Effetto estrogeno-simile della capsula di Bazi Bushen nei ratti ovariectomizzati

Riepilogo

Qui viene presentato un protocollo per dimostrare che la capsula di Bazi Bushen (BZBS) può regolare la via di segnalazione RANKL/OPG nel modello di roditore ovariectomizzato attraverso il suo effetto estrogeno-simile.

Abstract

Questo studio mira a mostrare l'effetto estrogeno-simile della capsula di Bazi Bushen (BZBS), un composto erboristico cinese, nei topi ovariectomizzati. Le femmine di ratto Sprague-Dawley (SD) sono state divise casualmente in sei gruppi: un gruppo operato da sham, un gruppo modello (OVX), un gruppo progynova e gruppi BZBS (1, 2 e 4 d/kg/d). Un'ovariectomia è stata eseguita su tutti i ratti ad eccezione di quelli del gruppo operato con sham. La tomografia micro-computerizzata (micro-CT), la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E), l'immunoistochimica e il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) sono stati eseguiti dopo 4 mesi di trattamento con BZBS. Di conseguenza, rispetto al gruppo OVX, i ratti trattati con BZBS hanno mostrato un aumento del numero e dell'area delle cellule trabecolari dell'osso e del midollo osseo e una diminuzione del numero di cellule adipose. Il volume osseo, il numero trabecolare e lo spessore trabecolare della tibia destra nei gruppi di farmaci sono aumentati e lo spazio trabecolare è diminuito. I livelli sierici di 17β-estradiolo e calcio nei gruppi farmacologici erano elevati, ma i livelli sierici di fosforo, sclerostina, β-CTX e TRACP-5b erano diminuiti. Nei gruppi farmacologici, i livelli di RANKL e sclerostina sono diminuiti, mentre il livello di osteoprotegerina (OPG) è aumentato. In conclusione, questo protocollo ha valutato sistematicamente gli effetti terapeutici e i potenziali meccanismi molecolari dei composti erboristici cinesi nei ratti ovariectomizzati con una varietà di tecniche.

Introduzione

L'osteoporosi postmenopausale (PMOP) è una malattia del sistema scheletrico causata da una funzione ovarica inadeguata, da una diminuzione degli estrogeni e da una maggiore attività degli osteoclasti¹, caratterizzata da bassa massa ossea, degenerazione microarchitettonica del tessuto osseo e danno della trabecola ossea. La PMOP è incline a causare fratture e può avere gravi effetti sulla qualità della vita dei pazienti. L'osteoporosi colpisce circa 200 milioni di persone in tutto il mondo²; circa il 40% delle donne in postmenopausa soffre di osteoporosi³ e le fratture si verificano nel 33% dei pazienti con PMOP⁴. La riduzione degli estrogeni potrebbe portare a un aumento dell'attività degli osteoclasti⁵ e a una diminuzione della massa ossea quando il riassorbimento osseo supera la formazione ossea. Pertanto, l'attivazione degli osteoclasti è solitamente considerata un segno di perdita ossea⁶. Fisiologicamente, RANKL/OPG funge da importante via che coinvolge il rimodellamento osseo regolando l'attivazione degli osteoclasti per promuovere il riassorbimento osseo⁷. Nel frattempo, gli estrogeni possono anche mediare la formazione e la funzione degli osteoclasti regolando la segnalazione RANKL/OPG⁸.

