Efeito semelhante ao estrogênio da cápsula Bazi Bushen em ratas ovariectomizadas

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para mostrar que a cápsula de Bazi Bushen (BZBS) pode regular a via de sinalização RANKL/OPG no modelo de roedor ovariectomizado através de seu efeito semelhante ao estrogênio.

Resumo

Este estudo tem como objetivo mostrar o efeito semelhante ao estrogênio da cápsula Bazi Bushen (BZBS), um composto fitoterápico chinês, em camundongos ovariectomizados. Ratas Sprague-Dawley (SD) foram divididas aleatoriamente em seis grupos: um grupo sham-operado, um grupo modelo (OVX), um grupo progynova e grupos BZBS (1, 2 e 4 d/kg/d). Uma ovariectomia foi realizada em todos os ratos, exceto aqueles no grupo operado simuladamente. A microtomografia computadorizada (micro-CT), a coloração de hematoxilina e eosina (H&E), a imuno-histoquímica e a detecção de ensaio imunoenzimático (ELISA) foram realizadas após 4 meses de tratamento com BZBS. Como resultado, em comparação com o grupo OVX, os ratos tratados com BZBS mostraram um aumento do número e da área de células do osso trabecular e da medula óssea e uma diminuição do número de células adiposas. O volume ósseo, o número trabecular e a espessura trabecular da tíbia direita nos grupos de medicação aumentaram e o espaço trabecular diminuiu. Os níveis de 17β-estradiol e cálcio sérico nos grupos de medicação estavam elevados, mas os níveis séricos de fósforo, esclerostina, β-CTX e TRACP-5b estavam diminuídos. Nos grupos de medicação, os níveis de RANKL e esclerostina diminuíram, enquanto o nível de osteoprotegerina (OPG) aumentou. Em conclusão, este protocolo avaliou sistematicamente os efeitos terapêuticos e potenciais mecanismos moleculares de compostos fitoterápicos chineses em ratas ovariectomizadas com uma variedade de técnicas.

Introdução

A osteoporose pós-menopausa (PMOP) é uma doença do sistema esquelético causada por função ovariana inadequada, diminuição do estrogênio e aumento da atividade dos osteoclastos¹, caracterizada por baixa massa óssea, degeneração microarquitetônica do tecido ósseo e danos à trabécula óssea. PMOP propenso a causar fraturas e pode ter sérios efeitos na qualidade de vida dos pacientes. A osteoporose afeta cerca de 200 milhões de pessoas em todo o mundo²; cerca de 40% das mulheres na pós-menopausa sofrem de osteoporose³, e as fraturas ocorrem em 33% das pacientes com PMOP⁴. A redução do estrogênio pode levar a uma atividade relativamente aumentada dos osteoclastos⁵ e diminuição da massa óssea quando a reabsorção óssea excede a formação óssea. Assim, a ativação dos osteoclastos é geralmente considerada um sinal de perda óssea⁶. Fisiologicamente, o RANKL/OPG serve como uma importante via envolvendo a remodelação óssea, regulando a ativação dos osteoclastos para promover a reabsorção óssea⁷. Enquanto isso, o estrogênio também pode mediar a formação e a função dos osteoclastos, regulando a sinalização RANKL / OPG⁸.

Nos últimos anos, a medicina tradicional tem sido cada vez mais utilizada para tratar diferentes doenças com menos reações adversas e melhor prognóstico ^9,10. A cápsula Bazi Bushen (BZBS), uma medicina tradicional chinesa, pode ser uma abordagem alternativa para prevenir e tratar a PMOP. É composto por Cuscuta, Fructus lycii, Fructus schisandrae, Fructus cnidii, Fructus rosae laevigatae (fruta rosa Cherokee), framboesa, sêmen Allii Tuberosi, Toosendan fructus, Herba epimedii, Morinda officinalis, Herba cistanches, Rehmannia glutinosa, raiz de cyathula medicinal, ginseng, chifre piloso e hipocampo Kelloggi (Tabela 1), contendo 11 tipos de fitoestrogênio com efeitos semelhantes aos hormônios. Um estudo anterior confirmou que o BZBS pode retardar a formação de placa ateromatosa por meio de um efeito semelhante ao estrogênio¹¹, que é semelhante ao tratamento da osteoporose com estrogênio¹². No entanto, os mecanismos subjacentes da BZBS na prevenção e tratamento da osteoporose causada pela deficiência de estrogênio não são claros. Portanto, o presente estudo teve como objetivo verificar se a BZBS tem um efeito protetor ósseo na osteoporose de ratos induzida por ovariectomia^13,14.

