접촉 모드 형태학적 관찰 및 박테리아 세포 손상 분석을 위한 신속한 기술로서의 원자력 현미경

요약

여기에서는 박테리아 특성 분석을 위한 간단하고 빠른 방법으로 원자력 현미경(AFM)의 적용을 제시하고 박테리아 크기 및 모양, 박테리아 배양 생물막, 살균제로서의 나노 입자의 활성과 같은 세부 사항을 분석합니다.

초록

전자 현미경은 세포 구조를 특성화하는 데 필요한 도구 중 하나입니다. 그러나 관찰을 위한 샘플 준비로 인해 절차가 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 원자력 현미경(AFM)은 3차원의 고분해능과 진공 및 시료 전도도에 대한 요구 사항이 없기 때문에 매우 유용한 특성화 기술입니다. AFM은 다양한 지형과 다양한 유형의 재료를 가진 다양한 샘플을 이미지화할 수 있습니다.

AFM은 옹스트롬 수준에서 미크론 수준까지 고해상도 3D 지형 정보를 제공합니다. 기존의 현미경과 달리 AFM은 프로브를 사용하여 샘플의 표면 지형 이미지를 생성합니다. 이 프로토콜에서는 지지체에 고정된 박테리아의 형태학적 및 세포 손상 특성 분석을 위해 이러한 유형의 현미경 사용을 제안합니다. 황색포도상구균(Staphylococcus aureus , ATCC 25923), 대장균( Escherichia coli , ATCC 25922) 및 슈도모나스 후나넨시스(Pseudomonas hunanensis )(마늘 구근 샘플에서 분리)의 균주를 사용하였다. 이 연구에서 박테리아 세포는 특정 배양 배지에서 성장했습니다. 세포 손상을 관찰하기 위해 황색포도상구 균과 대장균 을 서로 다른 농도의 나노입자(NP)와 함께 배양했습니다.

박테리아 현탁액 한 방울을 유리 지지대에 고정하고 AFM으로 이미지를 다른 스케일로 촬영했습니다. 얻어진 이미지는 박테리아의 형태 학적 특성을 보여 주었다. 또한, AFM을 채용하여, NPs의 효과에 의해 야기된 세포 구조의 손상을 관찰할 수 있었다. 얻어진 이미지를 기초로, 접촉 AFM은 지지체에 고정된 박테리아 세포의 형태를 특성화하는 데 사용될 수 있다. AFM은 또한 NP가 박테리아에 미치는 영향을 조사하는 데 적합한 도구입니다. 전자 현미경에 비해 AFM은 저렴하고 사용하기 쉬운 기술입니다.

서문

다른 박테리아 모양은 17 세기 Antony van Leeuwenhoek에 의해 처음 발견되었습니다¹. 박테리아는 고대부터 구체에서 분지 세포에 이르기까지 매우 다양한 형태로 존재해 왔다². 세포 모양은 박테리아 분류학자들이 각 박테리아 종을 기술하고 분류하기 위한 기본 조건으로, 주로 그람 양성 문과 그람 음성 문³의 형태학적 분리를 위한 것입니다. 박테리아 세포 형태를 결정하는 몇 가지 요소가 알려져 있으며, 이들 모두는 세포 골격뿐만 아니라 세포벽과 막의 구성 요소로서 세포 덮개 및 지지체에 관여합니다. 이런 식으로 과학자들은 박테리아 세포 형태를 결정하는 데 관련된 화학적, 생화학적, 물리적 메커니즘과 과정을 여전히 해명하고 있으며, 이 모든 것은 박테리아 모양을 정의하는 유전자 클러스터에 의해 정의됩니다 ^2,4.