Negli ultimi anni, la medicina tradizionale è stata sempre più utilizzata per trattare diverse malattie con meno reazioni avverse e una prognosi migliore ^9,10. La capsula di Bazi Bushen (BZBS), una medicina tradizionale cinese, potrebbe essere un approccio alternativo per prevenire e curare la PMOP. È composto da Cuscuta, Fructus lycii, Fructus schisandrae, Fructus cnidii, Fructus rosae laevigatae (frutto della rosa Cherokee), Lampone, Semen Allii Tuberosi, Toosendan fructus, Herba epimedii, Morinda officinalis, Herba cistanches, Rehmannia glutinosa, Radice di cyathula medicinale, Ginseng, Pilose cornler e Hippocampus Kelloggi (Tabella 1), contenente 11 tipi di fitoestrogeni con effetti simili agli ormoni. Uno studio precedente ha confermato che la BZBS può ritardare la formazione della placca ateromatosa attraverso un effetto estrogeno-simile¹¹, che è simile al trattamento dell'osteoporosi con estrogeni¹². Tuttavia, i meccanismi alla base della BZBS nella prevenzione e nel trattamento dell'osteoporosi causata dalla carenza di estrogeni non sono chiari. Pertanto, il presente studio mirava a verificare se la BZBS avesse un effetto protettivo osseo sull'osteoporosi di ratto indotta da ovariectomia^13,14.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la Ricerca e l'Etica Animale dell'Istituto di Ricerca Medica Hebei Yiling (numero di approvazione: N2020150). Le 36 femmine di ratto Sprague-Dawley (SD) (3 mesi, del peso di 180-200 g) (vedi Tabella dei materiali) sono state alimentate con cibo normale e acqua pulita nel nuovo centro di valutazione dei farmaci dell'Hebei Yiling Medical Research Institute e sono state esposte alla luce artificiale per 12 ore al giorno in ambienti con temperature controllate (20-26 °C) e umidità relativa (40%-70%).

1. Esperimento sugli animali

1. Dividere i ratti in sei gruppi in modo casuale, un gruppo operato con sham (gruppo SHAM, 10 ml/kg/d soluzione fisiologica), un gruppo modello (gruppo OVX, 10 ml/kg/d soluzione fisiologica), un gruppo progynova¹⁵ (0,2 mg/kg/d), un gruppo BZBS a basso dosaggio (gruppo BZBSL, 1 g/kg/d), un gruppo BZBS a dosaggio medio (gruppo BZBSM, 2 g/kg/d) e un gruppo BZBS ad alto dosaggio (gruppo BZBSH, 4 g/kg/giorno).
   NOTA: La dose del gruppo BZBSM è stata determinata dai dosaggi raccomandati per l'uomo e calcolata come segue: dose sperimentale equivalente per i ratti (mg/kg/die) = dose nell'uomo (mg/kg)/peso corporeo (60 kg) x 6,3.
2. Impiegare isoflurano al 3% e all'1,5% per l'induzione e il mantenimento dell'anestesia del ratto durante l'operazione, rispettivamente.
   NOTA: Se i ratti non sbattono le palpebre e il riflesso del pedale è assente, viene confermata la profondità dell'anestesia e viene condotto il mantenimento dell'anestesia del ratto, rispettivamente.
3. Rimuovere il pelo dell'addome del ratto con un rasoio sterile e disinfettare la pelle dell'addome del ratto usando cicli alternativi di etanolo e iodio povidone 3 volte con un batuffolo di cotone sterile. Applicare l'analgesia locale con un'iniezione topica di 1,5 mg/kg di bupivacaina dopo l'anestesia.
   NOTA: Il metodo di disinfezione adotta uno schema circolare centrato attorno all'incisione e partendo dal centro verso l'esterno.
4. Eseguire un'incisione della linea mediana di 2 cm sull'addome del ratto con un bisturi sterile nel gruppo SHAM e suturare l'incisione della linea mediana utilizzando una sutura chirurgica 4-0.
   NOTA: In primo luogo, lo strato muscolare interno viene suturato con sutura riassorbibile e la chiusura esterna/cutanea viene suturata con monofilamento. Il 10° giorno, usa le forbici per aprire il monofilamento e usa le pinzette per estrarre il monofilamento.
5. Per i ratti degli altri gruppi, isolare ed esporre l'ovaio intatto utilizzando una pinza sterile e legare alla radice dell'ovaio utilizzando una sutura chirurgica 4-0. Rimuovere l'ovaio intatto utilizzando forbici chirurgiche sterili. Sutura l'incisione della linea mediana utilizzando una sutura chirurgica 4-0.
   NOTA: Tutti i ratti postoperatori sono stati posti in isolamento in contenitori a 37 °C fino a quando i ratti non sono stati svegli e in grado di muoversi liberamente.
6. Dopo 4 mesi di somministrazione intragastrica di farmaci designati (al punto 1.1), anestetizzare prima il ratto con isoflurano al 3%, utilizzare una crema depilatoria per rimuovere il pelo dalla parte posteriore del ratto, quindi disinfettare la pelle dell'inguine e dell'intero arto inferiore utilizzando etanolo e iodio povidone 3 volte con un batuffolo di cotone sterile.
   NOTA: Il farmaco è stato somministrato una volta al giorno con un ago da sonda gassata in acciaio inossidabile da 10 cm. La dose di sonda gastrica è stata aggiustata settimanalmente in base al peso dei ratti.
7. Tagliare e sbucciare la pelle dell'inguine per esporre l'arteria femorale utilizzando forbici e pinzette chirurgiche sterili. Raccogliere un campione di sangue dall'arteria femorale utilizzando una provetta per la raccolta del sangue sottovuoto e quindi applicare una pressione per fermare l'emorragia con un batuffolo di cotone sterile. Eutanasia nei ratti con eccessiva inalazione di anidride carbonica.
8. Continuare a tagliare e sbucciare la pelle dell'inguine e dell'arto inferiore per esporre la tibia intatta utilizzando forbici e pinzette chirurgiche sterili. Dopo aver rimosso la tibia, lavarla tre volte con soluzione fisiologica sterile e continuare a rimuovere il tessuto muscolare in eccesso in soluzione salina con una pinzetta e forbici oftalmiche.
9. Disinfettare la pelle posteriore della L4 lombare utilizzando etanolo e iodio povidone 3 volte con un batuffolo di cotone sterile. Utilizzare forbici e pinzette chirurgiche sterili per tagliare la pelle della schiena ed esporre l'L4 lombare.
10. Recidere le vertebre superiori e inferiori della L4 lombare con un rongeur e tagliare l'osso sacro attorno alla L4 lombare con forbici chirurgiche sterili. Lavare tre volte l'L4 lombare isolato con soluzione fisiologica e continuare a rimuovere il tessuto muscolare in eccesso con soluzione fisiologica con pinzette e micro forbici.
11. Conservare la tibia e la vertebra L4 in un fluido tissutale in formalina al 10% (vedi Tabella dei materiali) a temperatura ambiente per 3 giorni.
12. Imballa la carcassa in uno speciale sacchetto per cadaveri e mettila in un armadietto per la conservazione delle carcasse di animali.

