Тем не менее, образцы требуют некоторой обработки, прежде чем они будут помещены в камеру микроскопа для получения соответствующих изображений. На образцах требуется золотая крышка, а время, затрачиваемое на полное получение изображения, не должно быть слишком большим. Напротив, атомно-силовая микроскопия (АСМ) является методом, широко используемым при анализе поверхностей, но также используется при изучении биологических образцов.

Существует несколько типов режимов АСМ, используемых при анализе поверхности, таких как контактный режим, бесконтактный режим или постукивание, магнитно-силовая микроскопия (MFM), проводящая АСМ, пьезоэлектрическая силовая микроскопия (PFM), пиковая силовая резьба (PFT), контактный резонанс и объем силы. Каждый режим используется при анализе материалов и предоставляет различную информацию о поверхности материалов и их механических и физических свойствах. Тем не менее, некоторые режимы АСМ используются для анализа биологических образцов in vitro, такие как ПФТ, поскольку ПФТ позволяет получать топографические и механические данные о клетках в жидкой среде⁷.

В этой работе мы использовали самый основной режим, входящий в каждую старую и простую модель АСМ - контактный режим. АСМ использует острый зонд (диаметром около <50 нм) для сканирования областей менее 100 мкм. Зонд выравнивается по образцу, чтобы взаимодействовать с силовыми полями, связанными с образцом. Поверхность сканируется с помощью зонда, чтобы поддерживать постоянную силу. Затем изображение поверхности генерируется путем наблюдения за движением кантилевера при его движении по поверхности. Собранная информация обеспечивает наномеханические свойства поверхности, такие как адгезия, эластичность, вязкость и сдвиг.

В контактном режиме АСМ кантилевер сканируется поперек образца с фиксированным отклонением. Это позволяет определить высоту образцов (Z), и это представляет собой преимущество по сравнению с другими методами электронного микроскопа. Программное обеспечение AFM позволяет генерировать сканирование 3D-изображения за счет взаимодействия между наконечником и поверхностью образца, а отклонение наконечника коррелирует с высотой образца с помощью лазера и детектора.

В статическом режиме (контактный режим) с постоянной силой на выходе отображаются два разных изображения: высота (z-топография) и сигнал отклонения или ошибки. Статический режим является ценным и простым режимом визуализации, особенно для прочных образцов в воздухе, которые могут выдерживать высокие нагрузки и крутильные силы, оказываемые статическим режимом. Режим отклонения или ошибки работает в режиме постоянной силы. Тем не менее, топографическое изображение дополнительно улучшается за счет добавления сигнала отклонения к структуре поверхности. В этом режиме сигнал отклонения также называется сигналом ошибки, поскольку отклонение является параметром обратной связи; Любые особенности или морфология, которые появляются в этом канале, обусловлены «ошибкой» в петле обратной связи или, скорее, петлей обратной связи, необходимой для поддержания постоянного заданного значения отклонения.

Уникальная конструкция АСМ делает его компактным - достаточно маленьким, чтобы поместиться на столешнице, - а также имеет достаточно высокое разрешение для разрешения атомарных шагов. Оборудование АСМ имеет меньшую стоимость, чем оборудование для других электронных микроскопов, а затраты на обслуживание минимальны. Микроскоп не требует лаборатории с особыми условиями, такими как чистая комната или изолированное пространство; Ему нужен только стол без вибрации. Для АСМ образцы не нуждаются в сложной подготовке, как при других методах (золотое покрытие, похудение); К держателю образца должен быть прикреплен только сухой образец.

Мы используем контактный режим AFM для наблюдения за морфологией бактерий и воздействием НУП. Можно наблюдать популяцию и клеточную морфологию бактерий, закрепленных на носителе, а также клеточное повреждение, вызванное наночастицами на видах бактерий. Изображения, полученные в контактном режиме АСМ, подтверждают, что это мощный инструмент и не ограничен реагентами и сложными процедурами, что делает его простым, быстрым и экономичным методом характеристики бактерий.