또한 과학자들은 막대 모양이 박테리아 세포의 조상 형태일 가능성이 있음을 보여주었는데, 이는 이 세포 모양이 세포에 중요한 매개변수에서 최적으로 나타나기 때문입니다. 따라서 cocci, 나선형, vibrio, 필라멘트 및 기타 형태는 다양한 환경에 대한 적응으로 간주됩니다. 실제로, 특정 형태학은 여러 번 독립적으로 진화했으며, 이는 박테리아의 모양이 특정 환경에 적응할 수 있음을 시사합니다 ^3,5. 그러나 박테리아 세포 수명 주기 동안 세포 모양이 변하며, 이는 또한 유해한 환경 조건에 대한 유전적 반응으로 발생합니다³. 박테리아 세포의 모양과 크기는 박테리아의 강성, 견고성 및 표면 대 부피 비율을 강력하게 결정하며, 이러한 특성은 생명공학 공정에 이용될 수 있다⁶.

전자 현미경은 광학 기반 현미경을 넘어 도달할 수 있는 고배율로 인해 생물학적 샘플을 연구하는 데 사용됩니다. 투과 전자 현미경 (TEM)과 주사 전자 현미경 (SEM)은 이러한 목적으로 가장 일반적으로 사용되는 기술입니다. 그러나 샘플은 적절한 이미지를 얻기 위해 현미경 챔버에 넣기 전에 몇 가지 처리가 필요합니다. 샘플에 금색 덮개가 필요하며 전체 이미지 획득에 사용되는 시간이 너무 길어서는 안 됩니다. 대조적으로, 원자력 현미경 (AFM)은 표면 분석에 널리 사용되는 기술이지만 생물학적 샘플 연구에도 사용됩니다.

표면 분석에 사용되는 AFM 모드에는 접촉 모드, 비접촉 모드 또는 태핑, 자력 현미경(MFM), 전도성 AFM, 압전 현미경(PFM), 피크 힘 태핑(PFT), 접촉 공진 및 힘 볼륨과 같은 여러 유형이 있습니다. 각 모드는 재료 분석에 사용되며 재료 표면과 기계적 및 물리적 특성에 대한 다양한 정보를 제공합니다. 그러나, 일부 AFM 모드는 PFT와 같은 시험관내 생물학적 샘플의 분석에 사용되는데, 이는 PFT가 액체 배지(⁷)에서 세포에 대한 지형 및 기계적 데이터를 얻을 수 있게 해주기 때문이다.

이 작업에서는 모든 오래되고 단순한 AFM 모델에 포함된 가장 기본적인 모드인 접촉 모드를 사용했습니다. AFM은 날카로운 프로브(직경 약 <50nm)를 사용하여 100μm 미만의 영역을 스캔합니다. 프로브는 샘플과 관련된 힘장과 상호 작용하기 위해 샘플에 정렬됩니다. 표면을 프로브로 스캔하여 힘을 일정하게 유지합니다. 그런 다음 캔틸레버가 표면을 가로질러 이동할 때 캔틸레버의 움직임을 모니터링하여 표면 이미지가 생성됩니다. 수집된 정보는 접착력, 탄성, 점도 및 전단과 같은 표면의 나노 기계적 특성을 제공합니다.

AFM 접촉 모드에서는 캔틸레버가 고정된 편향으로 샘플 전체에서 스캔됩니다. 이를 통해 샘플(Z)의 높이를 결정할 수 있으며 이는 다른 전자 현미경 기술에 비해 이점을 나타냅니다. AFM 소프트웨어를 사용하면 팁과 샘플 표면 간의 상호 작용을 통해 3D 이미지 스캔을 생성할 수 있으며, 팁 편향은 레이저와 검출기를 통해 샘플 높이와 상관관계가 있습니다.

일정한 힘을 가진 정적 모드(접촉 모드)에서 출력은 높이(z 지형)와 편향 또는 오류 신호라는 두 가지 다른 이미지를 제공합니다. 정적 모드는 특히 정적 모드에서 가해지는 높은 하중과 비틀림을 처리할 수 있는 공기 중의 견고한 샘플에 유용하고 간단한 이미징 모드입니다. 처짐 또는 오류 모드는 일정한 힘 모드에서 작동됩니다. 그러나 지형 이미지는 표면 구조에 편향 신호를 추가하여 더욱 향상됩니다. 이 모드에서 편향 신호는 편향이 피드백 매개변수이기 때문에 오류 신호라고도 합니다. 이 채널에 나타나는 모든 기능 또는 형태는 피드백 루프의 "오류" 때문이거나 일정한 편향 설정값을 유지하는 데 필요한 피드백 루프 때문입니다.

