Östrogenähnliche Wirkung der Bazi-Bushen-Kapsel bei ovariektomierten Ratten

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das zeigt, dass die Bazi Bushen Kapsel (BZBS) den RANKL/OPG-Signalweg im ovariektomierten Nagetiermodell durch ihre östrogenähnliche Wirkung regulieren kann.

Zusammenfassung

Ziel dieser Studie ist es, die östrogenähnliche Wirkung der Bazi Bushen Kapsel (BZBS), einer chinesischen pflanzlichen Verbindung, bei ovariektomierten Mäusen zu zeigen. Weibliche Sprague-Dawley-Ratten (SD) wurden nach dem Zufallsprinzip in sechs Gruppen eingeteilt: eine scheinoperierte Gruppe, eine Modellgruppe (OVX), eine Progynova-Gruppe und BZBS-Gruppen (1, 2 und 4 d/kg/d). Eine Ovariektomie wurde bei allen Ratten durchgeführt, mit Ausnahme derjenigen in der scheinoperierten Gruppe. Nach 4-monatiger BZBS-Behandlung wurden Mikro-Computertomographie (Mikro-CT), Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E), Immunhistochemie und ELISA-Nachweis (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) durchgeführt. Infolgedessen zeigten Ratten, die mit BZBS behandelt wurden, im Vergleich zur OVX-Gruppe eine erhöhte Anzahl und Fläche von trabekulären Knochen- und Knochenmarkzellen und eine verringerte Anzahl von Fettzellen. Das Knochenvolumen, die Trabekelzahl und die Trabekeldicke der rechten Tibia nahmen in den Medikationsgruppen zu und der Trabekelraum verringerte sich. Die 17β-Östradiol- und Serumkalziumspiegel in den Medikationsgruppen waren erhöht, aber die Spiegel von Serumphosphor, Sclerostin, β-CTX und TRACP-5b waren erniedrigt. In den Medikationsgruppen waren die RANKL- und Sclerostin-Spiegel gesenkt, während der Osteoprotegerin-Spiegel (OPG) erhöht war. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die therapeutischen Wirkungen und potenziellen molekularen Mechanismen chinesischer pflanzlicher Verbindungen bei ovariektomierten Ratten mit einer Vielzahl von Techniken systematisch bewertete.

Einleitung

Postmenopausale Osteoporose (PMOP) ist eine Erkrankung des Skelettsystems, die durch eine unzureichende Eierstockfunktion, vermindertes Östrogen und eine erhöhte Osteoklastenaktivität 1 verursacht wird^und durch eine geringe Knochenmasse, eine mikroarchitektonische Degeneration des Knochengewebes und eine Schädigung der Knochentrabekel gekennzeichnet ist. PMOP neigt zu Frakturen und kann schwerwiegende Auswirkungen auf die Lebensqualität der Patienten haben. Weltweit sind etwa 200 Millionen Menschen von Osteoporose betroffen²; Etwa 40 % der postmenopausalen Frauen leiden an Osteoporose³, und Frakturen treten bei 33 % der Patientinnen mit PMOP⁴ auf. Die Reduktion von Östrogen könnte zu einer relativ erhöhten Osteoklastenaktivität⁵ und einer Abnahme der Knochenmasse führen, wenn der Knochenabbau die Knochenbildung übersteigt. Daher wird die Aktivierung von Osteoklasten in der Regel als Zeichen für Knochenschwund angesehen⁶. Physiologisch gesehen dient RANKL/OPG als wichtiger Signalweg für den Knochenumbau, indem es die Osteoklastenaktivierung reguliert, um die Knochenresorption zu fördern⁷. In der Zwischenzeit kann Östrogen auch die Bildung und Funktion von Osteoklasten vermitteln, indem es die RANKL/OPG-Signalübertragung reguliert⁸.

