Efecto similar al estrógeno de la cápsula de Bazi Bushen en ratas ovariectomizadas

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para demostrar que la cápsula de Bazi Bushen (BZBS) puede regular la vía de señalización RANKL/OPG en el modelo de roedor ovariectomizado a través de su efecto similar al estrógeno.

Resumen

Este estudio tiene como objetivo mostrar el efecto similar al estrógeno de la cápsula Bazi Bushen (BZBS), un compuesto herbal chino, en ratones ovariectomizados. Las ratas hembras Sprague-Dawley (SD) se dividieron aleatoriamente en seis grupos: un grupo operado simuladamente, un grupo modelo (OVX), un grupo progynova y grupos BZBS (1, 2 y 4 d/kg/d). Se realizó una ovariectomía en todas las ratas, excepto en las del grupo operado simuladamente. Se realizó microtomografía computarizada (micro-TC), tinción de hematoxilina y eosina (H&E), inmunohistoquímica y detección de inmunoabsorción enzimática (ELISA) después de 4 meses de tratamiento con BZBS. Como resultado, en comparación con el grupo OVX, las ratas tratadas con BZBS mostraron un mayor número y área de células óseas trabeculares y de médula ósea, y una disminución del número de células adiposas. El volumen óseo, el número trabecular y el grosor trabecular de la tibia derecha en los grupos de medicación aumentaron y el espacio trabecular disminuyó. Los niveles de 17β-estradiol y calcio sérico en los grupos de medicación estaban elevados, pero los niveles de fósforo sérico, esclerostina, β-CTX y TRACP-5b estaban disminuidos. En los grupos de medicación, los niveles de RANKL y esclerostina disminuyeron, mientras que el nivel de osteoprotegerina (OPG) aumentó. En conclusión, este protocolo evaluó sistemáticamente los efectos terapéuticos y los posibles mecanismos moleculares de los compuestos herbales chinos en ratas ovariectomizadas con una variedad de técnicas.

Introducción

La osteoporosis posmenopáusica (PMOP) es una enfermedad del sistema óseo causada por una función ovárica inadecuada, disminución de estrógenos y aumento de la actividad osteoclástica¹, caracterizada por baja masa ósea, degeneración microarquitectónica del tejido óseo y daño de la trabécula ósea. La PMOP es propensa a causar fracturas y puede tener efectos graves en la calidad de vida de los pacientes. La osteoporosis afecta a unos 200 millones de personas en todo el mundo²; Alrededor del 40% de las mujeres posmenopáusicas sufren de osteoporosis³, y las fracturas ocurren en el 33% de las pacientes con PMOP⁴. La reducción de estrógenos podría conducir a una actividad osteoclástica relativamente mejorada⁵ y a una disminución de la masa ósea cuando la resorción ósea supera la formación ósea. Por lo tanto, la activación de los osteoclastos suele considerarse un signo de pérdida ósea⁶. Desde el punto de vista fisiológico, RANKL/OPG sirve como una vía importante que implica la remodelación ósea mediante la regulación de la activación de los osteoclastos para promover la resorción ósea⁷. Mientras tanto, el estrógeno también puede mediar en la formación y función de osteoclastos mediante la regulación de la señalización RANKL/OPG⁸.