AFM의 독특한 디자인은 탁상에 들어갈 만큼 충분히 작으면서도 원자 단계를 해결할 수 있을 만큼 충분히 높은 해상도를 제공합니다. AFM 장비는 다른 전자 현미경 장비보다 비용이 저렴하고 유지 보수 비용이 최소화됩니다. 현미경은 클린룸이나 격리된 공간과 같은 특별한 조건의 실험실이 필요하지 않습니다. 진동이 없는 책상만 있으면 됩니다. AFM의 경우 샘플은 다른 기술(골드 커버, 슬리밍)과 같이 정교한 준비를 거칠 필요가 없습니다. 건조한 샘플만 샘플 홀더에 부착해야 합니다.

우리는 AFM 접촉 모드를 사용하여 박테리아 형태와 NP의 효과를 관찰합니다. 지지체에 고정된 박테리아의 개체군과 세포 형태뿐만 아니라 박테리아 종에 대한 나노입자에 의해 생성된 세포 손상을 관찰할 수 있습니다. AFM 접촉 모드로 얻은 이미지는 강력한 도구이며 시약 및 복잡한 절차에 의해 제한되지 않아 박테리아 특성 분석을 위한 간단하고 빠르며 경제적인 방법임을 확인합니다.

프로토콜

1. 박테리아 분리 및 식별

1. 마늘 구근 분열 조직으로부터 endophytic 균주의 분리 :
   1. 이전에 껍질을 벗기고 소독하고 자른 마늘 구근의 분열조직 조각 2mm를 풍부한 성장 배지인 트립티카제 대두 한천(TSA)에 놓고 25°C에서 1일 동안 배양합니다.
   2. 박테리아 군집의 형태학적 차이(모양, 크기, 색상, 가장자리, 투과광, 반사광, 질감, 일관성 및 색소 생성)를 기반으로 관찰된 다양한 형태형을 설명하고 각 형태형의 대표적인 군체를 교차 줄무늬로 만들어 정제합니다.
   3. 정제된 모든 박테리아 균주를 -80°C에서 30% 글리세롤에 보존합니다.
   4. 16S rDNA를 시퀀싱하여 무작위로 선택된 균주(9AP)를 식별합니다. Hoffman과 Winston⁸의 방법에 따라 DNA를 추출합니다.
   5. 100ng의 DNA, 1x 중합효소 완충액, 4mM_MgCl2, 0.4mM dNTP, 27F/1492r 범용 올리고뉴클레오티드 각각 10pmol, DNA 중합효소⁹ 1U로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 16S rRNA를 증폭합니다. 다음과 같은 열 순환기 조건을 사용하십시오: 초기 탈자연화를 위해 5분 동안 95°C; 이어서 탈자연화 온도로서 94°C에서 1분, 하이브리드화 온도로서 56°C에서 1분, 및 연장 온도로서 72°C에서 1분의 35 사이클; 그런 다음 최종 연장으로 72°C에서 10분 동안 수행합니다.
   6. 모세관-서열 PCR 산물은 동일한 올리고뉴클레오티드를 사용하는 단계; 모세관 시퀀싱을 위한 매트릭스 설치 키트(¹⁰)와 함께 디데옥시 말단 방법을 사용하고 자동화된 다모세관 시스템⁽¹¹)에서 전기영동을 수행합니다.
   7. 서열을 수동으로 편집하고, BLAST 검색을 사용하여 서열을 GenBank 라이브러리와 비교하고, 가장 가까운 종^12,13과 적어도 98.7% 동일성의 금 표준으로 균주를 잠정적으로 식별한다.
      참고: 균주 9AP는 P. hunanensis LV(JX545210) 균주에 대한 서열과 99.86%의 동일성을 가진 Pseudomonas hunanensis 종에 속하는 것으로 확인되었습니다.

