Microscopía de fuerza atómica en modo de contacto como técnica rápida para la observación morfológica y el análisis del daño celular bacteriano

Resumen

Aquí, presentamos la aplicación de la microscopía de fuerza atómica (AFM) como un método simple y rápido para la caracterización bacteriana y analizamos detalles como el tamaño y la forma bacteriana, las biopelículas de cultivo bacteriano y la actividad de las nanopartículas como bactericidas.

Resumen

La microscopía electrónica es una de las herramientas necesarias para caracterizar las estructuras celulares. Sin embargo, el procedimiento es complicado y costoso debido a la preparación de la muestra para la observación. La microscopía de fuerza atómica (AFM) es una técnica de caracterización muy útil debido a su alta resolución en tres dimensiones y debido a la ausencia de cualquier requisito de vacío y conductividad de la muestra. AFM puede obtener imágenes de una amplia variedad de muestras con diferentes topografías y diferentes tipos de materiales.

AFM proporciona información topográfica 3D de alta resolución desde el nivel angstrom hasta la escala de micras. A diferencia de la microscopía tradicional, AFM utiliza una sonda para generar una imagen de la topografía de la superficie de una muestra. En este protocolo, se sugiere el uso de este tipo de microscopía para la caracterización morfológica y de daños celulares de bacterias fijadas en un soporte. Se utilizaron cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) y Pseudomonas hunanensis (aislada de muestras de bulbo de ajo). En este trabajo, las células bacterianas se cultivaron en medios de cultivo específicos. Para observar el daño celular, Staphylococcus aureus y Escherichia coli se incubaron con diferentes concentraciones de nanopartículas (NP).

Se fijó una gota de suspensión bacteriana en un soporte de vidrio, y se tomaron imágenes con AFM a diferentes escalas. Las imágenes obtenidas mostraron las características morfológicas de las bacterias. Además, empleando AFM, fue posible observar el daño a la estructura celular causado por el efecto de las NPs. A partir de las imágenes obtenidas, la AFM de contacto se puede utilizar para caracterizar la morfología de las células bacterianas fijadas en un soporte. AFM también es una herramienta adecuada para la investigación de los efectos de las NP en las bacterias. En comparación con la microscopía electrónica, AFM es una técnica económica y fácil de usar.

Introducción

Diferentes formas bacterianas fueron observadas por primera vez por Antony van Leeuwenhoek en el siglo 17¹. Las bacterias han existido en una gran diversidad de formas desde la antigüedad, que van desde esferas hasta células ramificadas². La forma celular es una condición fundamental para que los taxónomos bacterianos describan y clasifiquen cada especie bacteriana, principalmente para la separación morfológica de filos grampositivos y gramnegativos³. Se sabe que varios elementos determinan las formas celulares bacterianas, todos los cuales están involucrados en las cubiertas y el soporte celular como componentes de la pared celular y la membrana, así como en el citoesqueleto. De esta manera, los científicos todavía están dilucidando los mecanismos y procesos químicos, bioquímicos y físicos implicados en la determinación de las formas celulares bacterianas, todos los cuales están definidos por grupos de genes que definen las formas bacterianas ^2,4.

Además, los científicos han demostrado que la forma de bastón es probablemente la forma ancestral de las células bacterianas, ya que esta forma de célula parece óptima en parámetros significativos para las células. Por lo tanto, los cocos, la espiral, el vibrio, las formas filamentosas y otras se consideran adaptaciones a diversos entornos; De hecho, morfologías particulares han evolucionado independientemente varias veces, lo que sugiere que las formas de las bacterias podrían ser adaptaciones a ambientes particulares ^3,5. Sin embargo, a lo largo del ciclo de vida de la célula bacteriana, la forma de la célula cambia, y esto también ocurre como una respuesta genética a condiciones ambientales dañinas³. La forma y el tamaño de la célula bacteriana determinan fuertemente la rigidez, robustez y relación superficie-volumen de las bacterias, y esta característica puede ser explotada para procesos biotecnológicos⁶.

La microscopía electrónica se utiliza para estudiar muestras biológicas debido al alto aumento que se puede alcanzar más allá de los microscopios basados en la luz. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) y la microscopía electrónica de barrido (SEM) son las técnicas más utilizadas para este propósito; Sin embargo, las muestras requieren algunos tratamientos antes de ser colocadas en la cámara del microscopio con el fin de obtener imágenes apropiadas. Se requiere una cubierta de oro en las muestras, y el tiempo utilizado para la adquisición total de imágenes no debe ser demasiado largo. Por el contrario, la microscopía de fuerza atómica (AFM) es una técnica ampliamente utilizada en el análisis de superficies, pero también se emplea en el estudio de muestras biológicas.