протокол

1. Выделение и идентификация бактерий

1. Выделение эндофитного штамма из меристем луковиц чеснока:
   1. Поместите 2-миллиметровые фрагменты меристем из ранее очищенных, продезинфицированных и разрезанных луковиц чеснока на триптиказный соевый агар (TSA) в качестве богатой питательной среды и инкубируйте при 25 ° C в течение 1 дня.
   2. Основываясь на морфологических различиях бактериальных колоний - форме, размере, цвете, краях, проходящем свете, отраженном свете, текстуре, консистенции и производстве пигмента - описывают различные наблюдаемые морфотипы и очищают путем перекрестного полосирования репрезентативной колонии каждого морфотипа.
   3. Храните все очищенные штаммы бактерий в 30% глицерине при температуре -80 °C.
   4. Идентификация случайно выбранного штамма (9AP) путем секвенирования 16S рДНК. Извлеките ДНК по методу Хоффмана и^{Уинстона 8}.
   5. Амплификация 16S рРНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) со 100 нг ДНК, 1x полимеразным буфером, 4 мМ MgCl2, 0,4 мМ dNTP_{, по} 10 пмоль универсальных олигонуклеотидов 27F/1492r и 1 ЕД ДНК-полимеразы⁹. Используйте следующие условия термоциклера: 95 °C в течение 5 минут для первоначальной денатурализации; затем следуют 35 циклов по 1 мин при 94 °C в качестве температуры денатурализации, 1 мин при 56 °C в качестве температуры гибридизации и 1 мин при 72 °C в качестве температуры расширения; а затем 10 мин при 72 °C в качестве окончательного продления.
   6. Капиллярная последовательность продукта ПЦР с использованием тех же олигонуклеотидов; Используйте дидезокситерминальный метод с матричным установочным комплектом для капиллярного секвенирования¹⁰ и выполняйте электрофорез в автоматизированной мультикапиллярной системе¹¹.
   7. Вручную отредактируйте последовательности, сравните последовательность с библиотекой GenBank с помощью поиска BLAST и предварительно определите штамм с золотым стандартом не менее 98,7% идентичности с ближайшим видом^12,13.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм 9AP был идентифицирован как принадлежащий к виду Pseudomonas hunanensis с идентичностью 99,86% с последовательностью штамма P. hunanensis LV (JX545210).

2. Бактериальная пробоподготовка для морфологического наблюдения с помощью АСМ

1. В стерильных условиях поместите каплю бактериальной суспензии (Pseudomonas hunanensis, Staphylococcus aureus) на предметное стекло.
2. Зафиксируйте образцы на предметном стекле сухим нагревом. Осторожно проведите предметным стеклом над пламенем несколько раз, пока образец не высохнет.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация образцов является обычным методом в микробиологии для наблюдения за фиксированными прокариотическими организмами и для моделирования их структуры как живых клеток как можно ближе.
3. Поместите фиксированные образцы в чашку Петри и отнесите их к оборудованию AFM для наблюдения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку образцы могут изменяться в зависимости от погодных условий с течением времени, выделите максимум 24 часа для анализа в оборудовании AFM. Следите за тем, чтобы образцы не попадали в пыль.

3. Антибактериальное действие наночастиц MgO против бактерий

ПРИМЕЧАНИЕ: Синтез и характеристика НУП MgO были опубликованы ранее¹⁴. В данной работе антибактериальная активность наноматериалов оценивалась на основе руководства Института клинико-лабораторных стандартов (CLSI) с использованием методов макроразведения и микроразведения для ингибирования^15,16.

