八紫布参胶囊对去卵巢大鼠的雌激素样作用

摘要

这里介绍的方案表明 Bazi Bushen 胶囊 （BZBS） 可以通过其雌激素样作用调节去卵巢啮齿动物模型中的 RANKL/OPG 信号通路。

摘要

本研究旨在显示中草药化合物八紫紫参胶囊 （BZBS） 在去卵巢小鼠中的雌激素样作用。将雌性 Sprague-Dawley （SD） 大鼠随机分为 6 组:假手术组、模型组 （OVX）、progynova 组和 BZBS 组 （1、2 和 4 d/kg/d）。对除假手术组外的所有大鼠进行卵巢切除术。BZBS 治疗 4 个月后进行显微计算机断层扫描 （micro-CT） 扫描、苏木精和伊红 （H&E） 染色、免疫组化和酶联免疫吸附测定 （ELISA） 检测。结果，与 OVX 组相比，BZBS 治疗的大鼠骨小梁和骨髓细胞的数量和面积增加，脂肪细胞的数量减少。用药组右胫骨骨体积、小梁数量、小梁厚度增加，小梁间隙减小。用药组 17β-雌二醇和血清钙水平升高，但血清磷、硬化素、 β-CTX 和 TRACP-5b 水平降低。在药物治疗组中，RANKL 和硬化素水平降低，而骨保护素 （OPG） 水平升高。总之，该方案采用多种技术系统评价了中草药化合物在去卵巢大鼠中的治疗效果和潜在的分子机制。

引言

绝经后骨质疏松症 （PMOP） 是一种由卵巢功能不足、雌激素减少和破骨细胞活性增强引起的骨骼系统疾病¹，其特征是骨量低、骨组织微结构变性和骨小梁损伤。PMOP 容易导致骨折，并对患者的生活质量产生严重影响。骨质疏松症影响着全世界约 2 亿人²;大约 40% 的绝经后妇女患有骨质疏松症 3,33% 的 PMOP⁴ 患者发生骨折。当骨吸收超过骨形成时，雌激素的减少可能导致破骨细胞活性相对增强⁵ 和骨量下降。因此，破骨细胞活化通常被认为是骨质流失的标志⁶。在生理学上，RANKL/OPG 通过调节破骨细胞活化促进骨吸收，成为涉及骨重塑的重要途径⁷。同时，雌激素还可以通过调节 RANKL/OPG 信号传导来介导破骨细胞的形成和功能⁸。

近年来，传统医学越来越多地用于治疗不同的疾病，不良反应较少，预后较好 ^9,10。八字不参肾胶囊 （BZBS） 是一种中药，可能是预防和治疗 PMOP 的替代方法。它由 Cuscuta、Fructus lycii、Fructus schisandrae、Fructus cnidii、Fructus rosae laevigatae（切罗基玫瑰果实）、覆盆子、Semen Allii Tuberosi、Toosendan 果子、淫秽草本、巴戟天、肉苁蓉、地黄、药用 cyathula 根、人参、Pilose 鹿茸和海马凯洛吉组成（表 1），含有 11 种具有激素样作用的植物雌激素。先前的一项研究证实，BZBS 可以通过雌激素样作用¹¹ 延缓动脉粥样硬化斑块的形成，这类似于用雌激素¹² 治疗骨质疏松症。然而，BZBS 预防和治疗雌激素缺乏引起的骨质疏松症的潜在机制尚不清楚。因此，本研究旨在验证 BZBS 是否对卵巢切除术诱导的大鼠骨质疏松症具有骨保护作用^13,14。

研究方案

动物实验经河北夷陵医学研究院动物研究与伦理委员会批准（批准文号:N2020150）。将 36 只 Sprague-Dawley （SD） 雌性大鼠 （3 个月大，体重 180-200 g） （见 材料表） 在河北夷陵医学研究院新药评价中心用正常食物和清水喂养，并在温度受控 （20-26 °C） 和相对湿度 （40%-70%） 的房间内每天暴露于人造光 12 h。