2. AFM에 의한 형태학적 관찰을 위한 박테리아 시료 준비

1. 무균 상태에서 박테리아 현탁액 (Pseudomonas hunanensis, Staphylococcus aureus) 을 유리 슬라이드에 떨어 뜨립니다.
2. 건식 가열로 슬라이드에 샘플을 고정합니다. 샘플이 마를 때까지 슬라이드를 화염 위에 여러 번 부드럽게 통과시킵니다.
   참고: 샘플 고정은 고정된 원핵 생물을 관찰하고 살아있는 세포로서의 구조를 가능한 한 가깝게 시뮬레이션하기 위한 미생물학의 일상적인 기술입니다.
3. 고정된 샘플을 페트리 접시에 넣고 AFM 장비로 가져가 관찰합니다.
   알림: s에서amp시간이 지남에 따라 기상 조건에 따라 변경될 수 있으므로 AFM 장비에서 분석하기 위해 최대 24시간을 따로 두십시오. 샘플에 먼지가 없도록 하십시오.

3. 박테리아에 대한 MgO 나노 입자의 항균 효과

참고: MgO NP의 합성 및 특성화는 이전에^{발표되었습니다 14}. 이 연구에서, 나노 물질의 항균 활성은 억제를 위해 매크로 희석 및 미세 희석 방법을 사용하는 CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) 매뉴얼에 기초하여 추정되었다^15,16.

1. 최소 억제 활성(MIC) 및 살균제(CMB) 추정
   1. 균주의 사전 성장
      1. 적절한 양의 대장 균 또는 황색포도상구균 을 영양가 있는 국물에 접종하여 1 ×^{10 8} CFU/mL의 최종 농도를 얻습니다.
      2. 현탁액을 37°C(± 2°C)에서 18-24시간 동안 배양합니다.
   2. 순응 균주의 사후 성장
      1. 멸균 된 세균 루프를 현탁액에 담그고 튜브 바닥에 닿습니다.
      2. 에오신 및 메틸렌 블루 한천 및 영양 한천에 루프로 줄무늬를 수행하십시오.
      3. 한천 플레이트를 37°C(± 2°C)에서 24시간 동안 배양합니다.
   3. 표준화된 접종물 준비를 위한 집락 선택
      1. 세균 학적 루프가있는 페트리 접시의 식민지 상단을 만져서 동일한 형태 학적 유형을 가진 3-5 개의 식민지를 채취하십시오.
      2. 선택 항목을 옮기고 3-5mL의 Müller-Hinton 국물에 담그십시오.
      3. 37°C(± 2°C)에서 배양하여 1 ×^{10 8} CFU/mL 또는 2 × 10^{8 CFU} /mL의 탁도를 달성합니다.
         참고: 이 작업에서 McFarland 탁도 표준은 세균학적 현탁액에 대한 참조로 사용되었습니다. 구체적으로, 0.5 표준물질은 대략 1.5 ×^{10 8} cells/mL의 균질한 대장균 현탁액에 해당합니다. UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 탁도를 측정했습니다.
      4. 1mL를 취해 멸균 국물 9mL에 넣는다. 이 희석액 200μL를 취하여 멸균 브로스 19.8mL에 넣어 5 ×^{10 5} CFU/mL의 최종 농도를 얻습니다.
   4. MgO 나노 입자의 필요한 농도
      1. 용액 준비를 위해 초음파 를 사용하십시오.
      2. 나노 물질을 멸균 된 물에 현탁 시키면 일련의 용액을 얻는 데 필요한 농도의 두 배가 될 수 있습니다.
      3. 이 현탁액을 Müller-Hinton 브로스가 들어 있는 멸균 튜브에 추가하여 실험에 필요한 새로운 농도 범위를 달성하십시오.
         참고: 미세희석을 위해 다음 MgO NP 농도를 적용했습니다: 30ppm, 60ppm, 120ppm, 250ppm, 500ppm, 1,000ppm, 2,000ppm, 3,000ppm, 4,000ppm 및 8,000ppm.
   5. 미세희석액¹⁵의 제조
      1. 새로운 멸균 96-웰 마이크로타이터 플레이트(microplate)를 준비한다. 멸균 컬럼으로서 마이크로플레이트의 라벨 컬럼 No. 12; 11번 열을 성장 제어 열로 표시합니다.
      2. 농도가 다른 나노 입자 현탁액 120 μL를 컬럼 번호 1-10에 추가합니다.
      3. 120μL의 박테리아(5 × 10^{5 CFU} /mL)를 컬럼 1-10의 웰에 접종합니다.
         참고: 이 연구를 위해 행 G와 행 H는 CLSI 표준에서 제안한 농도(8ppm, 4ppm, 2ppm, 1ppm, 0.5ppm, 0.25ppm, 0.125ppm, 0.06ppm 및 0.03ppm)에서 세프트리악손을 사용한 대조군이었습니다.
      4. 96-웰 마이크로플레이트를 37°C(35°C ± 2°C)에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 마지막으로 우물을 분석합니다.
2. AFM에 의한 박테리아 균주의 MgO 나노입자 유도 형태 구조 변화 관찰
   1. 미세 희석 테스트의 웰에서 250 μL를 취하여 750 μL의 멸균수와 혼합하고 5 ° C에서 2 분에서 5 분까지 2,000 × g에서 원심 분리합니다.
   2. 침전물을 매번 1mL의 멸균수로 3회 세척하고, 세척이 끝나면 500μL의 물을 첨가한다.
   3. AFM 이미지를 얻으려면 각 시작 웰의 최종 현탁액 10-20 μL을 취하고, 이전에 초음파 (30 분)로 세척 한 슬라이드에 도말을 수행하고, 실온에서 1 시간 동안 건조시킵니다.