1. Оценка минимальной ингибирующей активности (MIC) и бактерицидов (CMB)
   1. Предварительный рост штаммов
      1. Инокулируйте соответствующее количество Escherichia coli или Staphylococcus aureus в питательный бульон, чтобы получить конечную концентрацию 1 × 10⁸ КОЕ / мл.
      2. Инкубировать суспензию при 37 °C (± 2 °C) в течение 18-24 ч.
   2. Построст акклиматизированных штаммов
      1. Погрузите стерильную бактериологическую петлю в суспензию, касаясь дна пробирки.
      2. Нанесите полосы петлей на эозин и метиленовый синий агар и питательный агар.
      3. Инкубировать агаровые пластины при 37 °C (± 2 °C) в течение 24 ч.
   3. Отбор колоний для приготовления стандартизированного посевного материала
      1. Возьмите от трех до пяти колоний с одинаковым морфологическим типом, коснувшись бактериологической петлей верхней части колонии в чашке Петри.
      2. Перенесите и погрузите выделение в 3-5 мл бульона Мюллера-Хинтона.
      3. Инкубировать при 37 °C (± 2 °C) до достижения мутности 1 × 10 8 КОЕ/мл или 2 × 10⁸ КОЕ/мл.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В этой работе стандарты мутности Макфарланда использовались в качестве эталона для бактериологических суспензий; в частности, стандарт 0,5 приблизительно соответствует однородной суспензии E. coli 1,5 × 10⁸ клеток/мл. Для измерения мутности использовался УФ-ВИД спектрофотометр.
      4. Возьмите 1 мл и добавьте его к 9 мл стерильного бульона. Возьмите 200 мкл этого разведения и добавьте его к 19,8 мл стерильного бульона, чтобы получить конечную концентрацию 5 × 10⁵ КОЕ / мл.
   4. Требуемые концентрации наночастиц MgO
      1. Используйте ультразвуковой аппарат для приготовления растворов.
      2. Суспендировать наноматериал в стерильной воде в концентрации, в два раза превышающей концентрацию, необходимую для получения серийных растворов.
      3. Добавьте эти суспензии в стерильные пробирки, содержащие бульон Мюллера-Хинтона, чтобы достичь нового диапазона концентраций, необходимых для эксперимента.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для микроразбавления применялись следующие концентрации НЧ MgO: 30 ppm, 60 ppm, 120 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1,000 ppm, 2,000 ppm, 3,000 ppm, 4,000 ppm и 8,000 ppm.
   5. Приготовление микроразведения¹⁵
      1. Подготовьте новую стерильную 96-луночную микротитровальную пластинку (микропланшет). Этикетка колонки No 12 микропланшета в виде стерильной колонки; столбец No 11 в качестве столбца контроля роста.
      2. В колонки No 1-10 добавляют 120 мкл суспензий наночастиц различной концентрации.
      3. Инокулировать 120 мкл бактерий (5 × 10⁵ КОЕ/мл) в лунки в колонки No1-10.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования ряд G и ряд H были контрольными с цефтриаксоном в концентрациях, рекомендованных стандартами CLSI: 8 ppm, 4 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0,5 ppm, 0,25 ppm, 0,125 ppm, 0,06 ppm и 0,03 ppm.
      4. Инкубируйте 96-луночную микропланшет в течение 24 ч при 37 °C (35 °C ± 2 °C). Наконец, проанализируйте скважины.
2. Наблюдение морфоструктурных изменений, индуцированных наночастицами MgO, в бактериальных штаммах с помощью АСМ
   1. Возьмите 250 мкл из лунок тестов на микроразведение, смешайте с 750 мкл стерильной воды и центрифугу при 2000 × г от 2 до 5 минут при 5 ° C.
   2. Каждый раз трижды промывать осадки 1 мл стерильной воды, а в конце промывания добавлять к ним 500 мкл воды.
   3. Для получения снимков АСМ берут 10-20 мкл окончательной суспензии каждой стартовой лунки, проводят мазок на предметное стекло, предварительно очищенное ультразвуком (30 мин), и сушат при комнатной температуре в течение 1 ч.

4. Измерения АСМ

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь атомно-силовой микроскоп в контактном режиме был установлен на антивибрационной рабочей станции, которая позволяла изолировать микроскоп от любых механических источников колебаний и удерживала систему в горизонтальном положении. Электрические помехи уменьшаются с помощью линейных фильтров и защиты от перенапряжения. АСМ, используемая здесь, автоматически выравнивает лазерный луч по отношению к фотоприемнику.