Existen varios tipos de modos AFM utilizados en el análisis de superficies, como el modo de contacto, el modo sin contacto o roscado, la microscopía de fuerza magnética (MFM), la AFM conductiva, la microscopía de fuerza piezoeléctrica (PFM), el roscado de fuerza máxima (PFT), la resonancia de contacto y el volumen de fuerza. Cada modo se utiliza en el análisis de materiales y proporciona información diferente sobre la superficie de los materiales y sus propiedades mecánicas y físicas. Sin embargo, algunos modos AFM se utilizan para el análisis de muestras biológicas in vitro, como PFT, porque PFT permite obtener datos topográficos y mecánicos sobre células en un medio líquido⁷.

En este trabajo, utilizamos el modo más básico incluido en cada modelo AFM antiguo y simple: el modo de contacto. AFM utiliza una sonda nítida (alrededor de <50 nm de diámetro) para escanear áreas de menos de 100 μm. La sonda se alinea con la muestra para interactuar con los campos de fuerza asociados con la muestra. La superficie se escanea con la sonda para mantener la fuerza constante. Luego, se genera una imagen de la superficie monitoreando el movimiento del voladizo a medida que se mueve a través de la superficie. La información recopilada proporciona las propiedades nanomecánicas de la superficie, como la adhesión, la elasticidad, la viscosidad y el cizallamiento.

En el modo de contacto AFM, el voladizo se escanea a través de la muestra con una desviación fija. Esto permite determinar la altura de las muestras (Z), y esto representa una ventaja sobre las otras técnicas de microscopio electrónico. El software AFM permite la generación de un escaneo de imagen 3D por la interacción entre la punta y la superficie de la muestra, y la desviación de la punta se correlaciona con la altura de la muestra a través de un láser y un detector.

En modo estático (modo de contacto) con fuerza constante, la salida presenta dos imágenes diferentes: la altura (topografía z) y la señal de deflexión o error. El modo estático es un modo de imagen valioso y simple, especialmente para muestras robustas en el aire que pueden manejar las altas cargas y las fuerzas de torsión ejercidas por el modo estático. El modo de deflexión o error se opera en modo de fuerza constante. Sin embargo, la imagen de la topografía se mejora aún más al agregar la señal de desviación a la estructura de la superficie. En este modo, la señal de deflexión también se conoce como señal de error, ya que la desviación es el parámetro de retroalimentación; Cualquier característica o morfología que aparezca en este canal se debe al "error" en el bucle de retroalimentación o, más bien, debido al bucle de retroalimentación requerido para mantener un punto de ajuste de deflexión constante.

El diseño único de AFM lo hace compacto, lo suficientemente pequeño como para caber en una mesa, al tiempo que tiene una resolución lo suficientemente alta como para resolver los pasos atómicos. El equipo AFM tiene un costo menor que el equipo para otros microscopios electrónicos, y los costos de mantenimiento son mínimos. El microscopio no requiere un laboratorio con condiciones especiales como una sala limpia o un espacio aislado; Solo necesita un escritorio libre de vibraciones. Para AFM, las muestras no necesitan someterse a una preparación elaborada como para otras técnicas (cubierta de oro, adelgazamiento); Solo se debe adjuntar una muestra seca al portamuestras.

Utilizamos el modo de contacto AFM para observar las morfologías bacterianas y los efectos de las NP. Se puede observar la población y la morfología celular de las bacterias fijadas en un soporte, así como el daño celular producido por las nanopartículas sobre las especies bacterianas. Las imágenes obtenidas por el modo de contacto AFM confirman que es una herramienta poderosa y no está limitada por reactivos y procedimientos complicados, por lo que es un método simple, rápido y económico para la caracterización bacteriana.