4. AFM 측정

참고: 여기에서 접촉 모드의 원자력 현미경은 진동 방지 워크스테이션에 장착되어 기계적 진동 소스로부터 현미경을 분리하고 시스템을 수평으로 유지했습니다. 라인 필터와 서지 보호로 전기적 간섭이 줄어듭니다. 여기에 사용된 AFM은 레이저 빔을 광검출기에 자동 정렬합니다.

1. 컴퓨터와 AFM을 켠 다음 소프트웨어 도구에서 접촉 모드, contAI-G 프로브 및 자동 구배 옵션을 선택합니다. Z-컨트롤러의 기본값은 Setpoint = 20nM, P-Gain = 10,000, I-Gain = 1,000, D-Gain = 0, Tip voltage = 0mV입니다.
2. 70μm 스캔 범위 헤드를 사용하여 샘플을 AFM 접촉 모드로 배치합니다. 스프링 상수가 0.13N/m인 ContAI-G 실리콘 캔틸레버를 사용했습니다.
3. 스캔 헤드에 통합된 두 개의 렌즈에 장착된 카메라 장치를 사용하여 프로브 아래 영역의 표면을 빠르게 볼 수 있습니다.
4. 원하는 영역을 선택하기 위해 XY 평면에서 수동으로 변위를 수행합니다. 프로브는 접촉 조건에 도달할 때까지 표면 샘플에 전자적으로 접근하도록 만들어집니다. XY 방향의 기울기를 줄여 스캐너와 샘플 표면의 XY 측정 평면을 전자적으로 조정합니다.
5. 소프트웨어의 표준 매개 변수 사용 : 라인 당 256 포인트에서 초당 1 라인.
6. 먼저 70 μm x 70 μm 영역의 전체 스캔 범위를 수행합니다. 그런 다음 확대/축소 도구를 사용하여 더 작은 영역을 선택합니다. AFM은 Z의 차트 범위를 자동으로 최적화합니다.
   참고: 초당 라인 수를 줄이면 총 스캔 시간이 증가하고 스캔 품질이 더 명확해지며 측정으로 인한 일부 노이즈도 제거됩니다.
7. 샘플에서 새 영역을 선택하려면 캔틸레버를 전자적으로 집어넣고 XY 평면을 따라 샘플을 이동합니다. 4.5단계와 4.6단계에 설명된 절차를 사용하여 새 스캔을 실현합니다.
   참고: 얻은 스캔은 단색 막대 눈금으로 표시되며, 밝은 색상은 더 높은 고도와 연관되고 어두운 색상은 더 깊은 고도와 연관됩니다. AFM 소프트웨어는 측정된 표면의 세부 사항을 감상할 수 있는 스캔의 3D 보기를 생성합니다.
8. 필터 선택에서 이미지의 도구 메뉴에 있는 한 줄씩 평준화를 사용하여 데이터 처리를 수행하는데, 이는 가장 많이 사용되고 가장 간단한 평준화 방법입니다.
   참고: 이 레벨링 방법은 AFM 이미지에서 생성된 모든 수평선 또는 수직선을 가져와서 다항식 방정식에 맞춥니다.
9. 최상의 이미지 해상도를 얻기 위해 오른쪽의 색상 막대에서 최대 및 최소 높이를 최적화합니다.
10. 도구 모음의 분석(Analysis ) 메뉴를 사용하여 이미지 분석을 수행합니다. 원하는 도구를 선택한 후 초기 점과 최종 점을 선택하여 높이와 거리를 결정합니다.
    참고: 사용자는 레벨링 프로세스에 사용되는 병합으로 인한 팁 이미지 아티팩트를 방지하기 위해 도구 메뉴의 다른 필터를 시도해야 합니다. 이미지 아티팩트는 줄무늬 선으로 나타나며 일부 AFM 이미지에 표시됩니다.