Protocolo

Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Pesquisa e Ética Animal do Instituto de Pesquisa Médica Hebei Yiling (número de aprovação: N2020150). As 36 ratas Sprague-Dawley (SD) (3 meses de idade, pesando 180-200 g) (ver Tabela de Materiais) foram alimentadas com comida normal e água limpa no novo centro de avaliação de medicamentos do Instituto de Pesquisa Médica Hebei Yiling e foram expostas à luz artificial por 12 h por dia em salas com temperatura controlada (20-26 °C) e umidade relativa (40%-70%).

1. Experiência animal

1. Divida os ratos em seis grupos aleatoriamente, um grupo operado de forma simulada (grupo SHAM, 10 mL / kg / d de solução salina), grupo modelo (grupo OVX, 10 mL / kg / d de solução salina), grupo progynova¹⁵ (0,2 mg / kg / d), grupo BZBS de baixa dose (grupo BZBSL, 1 g / kg / d), grupo BZBS de dose média (grupo BZBSM, 2 g / kg / d) e grupo BZBS de alta dose (grupo BZBSH, 4 g/kg/d).
   NOTA: A dose do grupo BZBSM foi determinada a partir das dosagens recomendadas para humanos e calculada da seguinte forma: dose experimental equivalente para ratos (mg / kg / d) = dose humana (mg / kg) / peso corporal (60 kg) x 6,3.
2. Empregue isoflurano a 3% e 1,5% para a indução e manutenção da anestesia em ratos durante toda a operação, respectivamente.
   NOTA: Se os ratos não piscarem e o reflexo pedal estiver ausente, a profundidade da anestesia é confirmada e a manutenção da anestesia do rato é realizada, respectivamente.
3. Remova o pêlo do abdômen do rato com uma lâmina esterilizada e desinfete a pele do abdômen do rato usando rodadas alternativas de etanol e iodopovidona 3 vezes com uma bola de algodão estéril. Aplique analgesia local com uma injeção tópica de 1,5 mg/kg de bupivacaína após a anestesia.
   NOTA: O método de desinfecção adota um padrão circular centrado ao redor da incisão e começando do centro para fora.
4. Realize uma incisão na linha média de 2 cm no abdômen do rato com um bisturi estéril no grupo SHAM e suture a incisão na linha média usando uma sutura cirúrgica 4-0.
   NOTA: Primeiro, a camada muscular interna é suturada com sutura absorvível e o fechamento externo/pele é suturado com monofilamento. No 10º dia, use uma tesoura para abrir o monofilamento e use uma pinça para extrair o monofilamento.
5. Para as ratas dos outros grupos, isole e exponha o ovário intacto usando uma pinça estéril e ligue a raiz do ovário usando uma sutura cirúrgica 4-0. Remova o ovário intacto usando uma tesoura cirúrgica estéril. Suturar a incisão da linha média usando uma sutura cirúrgica 4-0.
   NOTA: Todos os ratos pós-operatórios foram colocados em isolamento em recipientes a 37 °C até que os ratos estivessem acordados e capazes de se mover livremente.
6. Após 4 meses de administração intragástrica de medicamentos designados (na etapa 1.1), primeiro anestesiar o rato com isoflurano a 3%, usar creme depilatório para remover o pelo do dorso do rato e, em seguida, desinfetar a pele da virilha e todo o membro inferior usando etanol e iodopovidona 3x com uma bola de algodão estéril.
   NOTA: O medicamento foi administrado uma vez ao dia com agulha de gavagem de aço inoxidável de 10 cm. A dose de gavagem foi ajustada semanalmente de acordo com o peso dos ratos.
7. Corte e descasque a pele da virilha para expor a artéria femoral usando tesouras cirúrgicas estéreis e pinças. Colete uma amostra de sangue da artéria femoral usando um tubo de coleta de sangue a vácuo e, em seguida, aplique pressão para parar o sangramento com uma bola de algodão estéril. Eutanasiar os ratos com inalação excessiva de dióxido de carbono.
8. Continue a cortar e descascar a pele da virilha e do membro inferior para expor a tíbia intacta usando tesouras cirúrgicas estéreis e pinças. Após a remoção da tíbia, lave-a três vezes com soro fisiológico estéril e continue a remover o excesso de tecido muscular em solução salina com pinça e tesoura oftálmica.
9. Desinfete a pele posterior da lombar L4 usando etanol e iodopovidona 3x com uma bola de algodão estéril. Use tesouras cirúrgicas estéreis e pinças para cortar a pele das costas e expor a L4 lombar.
10. Corte as vértebras superior e inferior da L4 lombar com um rongeur e corte o sacro ao redor da L4 lombar com uma tesoura cirúrgica estéril. Lave a L4 lombar isolada com solução salina três vezes e continue a remover o excesso de tecido muscular em solução salina com pinças e microtesouras.
11. Armazene a tíbia e a vértebra L4 em fluido tecidual de formalina a 10% (consulte a Tabela de Materiais) em temperatura ambiente por 3 dias.
12. Embale a carcaça em um saco especial para cadáveres e coloque-a em um armário de armazenamento de carcaças de animais.