1. Включите компьютер и AFM, затем выберите в программных инструментах режим контакта, датчики contAI-G и параметры Auto Slope. Значения Z-контроллера по умолчанию: Setpoint = 20 нМ, P-Gain = 10 000, I-Gain = 1,000, D-Gain = 0 и Tip voltage = 0 мВ.
2. Поместите образцы в контактный режим АСМ с помощью сканирующей головки 70 мкм. Мы использовали кремниевые консоли ContAI-G с постоянной пружины 0,13 Н/м.
3. Используйте камеру, установленную на двух линзах, встроенных в сканирующую головку, чтобы получить быстрый обзор поверхности области под зондом.
4. Вручную выполните смещение в плоскости XY, чтобы выбрать нужную область. Зонд предназначен для электронного приближения к поверхностному образцу до тех пор, пока не будут достигнуты условия контакта. Электронная регулировка плоскости измерения XY сканера и поверхности образца, уменьшая наклоны в направлениях XY.
5. Используйте стандартные параметры программного обеспечения: 1 строка в секунду при 256 точках на линию.
6. Во-первых, выполните полный диапазон сканирования области 70 мкм x 70 мкм; Затем выберите меньшую область с помощью инструмента «Масштабирование». AFM автоматически оптимизирует диапазон графика в Z.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При уменьшении количества строк в секунду общее время сканирования увеличивается, качество сканирования становится более четким, а также устраняется некоторый шум от измерения.
7. Чтобы выбрать новую область из образца, втяните консоль электронным способом и переместите образец вдоль плоскости XY. Выполните новое сканирование, используя процедуру, описанную в шагах 4.5 и 4.6.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полученные сканы показаны в одноцветной гистограмме, в которой светлые цвета связаны с большими высотами, а темные цвета связаны с более глубокими высотами. Программное обеспечение AFM генерирует 3D-вид скана, который позволяет оценить детали измеряемой поверхности.
8. Выполните обработку данных с помощью построчного выравнивания в меню «Инструменты» изображения в выбранном фильтре, который является наиболее используемым и простым методом выравнивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод выравнивания берет каждую горизонтальную или вертикальную линию, полученную на изображении AFM, и подгоняет ее под полиномиальное уравнение.
9. Оптимизируйте максимальную и минимальную высоту на цветовой панели справа, чтобы получить наилучшее разрешение изображения.
10. Выполните анализ изображений с помощью меню «Анализ » на панели инструментов. Определите высоту и расстояния, выбрав начальную и конечную точки после выбора нужного инструмента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи должны попробовать различные фильтры меню «Инструменты », чтобы избежать артефактов изображения подсказки из-за сведения, используемого в процессе выравнивания. Артефакты изображения отображаются в виде линий полос и показаны на некоторых изображениях AFM.

Результаты

С помощью атомно-силовой микроскопии в контактном режиме были получены изображения морфологии и размеров штаммов S. aureus и P. hunanensis , а также популяционной организации обоих штаммов.  Снимки S. aureus показали, что его популяция распределена по зонам с скоплениями кокков (

Обсуждение

Микроскопия — это метод, обычно используемый в биологических лабораториях, который позволяет исследовать структуру, размер, морфологию и клеточное расположение биологических образцов. Для совершенствования этой методики можно использовать несколько типов микроскопов, отличающихся...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM EasyScan 2	NanoSurf	discontinued	Measurement Media
bacteriological loop	No aplica	not applicable	instrument for bacterial inoculation
BigDye Terminator v3.1	ThermoFisher Scientific	4337455	Matrix installation kit
Bioedit	not applicable	version 7.2.5	Sequence alignment editor
Cary 60 spectrometer	Agilent Technologies	not applicable
ceftriazone	Merck	not applicable	antibiotic
centrifuge	eppendorf	not applicable	to remove particles that interfere with AFM
ContAI-G Silicon cantilever	BudgetSensors	ContAl-G-10	Measurement Media
eosin and methylene blue agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC 25922	bacterial strain
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8295	PCR of 16S rRNA gene
microplate	Thermo Scientific	10558295	for microdilution analysis
Müller-Hinton broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutrient agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutritious broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Petri dishes	not applicable	not applicable	growth of bacteria
Pseudomonas hunanensis 9AP	not applicable	not applicable	isolated from the garlic bulb by CNRG
Sanger sequencing	Macrogen	not applicable	sequencing service
ScienceDesk Anti-Vibration workstation	ThorLabs
slides	not applicable	not applicable	glass holder for bacterial sample analysis
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection	ATCC 25923	bacterial strain
Thermalcycler	Applied Biosystems	Veriti-4375786	PCR amplification
Trypticasein soy agar	BD	BA-256665	growth media
ultrasonicator	Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC	not applicable	for mixing the nanoparticle dilutions