1. 动物实验

1. 将大鼠随机分为6组，假手术组（SHAM组，10 mL/kg/d盐水）、模型组（OVX组，10 mL/kg/d盐水）、progynova¹⁵ 组（0.2 mg/kg/d）、BZBS低剂量组（BZBSL组，1 g/kg/d）、中剂量BZBS组（BZBSM组，2 g/kg/d）和高剂量BZBS组（BZBSH组， 4 克/千克/天）。
   注:BZBSM组的剂量由人类推荐剂量确定，计算如下:大鼠等效实验剂量（mg / kg / d）=人剂量（mg / kg）/体重（60 kg）x 6.3。
2. 在整个手术过程中分别使用 3% 和 1.5% 异氟醚诱导和维持大鼠麻醉。
   注意:如果大鼠不眨眼且没有踏板反射，则确认麻醉深度并分别进行大鼠麻醉的维持。
3. 用无菌剃须刀去除大鼠腹部的皮毛，并使用替代乙醇和聚维酮碘用无菌棉球消毒大鼠腹部皮肤 3 次。麻醉后局部注射 1.5 mg/kg 布比卡因进行局部镇痛。
   注意:消毒方法采用以切口为中心并从中心向外开始的圆形图案。
4. 在 SHAM 组中，用无菌手术刀在大鼠腹部做一个 2 cm 的中线切口，并使用 4-0 手术缝合线缝合中线切口。
   注意:首先，用可吸收缝合线缝合内部肌肉层，然后用单丝缝合外部/皮肤闭合。第 10 天，用剪刀剪开单丝，用镊子提取单丝。
5. 对于其他组中的大鼠，使用无菌镊子分离并暴露完整的卵巢，并使用 4-0 手术缝合线在卵巢根部结扎。使用无菌手术剪刀去除完整的卵巢。使用 4-0 手术缝合线缝合中线切口。
   注意:将所有术后大鼠隔离在 37 °C 容器中，直到大鼠清醒并能够自由移动。
6. 在胃内施用指定药物 4 个月后（在步骤 1.1 中），首先用 3% 异氟醚麻醉大鼠，用脱毛膏去除大鼠背部的皮毛，然后用乙醇和聚维酮碘 3x 用无菌棉球消毒腹股沟和整个下肢的皮肤。
   注意:该药物每天用 10 cm 不锈钢管饲针给药一次。根据大鼠的体重每周调整灌胃剂量。
7. 使用无菌手术剪刀和镊子切开并剥落腹股沟皮肤，露出股动脉。使用真空采血管从股动脉采集血样，然后用无菌棉球施加压力以止血。对过量吸入二氧化碳的大鼠实施安乐死。
8. 使用无菌手术剪刀和镊子继续切割和剥落腹股沟和下肢的皮肤，露出完整的胫骨。去除胫骨后，用无菌生理盐水清洗 3 次，然后继续用镊子和眼科剪刀在生理盐水中去除多余的肌肉组织。
9. 使用乙醇和聚维酮碘 3 次用无菌棉球对腰椎 L4 的背部皮肤进行消毒。使用无菌手术剪刀和镊子剪开背部皮肤，露出腰椎 L4。
10. 用咬合器切断腰椎 L4 的上下椎骨，并用无菌手术剪刀切断腰椎 L4 周围的骶骨。用生理盐水清洗离体的腰部 L4 3 次，然后继续用镊子和微型剪刀在生理盐水中去除多余的肌肉组织。
11. 将胫骨和 L4 椎骨在室温下储存在 10% 福尔马林组织液中（参见 材料表）3 天。
12. 将尸体装在一个特殊的尸体袋中，然后放入动物尸体储物柜中。