In den letzten Jahren wurde die traditionelle Medizin zunehmend eingesetzt, um verschiedene Krankheiten mit weniger Nebenwirkungen und besserer Prognose zu behandeln ^9,10. Die Bazi Bushen Kapsel (BZBS), ein traditionelles chinesisches Arzneimittel, könnte ein alternativer Ansatz zur Vorbeugung und Behandlung von PMOP sein. Sie setzt sich zusammen aus Cuscuta, Fructus lycii, Fructus schisandrae, Fructus cnidii, Fructus rosae laevigatae (Cherokee-Rosenfrucht), Himbeere, Samen Allii Tuberosi, Toosendan fructus, Herba epimedii, Morinda officinalis, Herba cistanches, Rehmannia glutinosa, medizinische Cyathula-Wurzel, Ginseng, Pilose-Geweih und Hippocampus Kelloggi (Tabelle 1), das 11 Arten von Phytoöstrogen mit hormonähnlicher Wirkung enthält. Eine frühere Studie hat bestätigt, dass BZBS die Bildung von atheromatösen Plaques durch eine östrogenähnliche Wirkung^{verzögern kann 11}, ähnlich wie bei der Behandlung von Osteoporose mit Östrogen¹². Die zugrundeliegenden Mechanismen von BZBS bei der Prävention und Behandlung von Osteoporose, die durch einen Östrogenmangel verursacht wird, sind jedoch unklar. Daher sollte in der vorliegenden Studie überprüft werden, ob BZBS eine knochenschützende Wirkung auf die ovariektomieinduzierte Osteoporose der Ratte hat^13,14.

Protokoll

Die Tierversuche wurden vom Ausschuss für Tierversuche und Ethik des Hebei Yiling Medical Research Institute genehmigt (Zulassungsnummer: N2020150). Die 36 weiblichen Sprague-Dawley (SD) Ratten (3 Monate alt, 180-200 g schwer) (siehe Materialtabelle) wurden im neuen Arzneimittelbewertungszentrum des Hebei Yiling Medical Research Institute mit normalem Futter und sauberem Wasser gefüttert und 12 Stunden pro Tag in Räumen mit kontrollierten Temperaturen (20-26 °C) und relativer Luftfeuchtigkeit (40%-70%) künstlichem Licht ausgesetzt.