Protocolo

1. Aislamiento e identificación bacteriana

1. Aislamiento de una cepa endófita de los meristemos del bulbo de ajo:
   1. Coloque fragmentos de 2 mm de meristemos de bulbos de ajo previamente pelados, desinfectados y cortados en agar de soja tripticasa (TSA) como un medio de crecimiento rico, e incubar a 25 ° C durante 1 día.
   2. Basándose en las diferencias morfológicas de las colonias bacterianas (forma, tamaño, color, borde, luz transmitida, luz reflejada, textura, consistencia y producción de pigmento), describa los diferentes morfotipos observados y purifique mediante rayas cruzadas una colonia representativa de cada morfotipo.
   3. Conservar todas las cepas bacterianas purificadas en glicerol al 30% a -80 °C.
   4. Identificar una cepa seleccionada al azar (9AP) secuenciando el ADNr 16S. Extraer el ADN siguiendo el método de Hoffman y Winston⁸.
   5. Amplificar el ARNr 16S mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con 100 ng de ADN, 1x tampón polimerasa, 4 mM MgCl₂, 0,4 mM dNTPs, 10 pmol cada uno de oligonucleótidos universales 27F/1492r y 1 U de ADN polimerasa⁹. Utilice las siguientes condiciones del termociclador: 95 °C durante 5 min para la desnaturalización inicial; seguido de 35 ciclos de 1 min a 94 °C como temperatura de desnaturalización, 1 min a 56 °C como temperatura de hibridación y 1 min a 72 °C como temperatura de extensión; y luego 10 min a 72 °C como extensión final.
   6. Secuencia capilar del producto de PCR utilizando los mismos oligonucleótidos; Utilice el método didesoxi-terminal con el kit de instalación de matriz para secuenciación capilar¹⁰, y realice electroforesis en un sistema multicapilar automatizado¹¹.
   7. Edite manualmente las secuencias, compare la secuencia con la biblioteca GenBank usando una búsqueda BLAST e identifique tentativamente la cepa con el estándar de oro de al menos 98.7% de identidad con la especie más cercana^12,13.
      NOTA: La cepa 9AP fue identificada como perteneciente a la especie de Pseudomonas hunanensis, con una identidad del 99,86% con la secuencia para la cepa P. hunanensis LV (JX545210).

2. Preparación de muestras bacterianas para observación morfológica por AFM

1. En condiciones estériles, coloque una gota de la suspensión bacteriana (Pseudomonas hunanensis, Staphylococcus aureus) en un portaobjetos de vidrio.
2. Fijar las muestras en el portaobjetos mediante calentamiento en seco. Pase el portaobjetos suavemente sobre una llama varias veces hasta que la muestra esté seca.
   NOTA: La fijación de muestras es una técnica rutinaria en microbiología para observar organismos procariotas fijos y simular su estructura como células vivas lo más cerca posible.
3. Coloque las muestras fijas en una placa de Petri y llévelas al equipo AFM para su observación.
   NOTA: Como las muestras pueden verse alteradas por las condiciones climáticas a lo largo del tiempo, reserve un tiempo máximo de 24 h para el análisis en el equipo AFM. Mantenga las muestras libres de polvo.

3. Efecto antibacteriano de las nanopartículas de MgO contra las bacterias

NOTA: La síntesis y caracterización de NPs de MgO han sido publicadas previamente¹⁴. En este trabajo, la actividad antibacteriana de los nanomateriales fue estimada con base en el manual del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) utilizando métodos de macrodilución y microdilución para la inhibición^15,16.