2. 显微 CT 成像¹⁶

1. 按下绿色电源按钮打开显微 CT 扫描仪（参见 材料表）并启动软件以加热 X 射线源。
   注意:为避免 X 射线散射，请在开始之前将任何金属物体移动到成像区域附近。在步骤 1.11 中对大鼠胫骨组织进行 micro-CT 检查，且 X 射线照射不足会影响结果。在显微 CT 扫描期间，骨骼应保持湿润。热身时应将动物床取出。确保将钥匙转到 CT 仪器前左下角 SAFETY KEY 上的 ON 位置。
2. 通过单击 新 数据库来构建数据库以保存数据以下一步获取。
3. 在软件控制窗口中设置数据采集参数，如下所示:X 射线管电压 （50 kV）;CT X 射线管电流 （100 μA）;实时 X 射线管电流 （100 μA）;视野 （FOV） （18 毫米）;无设门技术;扫描技术（高分辨率 4 分钟）。
4. 用生理盐水清洗胫骨 3 次，并用滤纸吸干多余的水。用塑料薄膜将胫骨组织包裹在床上以固定其位置。通过旋转仪器中的按钮，将胫骨组织调整到成像场的中心。
5. 关闭仪器门并打开 实时 模式。按下 捕获 按钮以查看胫骨组织。
6. 单击 CT 扫描 按钮开始扫描。单击 Yes 生成图像。
   注:打开 X 射线后，仪器顶部的橙色灯将亮起，并且为了作员的安全，滑动门不会打开。扫描完成后，2D Viewer 软件中会出现一个新窗口，显示重建的横轴、冠状面和矢状面。单击 Paste to the drawing board 以保存。
7. 将胫骨从动物床中取出。打开 Analyze 12.0 软件，然后单击 File > Load > Process 导入物镜 CT 图像。单击 Image Calculator...（图像计算器... ）和 Region Pad （区域填充） 选项以显示 SubRegion （子区域 ） 对话框。
   1. 单击 Interactive 选项，然后选择 2 mm 厚度区域中的骨骼。单击 Apply 以选择 Change a Copy of the Loaded Volume。在 Analyze 12.0 屏幕中，单击 Apps 选项以选择 BMA。
   2. 单击 Segment Cortex 和 Segment Trabeculae，然后单击 Save Final Object Map。点击 测量骨 ，显示具体参数指标的值，包括骨密度（BMD，g/cm³）、骨体积分数（骨组织体积/组织体积[BV/TV]，%）、骨小梁数量（Tb.N，1/mm）、骨小梁厚度（TB.Th，μm）和骨小梁分离度（Tb.Sp，μm）。
      注意:未对 L4 椎骨进行显微 CT。

3. 苏木精和伊红 （H&E） 染色

1. 在步骤 1.11 中取出大鼠的胫骨和 L4 椎骨样本，并将其储存在 20% 甲酸溶液中进行 4 天的脱钙。
   注:20% 甲酸溶液是通过混合 2,400 mL 甲醛溶液和 600 mL 甲酸溶液制备的。
2. 将步骤 3.1 中处理的大鼠胫骨和 L4 椎骨样本放入包埋盒中，用流水洗涤 6 小时以上。
3. 使用自动组织处理器用梯度浓度醇溶液（60% 乙醇 1 小时，70% 乙醇 1 小时，90% 乙醇 1 小时，95% 乙醇 2 小时和 100% 乙醇 2 小时）脱水样品。
4. 将组织标本置于二甲苯中 2 小时，使其半透明。脱水结束时，将透化样品置于 60 °C 的石蜡中 3 小时，并将它们嵌入自动处理器中。
5. 使用旋转切片机获得 4 μm 切片。将切片置于苏木精染色中 3-8 分钟，用伊红染色 1-3 分钟。
6. 将染色切片分别转移到纯酒精和二甲苯中。用中性胶密封并固定染色切片，以便在光学显微镜下进行病理检查。
7. 用载玻片扫描仪（参见 材料表）以 40 倍放大倍率扫描切片，并使用观察软件获取整个胫骨和 L4 椎骨的 H&E 染色结果。