2. Imaging micro-CT¹⁶

1. Premere il pulsante di accensione verde per accendere lo scanner micro-CT (vedere Tabella dei materiali) e avviare il software per riscaldare la sorgente di raggi X.
   NOTA: Per evitare la dispersione dei raggi X, spostare gli oggetti metallici vicino all'area di imaging prima di iniziare. L'esame micro-CT del tessuto tibiale di ratto nella fase 1.11 con irradiazione a raggi X insufficiente può influenzare i risultati. L'osso deve essere mantenuto umido durante la scansione micro-CT. La cuccia deve essere rimossa durante il riscaldamento. Assicurarsi che la chiave sia in posizione ON sulla CHIAVE DI SICUREZZA nell'angolo in basso a sinistra davanti allo strumento CT.
2. Crea un database facendo clic su uno nuovo per creare un file in cui salvare i dati da ottenere successivamente.
3. Impostare i parametri di acquisizione dati nella finestra di controllo del software come segue: tensione del tubo radiogeno (50 kV); corrente del tubo a raggi X CT (100 μA); corrente del tubo a raggi X in tempo reale (100 μA); campo visivo (FOV) (18 mm); nessuna tecnica di gating; Tecnica di scansione (alta risoluzione 4 min).
4. Lavare la tibia con soluzione fisiologica tre volte e asciugare l'acqua in eccesso con carta da filtro. Avvolgere il fazzoletto della tibia sul letto con una pellicola di plastica per fissarne la posizione. Regolare il tessuto tibiale al centro del campo di imaging ruotando il pulsante nello strumento.
5. Chiudere lo sportello dello strumento e attivare la modalità live . Premere il pulsante di acquisizione per visualizzare il tessuto tibiale.
6. Avviare la scansione facendo clic sul pulsante Scansione TC . Fare clic su Sì per produrre l'immagine.
   NOTA: Una volta attivata la radiografia, la luce arancione nella parte superiore dello strumento si accenderà e la porta scorrevole non si aprirà per la sicurezza dell'operatore. Al termine della scansione, nel software 2D Viewer viene visualizzata una nuova finestra che mostra l'asse trasversale, il piano coronale e il piano sagittale ricostruiti. Fare clic su Incolla nella tavola da disegno per salvare.
7. Togli la tibia dal letto dell'animale. Aprire il software Analyze 12.0 e importare l'immagine CT dell'obiettivo facendo clic su File > Carica > processo. Fare clic sulle opzioni Calcolatore immagini... e Riquadro regione per visualizzare la finestra di dialogo Sottoregione .
   1. Fare clic sull'opzione Interattivo e selezionare l'osso nell'area di spessore di 2 mm. Fare clic su Applica per selezionare Modifica una copia del volume caricato. Nella schermata Analizza 12.0 , fare clic sull'opzione App per selezionare BMA.
   2. Fare clic su Segmenta corteccia e Segmenta trabecole, quindi fare clic su Salva mappa oggetto finale. Fare clic su Misura osso per visualizzare il valore di indicatori di parametri specifici, tra cui la densità minerale ossea (BMD, g/cm³), la frazione di volume osseo (volume del tessuto osseo/volume del tessuto [BV/TV], %), il numero di trabecole ossee (Tb.N, 1/mm), lo spessore della trabecolare ossea (TB.Th, μm) e il grado di separazione trabecolare (Tb.Sp, μm).
      NOTA: La micro-TC non è stata eseguita con vertebre L4.

3. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E)

1. Prelevare i campioni di tibia e vertebra L4 del ratto al punto 1.11 e conservarli in una soluzione di acido formico al 20% per una decalcificazione di 4 giorni.
   NOTA: La soluzione di acido formico al 20% viene preparata mescolando 2.400 mL di soluzione di formaldeide e 600 mL di soluzione di acido formico.
2. Mettere il campione di tibia e vertebra L4 del ratto trattato dal passaggio 3.1 nella scatola di inclusione e lavarli con acqua corrente per più di 6 ore.
3. Disidratare i campioni con soluzioni alcoliche a concentrazione di gradiente (etanolo al 60% per 1 ora, etanolo al 70% per 1 ora, etanolo al 90% per 1 ora, etanolo al 95% per 2 ore ed etanolo al 100% per 2 ore) utilizzando un processatore di tessuti automatizzato.
4. Immergere i campioni di tessuto nello xilene per 2 ore per renderli traslucidi. Al termine della disidratazione, porre i campioni permeabilizzati in cera di paraffina a 60 °C per 3 ore e incorporarli in un processore automatico.
5. Ottenere le sezioni da 4 μm utilizzando un'affettatrice rotativa. Mettere le sezioni nella colorazione di ematossilina per 3-8 minuti e nella colorazione di eosina per 1-3 minuti.
6. Trasferire le sezioni colorate rispettivamente in alcool puro e xilene. Sigillare e fissare le sezioni colorate con gomma neutra per l'esame patologico al microscopio ottico.
7. Scansiona le fette con uno scanner per vetrini (vedi Tabella dei materiali) con un ingrandimento di 40x e utilizza il software di visualizzazione per acquisire i risultati della colorazione H&E dell'intera tibia e della vertebra L4.