결과

S. 아우레우스(S. aureus)와 P. 후나넨시스(P. hunanensis) 균주의 형태와 크기, 그리고 두 균주의 개체군 조직의 이미지는 접촉 모드에서 원자력 현미경으로 촬영되었습니다. S. aureus 이미지는 개체군이 구균 응집체가있는 구역별로 분포되어 있음을 보여주었습니다 (그림 1A). 규모가 커짐에 따라 cocci의 개체군 분포와 형태에 대한 인식이 높아졌습니다(

토론

현미경은 생물학적 샘플의 구조, 크기, 형태 및 세포 배열을 조사할 수 있는 생물학적 실험실에서 일반적으로 사용되는 기술입니다. 이 기술을 개선하기 위해 기기의 해상도를 결정하는 광학 또는 전자적 특성 측면에서 서로 다른 여러 유형의 현미경을 사용할 수 있습니다.

과학 연구에서 박테리아 세포의 특성화를 위해서는 현미경 사용이 필요합니다. 예를 들어, 현미경 검?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM EasyScan 2	NanoSurf	discontinued	Measurement Media
bacteriological loop	No aplica	not applicable	instrument for bacterial inoculation
BigDye Terminator v3.1	ThermoFisher Scientific	4337455	Matrix installation kit
Bioedit	not applicable	version 7.2.5	Sequence alignment editor
Cary 60 spectrometer	Agilent Technologies	not applicable
ceftriazone	Merck	not applicable	antibiotic
centrifuge	eppendorf	not applicable	to remove particles that interfere with AFM
ContAI-G Silicon cantilever	BudgetSensors	ContAl-G-10	Measurement Media
eosin and methylene blue agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC 25922	bacterial strain
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8295	PCR of 16S rRNA gene
microplate	Thermo Scientific	10558295	for microdilution analysis
Müller-Hinton broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutrient agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutritious broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Petri dishes	not applicable	not applicable	growth of bacteria
Pseudomonas hunanensis 9AP	not applicable	not applicable	isolated from the garlic bulb by CNRG
Sanger sequencing	Macrogen	not applicable	sequencing service
ScienceDesk Anti-Vibration workstation	ThorLabs
slides	not applicable	not applicable	glass holder for bacterial sample analysis
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection	ATCC 25923	bacterial strain
Thermalcycler	Applied Biosystems	Veriti-4375786	PCR amplification
Trypticasein soy agar	BD	BA-256665	growth media
ultrasonicator	Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC	not applicable	for mixing the nanoparticle dilutions