En los últimos años, la medicina tradicional ha sido cada vez más utilizada para tratar diferentes enfermedades con menos reacciones adversas y mejor pronóstico ^9,10. La cápsula de Bazi Bushen (BZBS), una medicina tradicional china, podría ser un enfoque alternativo para prevenir y tratar la PMOP. Está compuesto por Cuscuta, Fructus lycii, Fructus schisandrae, Fructus cnidii, Fructus rosae laevigatae (fruto de la rosa Cherokee), frambuesa, Semen Allii Tuberosi, Toosendan fructus, Herba epimedii, Morinda officinalis, Herba cistanches, Rehmannia glutinosa, Raíz de ciathula, Ginseng, Asta pilosa e Hippocampus Kelloggi (Tabla 1), que contiene 11 tipos de fitoestrógenos con efectos similares a los de las hormonas. Un estudio previo ha confirmado que el BZBS puede retrasar la formación de placa de ateroma a través de un efecto similar al estrógeno¹¹, que es similar al tratamiento de la osteoporosis con estrógeno¹². Sin embargo, los mecanismos subyacentes de BZBS en la prevención y el tratamiento de la osteoporosis causada por la deficiencia de estrógenos no están claros. Por lo tanto, el presente estudio tuvo como objetivo verificar si el BZBS tiene un efecto protector óseo sobre la osteoporosis de rata inducida por ovariectomía^13,14.

Protocolo

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Investigación y Ética Animal del Instituto de Investigación Médica de Hebei Yiling (número de aprobación: N2020150). Las 36 ratas hembras de Sprague-Dawley (SD) (3 meses de edad, con un peso de 180-200 g) (ver Tabla de Materiales) fueron alimentadas con alimentos normales y agua limpia en el nuevo centro de evaluación de medicamentos del Instituto de Investigación Médica de Hebei Yiling y fueron expuestas a luz artificial durante 12 horas al día en habitaciones con temperaturas controladas (20-26 °C) y humedad relativa (40%-70%).

1. Experimento con animales

1. Divida las ratas en seis grupos al azar, un grupo operado simuladamente (grupo SHAM, solución salina de 10 mL/kg/d), un grupo modelo (grupo OVX, solución salina de 10 mL/kg/d), un grupo progynova¹⁵ (0,2 mg/kg/d), un grupo BZBS de dosis baja (grupo BZBSL, 1 g/kg/d), un grupo BZBS de dosis media (grupo BZBSM, 2 g/kg/d) y un grupo BZBS de dosis alta (grupo BZBSH, 4 g/kg/d).
   NOTA: La dosis del grupo BZBSM se determinó a partir de las dosis recomendadas para humanos y se calculó de la siguiente manera: dosis experimental equivalente para ratas (mg/kg/d) = dosis humana (mg/kg)/peso corporal (60 kg) x 6,3.
2. Emplear isoflurano al 3% y al 1,5% para la inducción y el mantenimiento de la anestesia en ratas durante toda la operación, respectivamente.
   NOTA: Si las ratas no parpadean y el reflejo pedal está ausente, se confirma la profundidad de la anestesia y se realiza el mantenimiento de la anestesia de rata, respectivamente.
3. Retire el pelaje del abdomen de la rata con una navaja de afeitar estéril y desinfecte la piel del abdomen de la rata con rondas alternativas de etanol y povidona yodada 3 veces con una bola de algodón estéril. Aplicar analgesia local con una inyección tópica de 1,5 mg/kg de bupivacaína después de la anestesia.
   NOTA: El método de desinfección adopta un patrón circular centrado alrededor de la incisión y comenzando desde el centro hacia afuera.
4. Realizar una incisión de 2 cm en la línea media del abdomen de la rata con un bisturí estéril en el grupo SHAM y suturar la incisión de la línea media con una sutura quirúrgica 4-0.
   NOTA: En primer lugar, la capa muscular interna se sutura con sutura reabsorbible y el cierre externo/cutáneo se sutura con monofilamento. En el décimo día, use tijeras para abrir el monofilamento y use pinzas para extraer el monofilamento.
5. En el caso de las ratas de los otros grupos, aísle y exponga el ovario intacto con pinzas estériles y lige la raíz del ovario con una sutura quirúrgica 4-0. Extirpe el ovario intacto con unas tijeras quirúrgicas estériles. Sutura la incisión de la línea media con una sutura quirúrgica 4-0.
   NOTA: Todas las ratas postoperatorias se colocaron en aislamiento en recipientes a 37 °C hasta que las ratas estuvieron despiertas y pudieron moverse libremente.
6. Después de 4 meses de la administración intragástrica de los medicamentos designados (en el paso 1.1), primero anestesiar a la rata con isoflurano al 3%, usar crema depilatoria para eliminar el pelo de la espalda de la rata y luego desinfectar la piel de la ingle y toda la extremidad inferior con etanol y povidona yodada 3 veces con una bola de algodón estéril.
   NOTA: El medicamento se administró una vez al día con una aguja de sonda nasogástrica de acero inoxidable de 10 cm. La dosis de sonda nasogástrica se ajustó semanalmente de acuerdo con el peso de las ratas.
7. Cortar y pelar la piel de la ingle para exponer la arteria femoral con tijeras quirúrgicas estériles y pinzas. Recoja una muestra de sangre de la arteria femoral con un tubo de recolección de sangre al vacío y luego aplique presión para detener el sangrado con una bola de algodón estéril. Sacrificar a las ratas con inhalación excesiva de dióxido de carbono.
8. Continúe cortando y pelando la piel de la ingle y la extremidad inferior para exponer la tibia intacta con tijeras quirúrgicas estériles y pinzas. Después de retirar la tibia, lávela tres veces con solución salina estéril y continúe eliminando el exceso de tejido muscular en solución salina con pinzas y tijeras oftálmicas.
9. Desinfecte la piel dorsal de la L4 lumbar con etanol y povidona yodada 3x con una bola de algodón estéril. Use tijeras quirúrgicas estériles y pinzas para cortar la piel de la espalda y exponer la L4 lumbar.
10. Cortar las vértebras superior e inferior de la L4 lumbar con un rongeur y cortar el sacro alrededor de la L4 lumbar con tijeras quirúrgicas estériles. Lave la L4 lumbar aislada con solución salina tres veces y continúe eliminando el exceso de tejido muscular en solución salina con pinzas y microtijeras.
11. Almacene la tibia y la vértebra L4 en líquido tisular con formalina al 10% (consulte la Tabla de materiales) a temperatura ambiente durante 3 días.
12. Empaque el cadáver en una bolsa especial para cadáveres y colóquelo en un gabinete de almacenamiento de cadáveres de animales.