4. Immunoistochimica

1. Eseguire il recupero dell'epitopo indotto dal calore utilizzando le sezioni di tibia da 4 μm ottenute nel passaggio 3.5. Aggiungere il tampone di riparazione dell'antigene appropriato (tampone di acido citrico, pH = 6,0) in un contenitore adatto al microonde. Metti il foglio di supporto nel contenitore per microonde e metti il contenitore nel forno a microonde. Impostare il programma in modo da mantenere la riparazione dell'antigene per 20 minuti a 98 °C.
2. Rimuovere il contenitore e sciacquare l'interno con acqua fredda del rubinetto per 10 minuti. Bloccare l'attività endogena della perossidasi con perossido di idrogeno (3% H₂O₂) (vedi Tabella dei materiali), quindi incubare la fetta per 15 minuti a temperatura ambiente.
3. Lavare le sezioni in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (vedi Tabella dei materiali) tre volte, 5 minuti ciascuna.
4. Immergere le sezioni in una normale soluzione bloccante di siero di capra (vedere la Tabella dei materiali), quindi incubare i campioni in una camera umida per 15 minuti a temperatura ambiente.
5. Aggiungere 200 μl di anticorpo RANKL (1:200) (vedere la Tabella dei materiali), l'anticorpo OPG (1:300) (vedere la Tabella dei materiali) e l'anticorpo della sclerostina¹⁷ (1:200) (vedere la Tabella dei materiali) nei campioni di fetta e incubare per una notte a 4 °C al buio.
   NOTA: La sclerostina è un regolatore negativo della crescita ossea. È una glicoproteina secreta con un dominio simile a un nodo di cisteina C-terminale e ha una sequenza simile alla famiglia DAN di antagonisti delle proteine morfogenetiche ossee¹⁷. Questa proteina non è un membro della via RANKL.
6. Aggiungere le IgG anti-coniglio di capra marcate con biotina (vedere la Tabella dei materiali) nelle sezioni e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Sciacquare le sezioni con PBS e utilizzare la diaminobenzidina (DAB) (vedi Tabella dei materiali) per macchiare le sezioni per 3-5 minuti a temperatura ambiente.
7. Colorare le sezioni con ematossilina per 1-2 minuti. Dopo aver disidratato e asciugato le sezioni, sigillarle con gomma neutra.
8. Scansiona le sezioni con un ingrandimento di 40x utilizzando uno scanner per vetrini (vedi Tabella dei materiali) e acquisisci immagini digitali utilizzando un sistema di imaging automatico al microscopio (vedi Tabella dei materiali).
9. Aprire il software Imagepro Plus (vedere la tabella dei materiali).
   1. Fare clic su File per importare l'immagine dell'analisi. Fare clic su Misura > Calibrazione > Calibrazione intensità per la correzione della densità ottica. Fare clic sulle opzioni Misura, IOD, Conteggio/Dimensione e Seleziona colori una per una per visualizzare l'interfaccia di segmentazione .
   2. Fare clic sull'opzione Basato su istogramma per selezionare HIS e fare clic su Carica file. Fare clic su Conteggio per generare il valore IOD e il valore dell'area .

5. Protocollo di saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)

1. Assicurarsi che il kit ELISA per la rilevazione del 17β-estradiolo includa la micropiastra rivestita di IgG anti-17β-estradiolo (12 x 8 pozzetti), 15 mL di soluzione di arresto, 22 mL di coniugato 17β-estradiolo-HRP, 15 mL di soluzione di substrato di tetrametilbenzidina (TMB) 3,3',5,5', 50 mL di soluzione di lavaggio 10x, fogli di copertura, un supporto per strisce, il controllo 17β-estradiolo e un diverso gradiente di concentrazione dello standard 17β-estradiolo (vedere la Tabella dei materiali).
2. Estrarre il kit 17β-estradiolo dal frigorifero e porre tutti i reagenti a temperatura ambiente (18-25 °C).
3. Preparazione del reagente: Diluire la soluzione di lavaggio 10x con acqua deionizzata per preparare una soluzione di lavaggio 1x. Mescolare 50 ml di soluzione di lavaggio 10x con 450 mL di acqua deionizzata per ottenere 500 mL di soluzione di lavaggio 1x.
4. Estrarre il campione di siero dal frigorifero e scongelarlo a temperatura ambiente.
5. Rimuovere le strisce di microtitolazione in eccesso dal telaio della piastra, riporle nel sacchetto di alluminio contenente la confezione essiccante, richiuderle e conservare a 4 °C.
6. Aggiungere 25 μl di controllo, standard o campione a ciascuno dei rispettivi pozzetti. Quindi, aggiungere 200 μl di coniugato 17β-estradiolo-HRP a ciascun pozzetto.
7. Coprire tutti i pozzetti con un foglio di alluminio e incubare la piastra a 37 °C per 2 ore.
8. Rimuovere la pellicola e il liquido da ogni pozzetto e lavare il pozzetto tre volte con 300 μl di soluzione di lavaggio 1x.
   NOTA: Evitare di traboccare dai pozzetti di reazione. Inoltre, il tempo di ammollo tra ogni ciclo di lavaggio dovrebbe essere di >5 s. Al termine, rimuovere con cura il liquido rimanente picchiettando le strisce di carta velina prima del passaggio successivo.
9. Aggiungere 100 μL di soluzione di substrato TMB a ciascun pozzetto e incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente.
10. Aggiungere 100 μl di soluzione di arresto a ciascun pozzetto e agitare delicatamente la piastra per microtitolazione per 30 s. Misurare l'assorbanza del campione a 450 nm entro 30 minuti.
11. Disegnare l'assorbanza media degli standard rispetto alla concentrazione. Tracciare la curva più adatta in base ai punti tracciati.
12. Ottenere i corrispondenti valori di concentrazione espressi in pg/mL interpolando i valori dei campioni sulla curva standard.
    NOTA: Gli altri protocolli per la rilevazione del Ca²⁺ sierico, del fosforo, del SOST, del TRACP-5b e del β-CTX sono gli stessi della misurazione del 17β-estradiolo, secondo le istruzioni del produttore.