1. Tierversuch

1. Teilen Sie die Ratten nach dem Zufallsprinzip in sechs Gruppen ein, eine scheinoperierte Gruppe (SHAME-Gruppe, 10 ml/kg/d Kochsalzlösung), eine Modellgruppe (OVX-Gruppe, 10 ml/kg/d Kochsalzlösung), eine Progynova-15-Gruppe (0,2 mg/kg/d), eine niedrig dosierte BZBS-Gruppe (BZBSL-Gruppe, 1 g/kg/d), eine mitteldosierte BZBS-Gruppe (BZBSM-Gruppe, 2 g/kg/d) und eine hochdosierte BZBS-Gruppe (BZBSH-Gruppe, 4 g/kg/Tag).
   HINWEIS: Die Dosis der BZBSM-Gruppe wurde anhand der empfohlenen Dosierungen für den Menschen bestimmt und wie folgt berechnet: Äquivalente experimentelle Dosis für Ratten (mg/kg/d) = Dosis beim Menschen (mg/kg)/Körpergewicht (60 kg) x 6,3.
2. Verwenden Sie 3% bzw. 1,5% Isofluran für die Einleitung und Aufrechterhaltung der Rattenanästhesie während der gesamten Operation.
   HINWEIS: Wenn die Ratten nicht blinzeln und der Pedalreflex fehlt, wird die Narkosetiefe bestätigt bzw. die Aufrechterhaltung der Rattenanästhesie durchgeführt.
3. Entfernen Sie das Fell des Hinterleibs der Ratte mit einem sterilen Rasierer und desinfizieren Sie die Haut des Bauches der Ratte mit abwechselnden Runden Ethanol und Povidon-Jod 3 Mal mit einem sterilen Wattebausch. Nach der Anästhesie eine lokale Analgesie mit einer topischen Injektion von 1,5 mg/kg Bupivacain anwenden.
   HINWEIS: Die Desinfektionsmethode nimmt ein kreisförmiges Muster an, das um den Einschnitt zentriert ist und von der Mitte nach außen beginnt.
4. Führen Sie einen 2 cm langen Mittellinienschnitt am Bauch der Ratte mit einem sterilen Skalpell in der HAM-Gruppe durch und vernähen Sie den Mittellinienschnitt mit einer chirurgischen 4-0-Naht.
   HINWEIS: Zuerst wird die innere Muskelschicht mit resorbierbarem Nahtmaterial vernäht und der äußere/Hautverschluss mit Monofilament vernäht. Am 10. Tag schneidest du das Monofilament mit einer Schere auf und ziehst es mit einer Pinzette heraus.
5. Bei den Ratten der anderen Gruppen isolieren und freilegen Sie den intakten Eierstock mit einer sterilen Pinzette und ligieren Sie an der Wurzel des Eierstocks mit einer chirurgischen 4-0-Naht. Entfernen Sie den intakten Eierstock mit einer sterilen chirurgischen Schere. Vernähen Sie den Mittellinienschnitt mit einer 4-0 chirurgischen Naht.
   HINWEIS: Alle postoperativen Ratten wurden isoliert in 37 °C-Behältern untergebracht, bis die Ratten wach waren und sich frei bewegen konnten.
6. Nach 4-monatiger intragastrischer Verabreichung der angegebenen Arzneimittel (in Schritt 1.1) betäuben Sie die Ratte zuerst mit 3% Isofluran, verwenden Sie Haarentfernungscreme, um das Fell vom Rücken der Ratte zu entfernen, und desinfizieren Sie dann die Haut der Leiste und der gesamten unteren Extremität mit Ethanol und Povidon-Jod 3x mit einem sterilen Wattebausch.
   HINWEIS: Das Medikament wurde einmal täglich mit einer 10 cm langen Sondennadel aus Edelstahl verabreicht. Die Sondendosis wurde wöchentlich an das Gewicht der Ratten angepasst.
7. Schneiden und schälen Sie die Haut der Leiste, um die Oberschenkelarterie mit einer sterilen chirurgischen Schere und Pinzette freizulegen. Entnehmen Sie mit einem Vakuum-Blutentnahmeröhrchen eine Blutprobe aus der Oberschenkelarterie und üben Sie dann mit einem sterilen Wattebausch Druck aus, um die Blutung zu stoppen. Euthanasieren Sie die Ratten mit übermäßigem Einatmen von Kohlendioxid.
8. Schneiden und schälen Sie weiterhin die Haut der Leiste und der unteren Extremität, um das intakte Schienbein mit einer sterilen chirurgischen Schere und Pinzette freizulegen. Waschen Sie die Tibia nach dem Entfernen dreimal mit steriler Kochsalzlösung und entfernen Sie weiterhin überschüssiges Muskelgewebe in Kochsalzlösung mit einer Pinzette und einer Augenschere.
9. Desinfizieren Sie die Rückenhaut des L4 L4 mit Ethanol und Povidon-Jod 3x mit einem sterilen Wattebausch. Verwenden Sie eine sterile chirurgische Schere und Pinzette, um die Rückenhaut zu schneiden und die Lendenwirbelsäule L4 freizulegen.
10. Durchtrennen Sie den oberen und unteren Wirbel der L4 L4 mit einem Rongeur und schneiden Sie das Kreuzbein um die L4 L4 mit einer sterilen chirurgischen Schere ab. Waschen Sie die isolierte L4 L4 dreimal mit Kochsalzlösung und entfernen Sie weiterhin überschüssiges Muskelgewebe in Kochsalzlösung mit Pinzette und Mikroschere.
11. Lagern Sie das Schienbein und den L4-Wirbel 3 Tage lang in 10%iger Formalin-Gewebsflüssigkeit (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur.
12. Packen Sie den Kadaver in einen speziellen Leichenbeutel und legen Sie ihn in einen Tierkadaverschrank.