2. Micro-TC¹⁶

1. Presione el botón verde de encendido para encender el escáner de micro-CT (consulte la Tabla de materiales) e inicie el software para calentar la fuente de rayos X.
   NOTA: Para evitar la dispersión de los rayos X, mueva cualquier objeto metálico cerca del área de la imagen antes de comenzar. El examen por micro-TC del tejido tibial de rata en el paso 1.11 con irradiación de rayos X insuficiente puede afectar los hallazgos. El hueso debe mantenerse húmedo durante la microtomografía computarizada. La cama del animal debe sacarse mientras se calienta. Asegúrese de que la llave esté girada a la posición ON en la LLAVE DE SEGURIDAD en la esquina inferior izquierda frente al instrumento CT.
2. Cree una base de datos haciendo clic en una nueva para construir un archivo para guardar los datos y obtenerlos a continuación.
3. Configure los parámetros de adquisición de datos en la ventana de control del software de la siguiente manera: voltaje del tubo de rayos X (50 kV); Corriente del tubo de rayos X de TC (100 μA); corriente del tubo de rayos X vivo (100 μA); campo de visión (FOV) (18 mm); sin técnica de compuerta; Técnica de escaneo (alta resolución 4 min).
4. Lave la tibia con solución salina tres veces y seque el exceso de agua con papel de filtro. Envuelva el tejido de la tibia en la cama con una película de plástico para fijar su posición. Ajuste el tejido de la tibia al centro del campo de imágenes girando el botón del instrumento.
5. Cierre la puerta del instrumento y active el modo en vivo . Presione el botón de captura para ver el tejido tibial.
6. Inicie la exploración haciendo clic en el botón de tomografía computarizada . Haga clic en Sí para producir la imagen.
   NOTA: Una vez que se encienden los rayos X, la luz naranja en la parte superior del instrumento se iluminará y la puerta corredera no se abrirá para la seguridad del operador. Una vez finalizado el escaneo, aparece una nueva ventana en el software 2D Viewer que muestra el eje transversal, el plano coronal y el plano sagital reconstruidos. Haga clic en Pegar en el tablero de dibujo para guardar.
7. Saca la tibia de la cama del animal. Abra el software Analyze 12.0 e importe la imagen CT objetivo haciendo clic en Archivo > Cargar > proceso. Haga clic en las opciones Calculadora de imagen... y Relleno de región para mostrar el cuadro de diálogo Subregión .
   1. Haga clic en la opción Interactivo y seleccione el hueso en el área de 2 mm de grosor. Haga clic en Aplicar para seleccionar Cambiar una copia del volumen cargado. En la pantalla Analizar 12.0 , haga clic en la opción Aplicaciones para seleccionar BMA.
   2. Haga clic en Corteza de segmento y Tracérculas de segmento y, a continuación, haga clic en Guardar mapa de objetos final. Haga clic en Medir hueso para mostrar el valor de los indicadores de parámetros específicos, incluida la densidad mineral ósea (DMO, g/cm³), la fracción de volumen óseo (volumen de tejido óseo/volumen de tejido [BV/TV], %), número de trabéculas óseas (Tb.N, 1/mm), grosor trabecular óseo (TB.Th, μm) y grado de separación trabecular (Tb.Sp, μm).
      NOTA: No se realizó micro-TC con vértebras L4.

3. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)

1. Extraiga las muestras de tibia y vértebra L4 de la rata en el paso 1.11 y guárdelas en una solución de ácido fórmico al 20% para una descalcificación de 4 días.
   NOTA: La solución de ácido fórmico al 20% se prepara mezclando 2.400 ml de solución de formaldehído y 600 ml de solución de ácido fórmico.
2. Coloque la muestra procesada de tibia y vértebra L4 de la rata del paso 3.1 en la caja de inclusión y lávelas con agua corriente durante más de 6 h.
3. Deshidrate las muestras con soluciones de alcohol de concentración de gradiente (etanol al 60% durante 1 h, etanol al 70% durante 1 h, etanol al 90% durante 1 h, etanol al 95% durante 2 h y etanol al 100% durante 2 h) utilizando un procesador de tejidos automatizado.
4. Coloque las muestras de tejido en xileno durante 2 h para que queden translúcidas. Al final de la deshidratación, coloque las muestras permeabilizadas en cera de parafina a 60 °C durante 3 h e insértelas en un procesador automático.
5. Obtenga las secciones de 4 μm utilizando una cortadora rotativa. Coloque las secciones en la tinción de hematoxilina durante 3-8 minutos y en la tinción de eosina durante 1-3 minutos.
6. Transfiera las secciones manchadas a alcohol puro y xileno, respectivamente. Selle y fije las secciones manchadas con goma neutra para el examen patológico bajo un microscopio óptico.
7. Escanee los cortes con un escáner de portaobjetos (consulte la Tabla de materiales) con un aumento de 40x y utilice el software de visualización para adquirir los resultados de tinción de H&E de toda la tibia y la vértebra L4.