1. Estimación de la actividad inhibitoria mínima (CMI) y bactericidas (CMB)
   1. Precrecimiento de las cepas
      1. Inocular una cantidad apropiada de Escherichia coli o Staphylococcus aureus en caldo nutritivo para obtener una concentración final de 1 × 10⁸ UFC/ml.
      2. Incubar la suspensión a 37 °C (± 2 °C) durante 18-24 h.
   2. Postcrecimiento de cepas aclimatadas
      1. Sumerja un bucle bacteriológico estéril en la suspensión, tocando el fondo del tubo.
      2. Realice rayas con el bucle en eosina y agar azul de metileno y agar nutriente.
      3. Incubar las placas de agar a 37 °C (± 2 °C) durante 24 h.
   3. Selección de colonias para la preparación del inóculo estandarizado.
      1. Tome de tres a cinco colonias con el mismo tipo morfológico tocando la parte superior de la colonia en la placa de Petri con un bucle bacteriológico.
      2. Transfiera y sumerja la selección en 3-5 ml de caldo Müller-Hinton.
      3. Incubar a 37 °C (± 2 °C) para lograr una turbidez de 1 × 10 8 UFC/ml o 2 × 10⁸ UFC/ml.
         NOTA: En este trabajo se utilizaron estándares de turbidez de McFarland como referencia para las suspensiones bacteriológicas; específicamente, el estándar 0.5 corresponde aproximadamente a una suspensión homogénea de E. coli de 1.5 × 10⁸ células/mL. Se utilizó un espectrofotómetro UV-Vis para medir la turbidez.
      4. Tome 1 ml y agréguelo a 9 ml de caldo estéril. Tomar 200 μL de esta dilución, y añadirlo a 19,8 ml de caldo estéril para obtener una concentración final de 5 × 10⁵ UFC/ml.
   4. Concentraciones requeridas de nanopartículas de MgO
      1. Utilice un ultrasonido para la preparación de las soluciones.
      2. Suspender el nanomaterial en agua estéril al doble de la concentración requerida para obtener soluciones seriadas.
      3. Agregue estas suspensiones a tubos estériles que contengan caldo Müller-Hinton para lograr el nuevo rango de concentraciones requeridas para el experimento.
         NOTA: Se aplicaron las siguientes concentraciones de MgO NPs para la microdilución: 30 ppm, 60 ppm, 120 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1,000 ppm, 2,000 ppm, 3,000 ppm, 4,000 ppm y 8,000 ppm.
   5. Preparación de la microdilución¹⁵
      1. Prepare una placa de microtitulación de 96 pocillos nueva y estéril (microplaca). Etiqueta columna Nº 12 de la microplaca como columna de esterilidad; etiqueta la columna Nº 11 como columna de control de crecimiento.
      2. Añadir 120 μL de las suspensiones de nanopartículas con las diferentes concentraciones a las columnas Nº 1-10.
      3. Inocular 120 μL de bacterias (5 × 10⁵ UFC/ml) en los pocillos de las columnas Nº 1-10.
         NOTA: Para este estudio, la fila G y la fila H fueron controles con ceftriaxona a concentraciones sugeridas por los estándares CLSI: 8 ppm, 4 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0.5 ppm, 0.25 ppm, 0.125 ppm, 0.06 ppm y 0.03 ppm.
      4. Incubar la microplaca de 96 pocillos durante 24 h a 37 °C (35 °C ± 2 °C). Finalmente, analice los pozos.
2. Observación de los cambios morfoestructurales inducidos por nanopartículas de MgO en las cepas bacterianas por AFM
   1. Tomar 250 μL de los pocillos de las pruebas de microdilución, mezclar con 750 μL de agua estéril y centrifugar a 2.000 × g de 2 min a 5 min a 5 °C.
   2. Lave los precipitados tres veces con 1 ml de agua estéril cada vez, y al final de los lavados, agrégueles 500 μL de agua.
   3. Para obtener las imágenes AFM, tomar 10-20 μL de la suspensión final de cada pozo de arranque, realizar un frotis en un portaobjetos previamente limpiado por ultrasonido (30 min), y secar a temperatura ambiente durante 1 h.

4. Mediciones de AFM

NOTA: Aquí, el microscopio de fuerza atómica en modo de contacto se montó en una estación de trabajo antivibración que permitió el aislamiento del microscopio de cualquier fuente vibratoria mecánica y mantuvo el sistema nivelado. La interferencia eléctrica disminuye con filtros de línea y protección contra sobretensiones. El AFM utilizado aquí alinea automáticamente el rayo láser con el fotodetector.