2. Mikro-CT-Bildgebung¹⁶

1. Drücken Sie den grünen Netzschalter, um den Mikro-CT-Scanner einzuschalten (siehe Materialtabelle) und starten Sie die Software zum Heizen der Röntgenquelle.
   HINWEIS: Um eine Streuung der Röntgenstrahlen zu vermeiden, bewegen Sie vor dem Start alle Metallgegenstände in die Nähe des Bildgebungsbereichs. Eine Mikro-CT-Untersuchung des Tibiagewebes der Ratte in Schritt 1.11 mit unzureichender Röntgenbestrahlung kann den Befund beeinflussen. Der Knochen sollte während der Mikro-CT-Untersuchung feucht gehalten werden. Das Tierbett sollte beim Aufwärmen herausgenommen werden. Stellen Sie sicher, dass der Schlüssel auf dem SICHERHEITSSCHLÜSSEL in der unteren linken Ecke vor dem CT-Instrument in die Position ON gedreht ist.
2. Erstellen Sie eine Datenbank, indem Sie auf eine neue Datenbank klicken, um eine Datei zu erstellen, in der Sie die Daten speichern können, um sie als nächstes zu erhalten.
3. Stellen Sie die Datenerfassungsparameter im Software-Steuerungsfenster wie folgt ein: Spannung der Röntgenröhre (50 kV); Strom der CT-Röntgenröhre (100 μA); Strom einer Röntgenröhre unter Spannung (100 μA); Sichtfeld (FOV) (18 mm); keine Anschnitttechnik; Scantechnik (hohe Auflösung 4 min).
4. Waschen Sie das Schienbein dreimal mit Kochsalzlösung und tupfen Sie überschüssiges Wasser mit Filterpapier ab. Wickeln Sie das Tibiagewebe mit Plastikfolie auf das Bett, um seine Position zu fixieren. Stellen Sie das Tibiagewebe durch Drehen der Taste am Instrument auf die Mitte des Bildgebungsfeldes ein.
5. Schließen Sie die Instrumententür und schalten Sie den Live-Modus ein. Drücken Sie die Aufnahmetaste , um das Tibiagewebe anzuzeigen.
6. Starten Sie den Scan, indem Sie auf die Schaltfläche CT-Scan klicken. Klicken Sie auf Ja , um das Bild zu erstellen.
   HINWEIS: Sobald das Röntgengerät eingeschaltet ist, leuchtet das orangefarbene Licht an der Oberseite des Instruments auf und die Schiebetür öffnet sich zur Sicherheit des Bedieners nicht. Wenn der Scan abgeschlossen ist, wird in der 2D-Viewer-Software ein neues Fenster angezeigt, in dem die rekonstruierte Querachse, die Koronalebene und die Sagittalebene angezeigt werden. Klicken Sie zum Speichern auf In das Zeichenbrett einfügen .
7. Nehmen Sie das Schienbein aus dem Tierbett. Öffnen Sie die Software Analyze 12.0 und importieren Sie das objektive CT-Bild, indem Sie auf Datei klicken > > Prozess laden. Klicken Sie auf die Optionen Bildrechner... und Regionsblock , um das Dialogfeld "Subregion " anzuzeigen.
   1. Klicken Sie auf die Option Interaktiv und wählen Sie den Bone im Bereich mit einer Dicke von 2 mm aus. Klicken Sie auf Übernehmen , um die Option Kopie des geladenen Volumes ändern auszuwählen. Klicken Sie im Bildschirm "Analyze 12.0 " auf die Option Apps , um BMA auszuwählen.
   2. Klicken Sie auf "Segment Cortex" und "Segment Trabeculae" und dann auf "Final Object Map speichern". Klicken Sie auf Knochen messen , um den Wert bestimmter Parameterindikatoren anzuzeigen, einschließlich Knochenmineraldichte (BMD, g/^{cm 3}), Knochenvolumenanteil (Knochengewebevolumen/Gewebevolumen [BV/TV], %), Anzahl der Knochentrabekel (Tb.N, 1/mm), Knochentrabekeldicke (TB.Th, μm) und Trabekeltrennungsgrad (Tb.Sp, μm).
      HINWEIS: Die Mikro-CT wurde nicht mit L4-Wirbeln durchgeführt.

3. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E)

1. Entnehmen Sie die Schienbein- und L4-Wirbelproben der Ratte in Schritt 1.11 und lagern Sie sie in 20%iger Ameisensäurelösung für eine 4-tägige Entkalkung.
   HINWEIS: Die 20%ige Ameisensäurelösung wird durch Mischen von 2.400 mL Formaldehydlösung und 600 mL Ameisensäurelösung hergestellt.
2. Legen Sie die aufbereitete Tibia- und L4-Wirbelprobe der Ratte aus Schritt 3.1 in die Einbettbox und waschen Sie sie länger als 6 h unter fließendem Wasser.
3. Dehydrieren Sie die Proben mit Alkohollösungen mit Gradientenkonzentration (60 % Ethanol für 1 h, 70 % Ethanol für 1 h, 90 % Ethanol für 1 h, 95 % Ethanol für 2 h und 100 % Ethanol für 2 h) unter Verwendung eines automatisierten Gewebeprozessors.
4. Legen Sie die Gewebeproben 2 h lang in Xylol, um sie durchscheinend zu machen. Am Ende der Dehydratisierung werden die permeabilisierten Proben 3 h lang bei 60 °C in Paraffinwachs eingelegt und in einen automatischen Prozessor eingebettet.
5. Die 4-μm-Abschnitte werden mit einem Rotationsschneider erhalten. Legen Sie die Abschnitte 3-8 min in Hämatoxylin-Färbung und 1-3 min in Eosin-Färbung.
6. Übertragen Sie die gefärbten Abschnitte in reinen Alkohol bzw. Xylol. Versiegeln und fixieren Sie die verfärbten Stellen mit neutralem Gummi für die pathologische Untersuchung unter einem optischen Mikroskop.
7. Scannen Sie die Schichten mit einem Objektträgerscanner (siehe Materialtabelle) bei 40-facher Vergrößerung und verwenden Sie die Betrachtungssoftware, um die H&E-Färbeergebnisse des gesamten Schienbeins und des L4-Wirbels zu erfassen.