4. Inmunohistoquímica

1. Realice la recuperación de epítopos inducida por calor utilizando las secciones de tibia de 4 μm obtenidas en el paso 3.5. Agregue el tampón de reparación de antígeno apropiado (tampón de ácido cítrico, pH = 6.0) a un recipiente apto para microondas. Coloque la hoja portadora en el recipiente apto para microondas y coloque el recipiente en el horno microondas. Configure el programa para mantener la reparación del antígeno durante 20 minutos a 98 °C.
2. Retire el recipiente y enjuague el interior con agua fría del grifo durante 10 min. Bloquear la actividad de la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno (3% H₂O₂) (ver Tabla de Materiales), luego incubar la rebanada durante 15 min a temperatura ambiente.
3. Lave las secciones con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (consulte la Tabla de materiales) tres veces, 5 minutos cada una.
4. Coloque las secciones en una solución bloqueadora de suero de cabra normal (consulte la Tabla de materiales), luego incube las muestras en una cámara húmeda durante 15 minutos a temperatura ambiente.
5. Añadir 200 μL de anticuerpo RANKL (1:200) (ver Tabla de Materiales), anticuerpo OPG (1:300) (ver Tabla de Materiales) y anticuerpo esclerostina¹⁷ (1:200) (ver Tabla de Materiales) en las muestras de corte e incubar durante una noche a 4 °C en la oscuridad.
   NOTA: La esclerostina es un regulador negativo del crecimiento óseo. Es una glicoproteína secretada con un dominio en forma de nudo de cisteína C-terminal y tiene una similitud de secuencia con la familia DAN de antagonistas de proteínas morfogenéticas óseas¹⁷. Esta proteína no es miembro de la vía RANKL.
6. Agregue IgG anti-conejo de cabra marcado con biotina (ver Tabla de Materiales) en las secciones e incube a temperatura ambiente durante 30 min. Enjuague las secciones con PBS y use diaminobenzidina (DAB) (ver Tabla de materiales) para teñir las secciones durante 3-5 min a temperatura ambiente.
7. Teñir las secciones con hematoxilina durante 1-2 min. Después de deshidratar y secar las secciones, séllalas con goma neutra.
8. Escanee las secciones con un aumento de 40x utilizando un escáner de portaobjetos (ver Tabla de Materiales) y capture imágenes digitales utilizando un sistema automático de imágenes de microscopio (ver Tabla de Materiales).
9. Abra el software Imagepro Plus (consulte la Tabla de materiales).
   1. Haga clic en Archivo para importar la imagen de análisis. Haga clic en Medir > Calibración > Calibración de intensidad para la corrección de la densidad óptica. Haga clic en las opciones Medir, IOD, Recuento/Tamaño y Seleccionar colores una por una para mostrar la interfaz de Segmentación .
   2. Haga clic en la opción Basado en histograma para seleccionar HIS y haga clic en Cargar archivo. Haga clic en Recuento para generar el valor de IOD y el valor de área .

5. Protocolo de ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA)

1. Asegúrese de que el kit ELISA para detectar 17β-estradiol incluya la microplaca recubierta de IgG anti-17β-estradiol (12 x 8 pocillos), 15 mL de solución de parada, 22 mL de conjugado 17β-estradiol-HRP, 15 mL de solución de sustrato de tetrametilbencidina (TMB) de 3,3',5,5', 50 mL de solución de lavado 10x, láminas de cubierta, un soporte de tiras, el control de 17β-estradiol y un gradiente de concentración diferente del patrón de 17β-estradiol (consulte la Tabla de materiales).
2. Retire el kit de 17β-estradiol del refrigerador y coloque todos los reactivos a temperatura ambiente (18-25 °C).
3. Preparación del reactivo: Diluir la solución de lavado 10x con agua desionizada para preparar una solución de lavado 1x. Mezcle 50 mL de solución de lavado 10x con 450 mL de agua desionizada para hacer 500 mL de solución de lavado 1x.
4. Retire la muestra de suero del refrigerador y descongélela a temperatura ambiente.
5. Retire el exceso de tiras de microtitulación del marco de la placa, devuélvalas a la bolsa de aluminio que contiene el paquete de desecante, vuelva a sellarlas y guárdelas a 4 °C.
6. Agregue 25 μL de control, patrón o muestra a cada uno de sus pocillos respectivos. A continuación, añada 200 μL de conjugado 17β-estradiol-HRP a cada pocillo.
7. Cubra todos los pocillos con papel de aluminio e incube la placa a 37 °C durante 2 h.
8. Retire el papel de aluminio y el líquido de cada pocillo y lave el pocillo tres veces con 300 μL de solución de lavado 1x.
   NOTA: Evite el desbordamiento de los pozos de reacción. Además, el tiempo de remojo entre cada ciclo de lavado debe ser de >5 s. Al final, retire con cuidado el líquido restante golpeando tiras de papel de seda antes del siguiente paso.
9. Añadir 100 μL de solución de sustrato TMB a cada pocillo e incubar en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente.
10. Añadir 100 μL de solución de tope a cada pocillo y agitar suavemente la placa de microtitulación durante 30 s. Mida la absorbancia de la muestra a 450 nm en 30 minutos.
11. Dibuje la absorbancia media de los patrones frente a la concentración. Traza la curva de mejor ajuste por los puntos trazados.
12. Obtener los valores de concentración correspondientes expresados en pg/mL interpolando los valores de las muestras en la curva estándar.
    NOTA: Los otros protocolos para detectar Ca²⁺, fósforo, SOST, TRACP-5b y β-CTX séricos son los mismos que la medición de 17β-estradiol, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