2. Imagem de micro-TC¹⁶

1. Pressione o botão liga/desliga verde para ligar o scanner micro-CT (consulte Tabela de Materiais) e inicie o software para aquecer a fonte de raios-x.
   NOTA: Para evitar a dispersão dos raios-x, mova quaisquer objetos metálicos para perto da área de imagem antes de começar. O exame de microtomografia computadorizada de tecido tibial de rato na etapa 1.11 com irradiação insuficiente de raios-x pode afetar os achados. O osso deve ser mantido úmido durante a microtomografia computadorizada. A cama do animal deve ser retirada durante o aquecimento. Certifique-se de que a chave esteja na posição ON na CHAVE DE SEGURANÇA no canto inferior esquerdo na frente do instrumento CT.
2. Crie um banco de dados clicando em um novo para criar um arquivo para salvar os dados a serem obtidos em seguida.
3. Defina os parâmetros de aquisição de dados na janela de controle do software da seguinte forma: tensão do tubo de raios X (50 kV); Corrente do tubo de raios X para TC (100 μA); corrente do tubo de raios X ao vivo (100 μA); campo de visão (FOV) (18 mm); sem técnica de gating; técnica de digitalização (alta resolução 4 min).
4. Lave a tíbia com soro fisiológico três vezes e seque o excesso de água com papel de filtro. Enrole o tecido da tíbia na cama com filme plástico para fixar sua posição. Ajuste o tecido da tíbia para o centro do campo de imagem girando o botão no instrumento.
5. Feche a porta do instrumento e ligue o modo ao vivo . Pressione o botão de captura para visualizar o tecido tibial.
6. Inicie a varredura clicando no botão de tomografia computadorizada . Clique em Sim para produzir a imagem.
   NOTA: Assim que o raio-x for ligado, a luz laranja na parte superior do instrumento acenderá e a porta deslizante não abrirá para a segurança do operador. Quando a digitalização estiver concluída, uma nova janela aparecerá no software 2D Viewer mostrando o eixo cruzado, o plano coronal e o plano sagital reconstruídos. Clique em Colar na prancheta para salvar.
7. Retire a tíbia da cama dos animais. Abra o software Analyze 12.0 e importe a imagem de TC objetiva clicando em Arquivo > Carregar > Processo. Clique nas opções Calculadora de imagem... e Painel de região para exibir a caixa de diálogo Sub-região .
   1. Clique na opção Interativa e selecione o osso na área de 2 mm de espessura. Clique em Aplicar para selecionar Alterar uma Cópia do Volume Carregado. Na tela Analisar 12.0 , clique na opção Aplicativos para selecionar BMA.
   2. Clique em Segmentar córtex e segmentar trabéculas e, em seguida, clique em Salvar mapa de objeto final. Clique em Medir osso para exibir o valor de indicadores de parâmetros específicos, incluindo densidade mineral óssea (DMO, g/cm³), fração de volume ósseo (volume de tecido ósseo/volume de tecido [BV/TV], %), número de trabéculas ósseas (Tb.N, 1/mm), espessura trabecular óssea (TB.Th, μm) e grau de separação trabecular (Tb.Sp, μm).
      NOTA: A micro-CT não foi realizada com vértebras L4.