4. Immunhistochemie

1. Führen Sie eine hitzeinduzierte Epitopentnahme mit den in Schritt 3.5 erhaltenen 4-μm-Tibiaschnitten durch. Geben Sie den entsprechenden Antigen-Reparaturpuffer (Zitronensäurepuffer, pH = 6,0) in ein mikrowellengeeignetes Gefäß. Legen Sie das Trägertuch in den mikrowellengeeigneten Behälter und stellen Sie den Behälter in die Mikrowelle. Stellen Sie das Programm so ein, dass die Antigenreparatur 20 Minuten lang bei 98 °C gehalten wird.
2. Nehmen Sie den Behälter heraus und spülen Sie den Innenraum 10 Minuten lang mit kaltem Leitungswasser aus. Blockieren Sie die endogene Peroxidaseaktivität mit Wasserstoffperoxid (3 % H₂O₂) (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie die Scheibe dann 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
3. Waschen Sie die Schnitte dreimal zu je 5 min in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (siehe Materialtabelle).
4. Geben Sie die Schnitte in normale Ziegenserum-Blockierungslösung (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie die Proben dann 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer.
5. Geben Sie 200 μl RANKL-Antikörper (1:200) (siehe Materialtabelle), OPG-Antikörper (1:300) (siehe Materialtabelle) und Sclerostin-Antikörper¹⁷ (1:200) (siehe Materialtabelle) in die Schnittproben und inkubieren Sie eine Nacht lang bei 4 °C im Dunkeln.
   HINWEIS: Sclerostin ist ein negativer Regulator des Knochenwachstums. Es handelt sich um ein sezerniertes Glykoprotein mit einer C-terminalen Cystein-Knoten-ähnlichen Domäne und weist eine Sequenzähnlichkeit mit der DAN-Familie der knochenmorphogenetischen Proteinantagonisten^{auf 17}. Dieses Protein ist kein Mitglied des RANKL-Signalwegs.
6. Geben Sie biotinmarkiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (siehe Materialtabelle) in die Schnitte und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Abschnitte mit PBS ab und verwenden Sie Diaminobenzidin (DAB) (siehe Materialtabelle), um die Abschnitte 3-5 Minuten lang bei Raumtemperatur zu färben.
7. Färben Sie die Abschnitte 1-2 Minuten lang mit Hämatoxylin ein. Nachdem Sie die Abschnitte getrocknet und getrocknet haben, versiegeln Sie sie mit neutralem Gummi.
8. Scannen Sie die Schnitte mit 40-facher Vergrößerung mit einem Objektträgerscanner (siehe Materialtabelle) und nehmen Sie digitale Bilder mit einem automatischen Mikroskop-Bildgebungssystem auf (siehe Materialtabelle).
9. Öffnen Sie die Imagepro Plus-Software (siehe Materialtabelle).
   1. Klicken Sie auf Datei , um das Analysebild zu importieren. Klicken Sie auf Messen > Kalibrierung > Intensitätskalibrierung , um die optische Dichte zu korrigieren. Klicken Sie nacheinander auf die Optionen Measure, IOD, Count/Size und Select Colors , um die Segmentierungsoberfläche anzuzeigen.
   2. Klicken Sie auf die Option Histogrammbasiert , um KIS auszuwählen, und klicken Sie auf Datei laden. Klicken Sie auf Anzahl , um den IOD-Wert und den Flächenwert zu generieren.

5. ELISA-Protokoll (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)

1. Stellen Sie sicher, dass das ELISA-Kit zum Nachweis von 17β-Östradiol die mit Anti-17β-Estradiol IgG beschichtete Mikroplatte (12 x 8 Wells), 15 ml Stopplösung, 22 ml 17β-Estradiol-HRP-Konjugat, 15 mL 3,3',5,5' Tetramethylbenzidin (TMB)-Substratlösung, 50 mL 10x Waschlösung, Abdeckfolien, einen Streifenhalter, die 17β-Estradiol-Kontrolle und einen anderen Konzentrationsgradienten des 17β-Estradiol-Standards enthält (siehe Materialtabelle).
2. Nehmen Sie das 17β-Estradiol-Kit aus dem Kühlschrank und stellen Sie alle Reagenzien auf Raumtemperatur (18-25 °C).
3. Reagenzienvorbereitung: Verdünnen Sie die 10-fache Waschlösung mit entionisiertem Wasser, um eine 1-fache Waschlösung herzustellen. Mischen Sie 50 mL 10x Waschlösung mit 450 mL entionisiertem Wasser, um 500 mL 1x Waschlösung herzustellen.
4. Nehmen Sie die Serumprobe aus dem Kühlschrank und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf.
5. Entfernen Sie die überschüssigen Mikrotiterstreifen vom Plattenrahmen, geben Sie sie wieder in den Folienbeutel mit der Trockenmittelpackung zurück, verschließen Sie sie wieder und lagern Sie sie bei 4 °C.
6. Geben Sie 25 μl Kontroll-, Standard- oder Probenmaterial in jedes der jeweiligen Wells. Geben Sie dann 200 μl 17β-Estradiol-HRP-Konjugat in jede Vertiefung.
7. Decken Sie alle Vertiefungen mit Folie ab und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 2 h.
8. Entfernen Sie die Folie und die Flüssigkeit aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Vertiefung dreimal mit 300 μl 1x Waschlösung.
   HINWEIS: Vermeiden Sie ein Überlaufen der Reaktionsvertiefungen. Außerdem sollte die Einwirkzeit zwischen den einzelnen Waschgängen >5 s betragen. Entfernen Sie zum Schluss vorsichtig die restliche Flüssigkeit, indem Sie vor dem nächsten Schritt auf Seidenpapierstreifen klopfen.
9. Geben Sie 100 μl TMB-Substratlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.
10. Geben Sie 100 μl Stopplösung in jede Vertiefung und schütteln Sie die Mikrotiterplatte vorsichtig 30 s lang. Messen Sie die Extinktion der Probe bei 450 nm innerhalb von 30 min.
11. Ziehen Sie die durchschnittliche Absorption der Standards gegen die Konzentration. Plotten Sie die am besten angepasste Kurve anhand der gezeichneten Punkte.
12. Die entsprechenden Konzentrationswerte, ausgedrückt in pg/ml, werden durch Interpolation der Werte der Proben auf der Standardkurve ermittelt.
    HINWEIS: Die anderen Protokolle zum Nachweis von Serum-Ca²⁺, Phosphor, SOST, TRACP-5b und β-CTX sind die gleichen wie bei der 17β-Östradiol-Messung gemäß den Anweisungen des Herstellers.