1. Encienda el ordenador y el AFM y, a continuación, seleccione el modo Contacto, las sondas contAI-G y las opciones Pendiente automática en las herramientas de software. Los valores predeterminados del controlador Z son Setpoint = 20 nM, P-Gain = 10,000, I-Gain = 1,000, D-Gain = 0 y Tip voltage = 0 mV.
2. Coloque las muestras en el modo de contacto AFM utilizando un cabezal de rango de escaneo de 70 μm. Utilizamos voladizos de silicio ContAI-G con una constante de resorte de 0.13 N/m.
3. Utilice un dispositivo de cámara montado en dos lentes integradas en el cabezal de escaneo para obtener una vista rápida de la superficie del área debajo de la sonda.
4. Realice manualmente un desplazamiento en el plano XY para elegir el área deseada. La sonda se hace para acercarse electrónicamente a la muestra de superficie hasta que se alcanzan las condiciones de contacto. Ajuste electrónicamente el plano de medición XY del escáner y la superficie de la muestra reduciendo las pendientes en las direcciones XY.
5. Utilice los parámetros estándar del software: 1 línea por segundo a 256 puntos por línea.
6. Primero, realice un rango de escaneo completo de un área de 70 μm x 70 μm; A continuación, seleccione un área más pequeña con la herramienta Zoom. El AFM optimiza el rango del gráfico en Z automáticamente.
   NOTA: Al disminuir las líneas por segundo, el tiempo total de escaneo aumenta, la calidad del escaneo está más definida y también se elimina algo de ruido de la medición.
7. Para seleccionar una nueva área de la muestra, retraiga el voladizo electrónicamente y mueva la muestra a lo largo del plano XY. Realice un nuevo análisis mediante el procedimiento descrito en los pasos 4.5 y 4.6.
   NOTA: Los escaneos obtenidos se muestran en una escala de barras de un solo color, en la que los colores claros están asociados con altitudes más altas y los colores oscuros están asociados con altitudes más profundas. El software AFM genera una vista 3D del escaneo que permite la apreciación de los detalles de la superficie medida.
8. Realice el procesamiento de datos utilizando la nivelación línea por línea en el menú Herramientas de la imagen en la selección de filtro, que es el método de nivelación más utilizado y simple.
   NOTA: Este método de nivelación toma cada línea horizontal o vertical producida en la imagen AFM y la ajusta a una ecuación polinómica.
9. Optimice la altura máxima y mínima en la barra de color de la derecha para obtener la mejor resolución de imagen.
10. Realice el análisis de imagen mediante el menú Análisis de la barra de herramientas. Determine las alturas y distancias seleccionando los puntos inicial y final una vez seleccionada la herramienta deseada.
    NOTA: Los usuarios deben probar los diferentes filtros del menú Herramientas para evitar artefactos de imagen de punta debido al acoplamiento utilizado en el proceso de nivelación. Los artefactos de imagen aparecen como líneas de raya y se muestran en algunas de las imágenes de AFM.

Resultados

Las imágenes de la morfología y el tamaño de las cepas de S. aureus y P. hunanensis , así como la organización poblacional de ambas cepas, se tomaron mediante microscopía de fuerza atómica en modo de contacto. Las imágenes de S. aureus mostraron que su población estaba distribuida por zonas con agregados de cocos (Figura 1A). Con un aumento en la escala, hubo una mayor apreciación de la distribución poblacional y la morfología de los cocos (

Discusión

La microscopía es una técnica comúnmente utilizada en laboratorios biológicos que permite la investigación de la estructura, tamaño, morfología y disposición celular de muestras biológicas. Para mejorar esta técnica, se pueden utilizar varios tipos de microscopios que difieren entre sí en cuanto a sus características ópticas o electrónicas, que determinan la potencia de resolución del instrumento.

En la investigación científica, se requiere el uso de microscopía para la carac...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM EasyScan 2	NanoSurf	discontinued	Measurement Media
bacteriological loop	No aplica	not applicable	instrument for bacterial inoculation
BigDye Terminator v3.1	ThermoFisher Scientific	4337455	Matrix installation kit
Bioedit	not applicable	version 7.2.5	Sequence alignment editor
Cary 60 spectrometer	Agilent Technologies	not applicable
ceftriazone	Merck	not applicable	antibiotic
centrifuge	eppendorf	not applicable	to remove particles that interfere with AFM
ContAI-G Silicon cantilever	BudgetSensors	ContAl-G-10	Measurement Media
eosin and methylene blue agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC 25922	bacterial strain
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8295	PCR of 16S rRNA gene
microplate	Thermo Scientific	10558295	for microdilution analysis
Müller-Hinton broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutrient agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutritious broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Petri dishes	not applicable	not applicable	growth of bacteria
Pseudomonas hunanensis 9AP	not applicable	not applicable	isolated from the garlic bulb by CNRG
Sanger sequencing	Macrogen	not applicable	sequencing service
ScienceDesk Anti-Vibration workstation	ThorLabs
slides	not applicable	not applicable	glass holder for bacterial sample analysis
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection	ATCC 25923	bacterial strain
Thermalcycler	Applied Biosystems	Veriti-4375786	PCR amplification
Trypticasein soy agar	BD	BA-256665	growth media
ultrasonicator	Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC	not applicable	for mixing the nanoparticle dilutions