3. Coloração de hematoxilina e eosina (H&E)

1. Retire as amostras de tíbia e vértebra L4 do rato na etapa 1.11 e armazene-as em solução de ácido fórmico a 20% para uma descalcificação de 4 dias.
   NOTA: A solução de ácido fórmico a 20% é preparada misturando 2.400 mL de solução de formaldeído e 600 mL de solução de ácido fórmico.
2. Coloque a amostra processada de tíbia e vértebra L4 do rato da etapa 3.1 na caixa de incorporação e lave-as com água corrente por mais de 6 h.
3. Desidrate as amostras com soluções de álcool de concentração gradiente (etanol 60% por 1 h, etanol 70% por 1 h, etanol 90% por 1 h, etanol 95% por 2 h e etanol 100% por 2 h) usando um processador de tecidos automatizado.
4. Coloque as amostras de tecido em xileno por 2 h para torná-las translúcidas. No final da desidratação, coloque as amostras permeabilizadas em cera de parafina a 60 °C por 3 h e incorpore-as em um processador automático.
5. Obtenha as seções de 4 μm usando um fatiador rotativo. Coloque as seções na coloração de hematoxilina por 3-8 min e na coloração de eosina por 1-3 min.
6. Transfira as seções manchadas para álcool puro e xileno, respectivamente. Sele e fixe as seções coradas com goma neutra para exame patológico sob um microscópio óptico.
7. Digitalize as fatias com um scanner de lâminas (consulte a Tabela de Materiais) com ampliação de 40x e use o software de visualização para adquirir os resultados da coloração H & E de toda a tíbia e vértebra L4.

4. Imuno-histoquímica

1. Execute a recuperação de epítopos induzida por calor usando as seções de tíbia de 4 μm obtidas na etapa 3.5. Adicione o tampão de reparo de antígeno apropriado (tampão de ácido cítrico, pH = 6,0) a um recipiente para micro-ondas. Coloque a folha de transporte no recipiente para micro-ondas e coloque o recipiente no forno de micro-ondas. Defina o programa para manter o reparo do antígeno por 20 min a 98 ° C.
2. Retire o recipiente e enxágue o interior com água fria da torneira por 10 min. Bloqueie a atividade da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio (3% H₂O₂) (consulte a Tabela de Materiais) e, em seguida, incube a fatia por 15 min à temperatura ambiente.
3. Lave as seções em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (consulte a Tabela de Materiais) três vezes, 5 min cada.
4. Colocar as secções numa solução normal de bloqueio do soro de cabra (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, incubar as amostras numa câmara húmida durante 15 min à temperatura ambiente.
5. Adicione 200 μL de anticorpo RANKL (1:200) (ver Tabela de Materiais), anticorpo OPG (1:300) (ver Tabela de Materiais) e anticorpo esclerostina¹⁷ (1:200) (ver Tabela de Materiais) nas amostras de fatias e incube por uma noite a 4 ° C no escuro.
   NOTA: A esclerostina é um regulador negativo do crescimento ósseo. É uma glicoproteína secretada com um domínio semelhante a um nó de cisteína C-terminal e tem uma sequência semelhante à família DAN de antagonistas de proteínas morfogenéticas ósseas¹⁷. Esta proteína não é membro da via RANKL.
6. Adicione IgG anti-coelho de cabra marcado com biotina (consulte a Tabela de Materiais) nas seções e incube em temperatura ambiente por 30 min. Enxágue as seções com PBS e use diaminobenzidina (DAB) (consulte a Tabela de Materiais) para manchar as seções por 3-5 min em temperatura ambiente.
7. Tinga as seções com hematoxilina por 1-2 min. Depois de desidratar e secar as seções, sele-as com goma neutra.
8. Digitalize as seções com ampliação de 40x usando um scanner de lâminas (consulte a Tabela de Materiais) e capture imagens digitais usando um sistema automático de imagem de microscópio (consulte a Tabela de Materiais).
9. Abra o software Imagepro Plus (consulte a Tabela de Materiais).
   1. Clique em Arquivo para importar a imagem de análise. Clique em Medir > calibração > Calibração de intensidade para correção de densidade óptica. Clique nas opções Medir, IOD, Contar/Tamanho e Selecionar cores uma a uma para exibir a interface de segmentação .
   2. Clique na opção Baseado em histograma para selecionar HIS e clique em Carregar arquivo. Clique em Contagem para gerar o valor do IOD e o valor da área .