4. 免疫组化

1. 使用步骤 3.5 中获得的 4 μm 胫骨切片进行热诱导表位修复。将适当的抗原修复缓冲液（柠檬酸缓冲液，pH = 6.0）添加到可微波容器中。将包装页放入可微波的容器中，然后将容器放入微波炉中。将程序设置为在 98 °C 下保持抗原修复 20 分钟。
2. 取出容器，用冷自来水冲洗内部 10 分钟。用过氧化氢 （3% H₂O₂） 阻断内源性过氧化物酶活性（参见 材料表），然后在室温下孵育切片 15 分钟。
3. 在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中洗涤切片 3 次（参见 材料表），每次 5 分钟。
4. 将切片放入正常的山羊血清封闭溶液中（参见 材料表），然后将样品在室温下在潮湿室中孵育 15 分钟。
5. 将 200 μL RANKL 抗体 （1:200）（见 材料表）、OPG 抗体 （1:300）（见 材料表）和硬化蛋白抗体¹⁷ （1:200）（见 材料表）加入切片样品中，并在 4 °C 下避光孵育一晚。
   注意:硬化素是骨骼生长的负调节剂。它是一种分泌型糖蛋白，具有 C 端半胱氨酸结样结构域，与骨形态发生蛋白拮抗剂的 DAN 家族具有序列相似性¹⁷。这种蛋白质不是 RANKL 通路的成员。
6. 将生物素标记的山羊抗兔 IgG（参见 材料表）加入切片中，并在室温下孵育 30 分钟。用 PBS 冲洗切片，并使用二氨基联苯胺 （DAB）（参见 材料表）在室温下对切片染色 3-5 分钟。
7. 用苏木精染色切片 1-2 分钟。脱水并干燥切片后，用中性胶密封。
8. 使用载玻片扫描仪以 40 倍放大倍率扫描切片（参见 材料表），并使用自动显微镜成像系统捕获数字图像（参见 材料表）。
9. 打开 Imagepro Plus 软件（参见 材料表）。
   1. 单击 File （文件 ） 导入分析图像。单击 Measure > Calibration > Intensity Calibration ） 进行光密度校正。单击 Measure， IOD， Count/Size， 和 Select Colors 选项，逐个显示 Segmentation 界面。
   2. 单击 基于直方图 选项以选择 HIS ，然后单击 加载文件.单击 Count 以生成 IOD 值和 Area 值。

5. 酶联免疫吸附测定 （ELISA） 实验方案

1. 确保用于检测 17β-雌二醇的 ELISA 试剂盒包括抗 17β-雌二醇 IgG 包被的微孔板（12 x 8 孔）、15 mL 终止液、22 mL 17β-雌二醇-HRP 偶联物、15 mL 3,3'，5,5' 四甲基联苯胺 （TMB） 底物溶液、50 mL 10x 洗涤液、盖箔、条带支架、17β-雌二醇对照和不同浓度梯度的 17β-雌二醇标准品（参见 材料表）。
2. 从冰箱中取出 17β-雌二醇试剂盒，并将所有试剂置于室温 （18-25 °C） 下。
3. 试剂制备:用去离子水稀释 10 倍洗涤液，制备 1 倍洗涤液。将 50 mL 10x 洗涤液与 450 mL 去离子水混合，制成 500 mL 1x 洗涤液。
4. 从冰箱中取出血清样品，并在室温下解冻。
5. 从板框上取下多余的微量滴定条，将它们放回装有干燥剂包的铝箔袋中，重新密封，并在 4 °C 下储存。
6. 向各自的孔中加入 25 μL 对照、标准品或样品。然后，向每个孔中加入 200 μL 17β-雌二醇-HRP 偶联物。
7. 用箔纸覆盖所有孔，并将板在 37 °C 下孵育 2 小时。
8. 从每个孔中取出箔纸和液体，并用 300 μL 的 1x 洗涤液洗涤孔 3 次。
   注意:避免反应孔溢出。此外，每个洗涤周期之间的浸泡时间应为 >5 秒。最后，在下一步之前敲击薄纸条，小心地去除剩余的液体。
9. 向每个孔中加入 100 μL TMB 底物溶液，并在室温下避光孵育 30 分钟。
10. 向每个孔中加入 100 μL 终止液，轻轻摇动微量滴定板 30 秒。在 30 分钟内测量样品在 450 nm 处的吸光度。
11. 绘制标准品相对于浓度的平均吸光度。通过绘制的点绘制最佳拟合曲线。
12. 通过在标准曲线上插入样品的值，获得以 pg/mL 表示的相应浓度值。
    注:根据制造商的说明，检测血清 Ca²⁺、磷、SOST、TRACP-5b 和 β-CTX 的其他方案与 17β-雌二醇测量相同。