6. Análisis estadístico

1. Los datos se presentaron como media ± desviación estándar. Se realizaron comparaciones múltiples mediante ANOVA de un factor seguido de la prueba de Tukey. P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

La microestructura ósea de la tibia se evaluó mediante microtomografía computarizada
El tratamiento de ratas ovariectomizadas con BZBS redujo significativamente los cambios estructurales trabeculares inducidos por OVX. Como se muestra en las imágenes de micro-TC reconstruidas de la tibia derecha (Figura 1A,B), el hueso trabecular en el grupo OVX mostró una disminución significativa en la DMO (Fi...

Discusión

Después de la ovariectomía, los niveles de estrógeno disminuyeron bruscamente debido a la reducción continua del hueso esponjoso y al aumento del recambio óseo. Esencialmente, la disminución de la secreción de estrógenos después de la menopausia podría causar una pérdida ósea significativa¹⁸, lo que llevaría a la pérdida de Ca²⁺ en ratas ovariectomizadas^19,20. Se ha informado que t...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Proteintech Group, Inc.	23408-1AP-100
17-Beta-Estradiol ELISA kits	Proteintech Group, Inc.	21933-1-AP
3%H2O2	ShanDong LIRCON Medical Technology Incorporated Company	20221027
Anti-osteoprotegerin antibody	Abcam	ab203061
Bazibushen capsules	Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co. Ltd.	XB2103001
Biotin goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab207995
Calcium assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C004-2-1
Diaminobenzidine	ZSGB-BIO	ZLI-9018
Estradiol valerate tablets	Bayer AG	156A
Gene 1580R centrifuge	GENE Co. Ltd.	GZ422515090077
Image-Pro Plus	Media Cybernetics	IPP 6.0
Leica DM6000B Microscope (fully automated upright microscope system)	Leica	361715
Normal Goat Serum Blocking Solution	Vector Laboratories	S-1000-20
Phosphate assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C006-1-1
Phosphate buffered saline	Servicebio, Wuhan, China	CR10201M
Quantum GX2 microCT Imaging System	PerkinElmer	CLS149276
RANKL rabbit polyclonal antibody	Elabscience Biotechnology Co. Ltd.	E-EL-R3032-96T
Rat SOST (Sclerostin) ELISA kit	Elabscience Biotechnology Co. Ltd.	E-EL-R1405c-96T
Rat TRACP-5b (Tartrate Resistant Acid Phosphatase 5b) ELISA kit	Abcam	ab108667
Rat β-CTx (Beta Crosslaps) ELISA kit	Elabscience Biotechnology Co., Ltd.	E-EL-R0939c-96T
Sclerostin rabbit polyclonal antibody	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	SCXK(JING)2016-0006
Slide scanner	Hamamatsu Photonics K.K.	Nano Zoomer-SQ
Sprague Dawley female rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	ZLI-9381