5. Protocolo de ensaio imunoenzimático (ELISA)

1. Certifique-se de que o kit ELISA para detecção de 17β-estradiol inclua a microplaca revestida com IgG anti-17β-estradiol (12 x 8 poços), 15 mL de solução de parada, 22 mL de conjugado 17β-estradiol-HRP, 15 mL de solução de substrato de 3,3',5,5' tetrametilbenzidina (TMB), 50 mL de solução de lavagem 10x, folhas de cobertura, um suporte de tira, o controle de 17β-estradiol e um gradiente de concentração diferente do padrão de 17β-estradiol (consulte a Tabela de Materiais).
2. Retire o kit de 17β-estradiol do frigorífico e coloque todos os reagentes à temperatura ambiente (18-25 °C).
3. Preparação do reagente: Dilua a solução de lavagem 10x com água deionizada para preparar uma solução de lavagem 1x. Misture 50 mL de solução de lavagem 10x com 450 mL de água deionizada para fazer 500 mL de solução de lavagem 1x.
4. Retire a amostra de soro da geladeira e descongele-a em temperatura ambiente.
5. Retire as tiras de microtitulação em excesso da estrutura da placa, coloque-as de volta no saco de alumínio que contém a embalagem dessecante, feche-as novamente e guarde-as a 4 °C.
6. Adicione 25 μL de controle, padrão ou amostra a cada um de seus respectivos poços. Em seguida, adicione 200 μL de conjugado 17β-estradiol-HRP a cada poço.
7. Cobrir todos os poços com papel alumínio e incubar a placa a 37 °C durante 2 h.
8. Remova a folha e o líquido de cada poço e lave o poço três vezes com 300 μL de 1x solução de lavagem.
   NOTA: Evite o transbordamento dos poços de reação. Além disso, o tempo de imersão entre cada ciclo de lavagem deve ser de >5 s. No final, remova cuidadosamente o fluido restante batendo em tiras de papel de seda antes da próxima etapa.
9. Adicione 100 μL de solução de substrato TMB a cada poço e incube no escuro por 30 min em temperatura ambiente.
10. Adicione 100 μL de solução de parada a cada poço e agite suavemente a placa de microtitulação por 30 s. Meça a absorbância da amostra a 450 nm em 30 min.
11. Extrair a absorbância média dos padrões em relação à concentração. Plote a curva de melhor ajuste pelos pontos plotados.
12. Obter os valores de concentração correspondentes, expressos em pg/ml, interpolando os valores das amostras na curva-padrão.
    NOTA: Os outros protocolos para detecção de Ca²⁺ sérico, fósforo, SOST, TRACP-5b e β-CTX são os mesmos da medição de 17β-estradiol, de acordo com as instruções do fabricante.

6. Análise estatística

1. Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão. As comparações múltiplas foram realizadas por ANOVA one-way seguida do teste de Tukey. p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

A microestrutura óssea da tíbia foi avaliada por microtomografia computadorizada
O tratamento de ratas ovariectomizadas com BZBS reduziu significativamente as alterações estruturais trabeculares induzidas por OVX. Como mostrado nas imagens de micro-TC reconstruídas da tíbia direita (Figura 1A,B), o osso trabecular no grupo OVX mostrou uma diminuição significativa na DMO (Figura 1C), B...

Discussão

Após a ovariectomia, os níveis de estrogênio diminuíram drasticamente devido à redução contínua do osso esponjoso e ao aumento da renovação óssea. Essencialmente, a diminuição da secreção de estrogênio após a menopausa pode causar perda óssea significativa¹⁸, levando à perda de Ca²⁺ em ratas ovariectomizadas^19,20. Foi relatado que tomar estrogênio pode ajudar na recuperação...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Proteintech Group, Inc.	23408-1AP-100
17-Beta-Estradiol ELISA kits	Proteintech Group, Inc.	21933-1-AP
3%H2O2	ShanDong LIRCON Medical Technology Incorporated Company	20221027
Anti-osteoprotegerin antibody	Abcam	ab203061
Bazibushen capsules	Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co. Ltd.	XB2103001
Biotin goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab207995
Calcium assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C004-2-1
Diaminobenzidine	ZSGB-BIO	ZLI-9018
Estradiol valerate tablets	Bayer AG	156A
Gene 1580R centrifuge	GENE Co. Ltd.	GZ422515090077
Image-Pro Plus	Media Cybernetics	IPP 6.0
Leica DM6000B Microscope (fully automated upright microscope system)	Leica	361715
Normal Goat Serum Blocking Solution	Vector Laboratories	S-1000-20
Phosphate assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C006-1-1
Phosphate buffered saline	Servicebio, Wuhan, China	CR10201M
Quantum GX2 microCT Imaging System	PerkinElmer	CLS149276
RANKL rabbit polyclonal antibody	Elabscience Biotechnology Co. Ltd.	E-EL-R3032-96T
Rat SOST (Sclerostin) ELISA kit	Elabscience Biotechnology Co. Ltd.	E-EL-R1405c-96T
Rat TRACP-5b (Tartrate Resistant Acid Phosphatase 5b) ELISA kit	Abcam	ab108667
Rat β-CTx (Beta Crosslaps) ELISA kit	Elabscience Biotechnology Co., Ltd.	E-EL-R0939c-96T
Sclerostin rabbit polyclonal antibody	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	SCXK(JING)2016-0006
Slide scanner	Hamamatsu Photonics K.K.	Nano Zoomer-SQ
Sprague Dawley female rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	ZLI-9381