6. 统计分析

1. 数据以平均值±标准差表示。通过单因素方差分析和 Tukey 检验进行多重比较。 p < 0.05 被认为具有统计学意义。

结果

通过显微 CT 扫描评估胫骨的骨微结构
用 BZBS 治疗去卵巢大鼠可显著降低 OVX 诱导的小梁结构改变。如右胫骨重建的显微 CT 图像（图 1A、B）所示，OVX 组的骨小梁显示 BMD（图 1C）、BV/TV（图 1D）、Tb.Th（图 1E）、Tb.N（图 1F）和 Tb.Sp 增...

讨论

卵巢切除术后，由于松质骨的持续减少和骨转换增加，雌激素水平急剧下降。从本质上讲，绝经后雌激素分泌减少会导致严重的骨质流失¹⁸，导致卵巢切除大鼠的 Ca²⁺ 丢失^19,20。据报道，服用雌激素可以帮助卵巢切除大鼠的干骺端骨折恢复，雌激素替代疗法也可用于维持骨量和预防绝经后妇女的骨质疏?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Proteintech Group, Inc.	23408-1AP-100
17-Beta-Estradiol ELISA kits	Proteintech Group, Inc.	21933-1-AP
3%H2O2	ShanDong LIRCON Medical Technology Incorporated Company	20221027
Anti-osteoprotegerin antibody	Abcam	ab203061
Bazibushen capsules	Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co. Ltd.	XB2103001
Biotin goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab207995
Calcium assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C004-2-1
Diaminobenzidine	ZSGB-BIO	ZLI-9018
Estradiol valerate tablets	Bayer AG	156A
Gene 1580R centrifuge	GENE Co. Ltd.	GZ422515090077
Image-Pro Plus	Media Cybernetics	IPP 6.0
Leica DM6000B Microscope (fully automated upright microscope system)	Leica	361715
Normal Goat Serum Blocking Solution	Vector Laboratories	S-1000-20
Phosphate assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C006-1-1
Phosphate buffered saline	Servicebio, Wuhan, China	CR10201M
Quantum GX2 microCT Imaging System	PerkinElmer	CLS149276
RANKL rabbit polyclonal antibody	Elabscience Biotechnology Co. Ltd.	E-EL-R3032-96T
Rat SOST (Sclerostin) ELISA kit	Elabscience Biotechnology Co. Ltd.	E-EL-R1405c-96T
Rat TRACP-5b (Tartrate Resistant Acid Phosphatase 5b) ELISA kit	Abcam	ab108667
Rat β-CTx (Beta Crosslaps) ELISA kit	Elabscience Biotechnology Co., Ltd.	E-EL-R0939c-96T
Sclerostin rabbit polyclonal antibody	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	SCXK(JING)2016-0006
Slide scanner	Hamamatsu Photonics K.K.	Nano Zoomer-SQ
Sprague Dawley female rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	ZLI-9381