6. Statistische Analyse

1. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Mehrere Vergleiche wurden durch eine einfache ANOVA durchgeführt, gefolgt von Tukeys Test. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Die Knochenmikrostruktur der Tibia wurde mittels Mikro-CT untersucht
Die Behandlung von ovariektomierten Ratten mit BZBS reduzierte signifikant die OVX-induzierten trabekulären Strukturveränderungen. Wie in den rekonstruierten Mikro-CT-Bildern der rechten Tibia (Abbildung 1A,B) gezeigt, zeigte der trabekuläre Knochen in der OVX-Gruppe im Vergleich zur SHA-Gruppe eine signifikante Abnahme von BMD (A...

Diskussion

Nach der Ovariektomie sank der Östrogenspiegel aufgrund der kontinuierlichen Reduzierung des spongiösen Knochens und des erhöhten Knochenumsatzes stark ab. Im Wesentlichen kann eine verminderte Östrogensekretion nach der Menopause zu einem signifikanten Knochenverlust führen¹⁸, der bei ovariektomierten Ratten zu einem Ca2⁺-Verlust führt^19,20. Es wurde berichtet, dass die Einnahme von Östr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Proteintech Group, Inc.	23408-1AP-100
17-Beta-Estradiol ELISA kits	Proteintech Group, Inc.	21933-1-AP
3%H2O2	ShanDong LIRCON Medical Technology Incorporated Company	20221027
Anti-osteoprotegerin antibody	Abcam	ab203061
Bazibushen capsules	Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co. Ltd.	XB2103001
Biotin goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab207995
Calcium assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C004-2-1
Diaminobenzidine	ZSGB-BIO	ZLI-9018
Estradiol valerate tablets	Bayer AG	156A
Gene 1580R centrifuge	GENE Co. Ltd.	GZ422515090077
Image-Pro Plus	Media Cybernetics	IPP 6.0
Leica DM6000B Microscope (fully automated upright microscope system)	Leica	361715
Normal Goat Serum Blocking Solution	Vector Laboratories	S-1000-20
Phosphate assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C006-1-1
Phosphate buffered saline	Servicebio, Wuhan, China	CR10201M
Quantum GX2 microCT Imaging System	PerkinElmer	CLS149276
RANKL rabbit polyclonal antibody	Elabscience Biotechnology Co. Ltd.	E-EL-R3032-96T
Rat SOST (Sclerostin) ELISA kit	Elabscience Biotechnology Co. Ltd.	E-EL-R1405c-96T
Rat TRACP-5b (Tartrate Resistant Acid Phosphatase 5b) ELISA kit	Abcam	ab108667
Rat β-CTx (Beta Crosslaps) ELISA kit	Elabscience Biotechnology Co., Ltd.	E-EL-R0939c-96T
Sclerostin rabbit polyclonal antibody	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	SCXK(JING)2016-0006
Slide scanner	Hamamatsu Photonics K.K.	Nano Zoomer-SQ
Sprague Dawley female rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	ZLI-9381