6. Analisi statistica

1. I dati sono stati presentati come media ± deviazione standard. Confronti multipli sono stati eseguiti mediante ANOVA unidirezionale seguita dal test di Tukey. p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

La microstruttura ossea della tibia è stata valutata mediante micro-TC
Il trattamento di ratti ovariectomizzati con BZBS ha ridotto significativamente i cambiamenti strutturali trabecolari indotti da OVX. Come mostrato nelle immagini micro-CT ricostruite della tibia destra (Figura 1A, B), l'osso trabecolare nel gruppo OVX ha mostrato una diminuzione significativa di BMD (Figura 1C), BV/TV (<...

Discussione

Dopo l'ovariectomia, i livelli di estrogeni sono diminuiti bruscamente a causa della continua riduzione dell'osso spongioso e dell'aumento del turnover osseo. In sostanza, la diminuzione della secrezione di estrogeni dopo la menopausa potrebbe causare una significativa perdita ossea¹⁸, portando a una perdita di Ca²⁺ nei ratti ovariectomizzati^19,20. È stato riportato che l'assunzione di estrogen...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Proteintech Group, Inc.	23408-1AP-100
17-Beta-Estradiol ELISA kits	Proteintech Group, Inc.	21933-1-AP
3%H2O2	ShanDong LIRCON Medical Technology Incorporated Company	20221027
Anti-osteoprotegerin antibody	Abcam	ab203061
Bazibushen capsules	Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co. Ltd.	XB2103001
Biotin goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab207995
Calcium assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C004-2-1
Diaminobenzidine	ZSGB-BIO	ZLI-9018
Estradiol valerate tablets	Bayer AG	156A
Gene 1580R centrifuge	GENE Co. Ltd.	GZ422515090077
Image-Pro Plus	Media Cybernetics	IPP 6.0
Leica DM6000B Microscope (fully automated upright microscope system)	Leica	361715
Normal Goat Serum Blocking Solution	Vector Laboratories	S-1000-20
Phosphate assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C006-1-1
Phosphate buffered saline	Servicebio, Wuhan, China	CR10201M
Quantum GX2 microCT Imaging System	PerkinElmer	CLS149276
RANKL rabbit polyclonal antibody	Elabscience Biotechnology Co. Ltd.	E-EL-R3032-96T
Rat SOST (Sclerostin) ELISA kit	Elabscience Biotechnology Co. Ltd.	E-EL-R1405c-96T
Rat TRACP-5b (Tartrate Resistant Acid Phosphatase 5b) ELISA kit	Abcam	ab108667
Rat β-CTx (Beta Crosslaps) ELISA kit	Elabscience Biotechnology Co., Ltd.	E-EL-R0939c-96T
Sclerostin rabbit polyclonal antibody	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	SCXK(JING)2016-0006
Slide scanner	Hamamatsu Photonics K.K.	Nano Zoomer-SQ
Sprague Dawley female rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	ZLI-9381