卵巣摘出ラットにおけるBazi Bushenカプセルのエストロゲン様効果

要約

ここで紹介するのは、Bazi Bushen カプセル (BZBS) が、エストロゲン様効果を通じて卵巣摘出齧歯類モデルの RANKL/OPG シグナル伝達経路を調節できることを示すプロトコルです。

要約

この研究は、卵巣摘出マウスにおける中国のハーブ化合物であるBazi Bushen カプセル (BZBS) のエストロゲン様効果を示すことを目的としています。雌のSprague-Dawley(SD)ラットを、偽操作グループ、モデルグループ(OVX)、プロギノバグループ、およびBZBSグループ(1、2、および4 d/kg/d)の6つのグループにランダムに分けました。卵巣摘出術は、偽手術群のラットを除くすべてのラットに対して行われました。マイクロコンピューター断層撮影(マイクロCT)スキャン、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色、免疫組織化学、および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)の検出は、BZBS治療の4か月後に行われました。その結果、OVX群と比較して、BZBSを投与したラットは、海綿骨および骨髄細胞の数と面積が増加し、脂肪細胞の数が減少しました。投薬群の右脛骨の骨量、海綿骨数、および海綿骨の厚さは増加し、小柱腔は減少しました。投薬群の17β-エストラジオールと血清カルシウムのレベルは上昇しましたが、血清リン、スクレロスチン、β-CTX、およびTRACP-5bのレベルは減少しました。.薬物療法群では、RANKLとスクレロスチンのレベルが減少し、オステオプロテゲリン(OPG)のレベルが増加しました。.結論として、このプロトコルは、さまざまな技術を用いて卵巣摘出ラットにおける漢方化合物の治療効果と潜在的な分子メカニズムを体系的に評価しました。

概要

閉経後骨粗鬆症(PMOP)は、卵巣機能の低下、エストロゲンの低下、破骨^{細胞活性の}亢進1によって引き起こされる骨格系疾患で、骨量の減少、骨組織の微細構造的変性、骨小柱の損傷を特徴としています。PMOPは骨折を引き起こしやすく、患者の生活の質に深刻な影響を与える可能性があります。骨粗鬆症は世界中で約2億人が罹患しています²。閉経後の女性の約40%が骨粗鬆症³に苦しんでおり、PMOP4患者の33%に骨折が生じています。エストロゲンの減少は、破骨^{細胞の活性}が比較的向上し5、骨吸収が骨形成を超えると骨量が減少する可能性があります。したがって、破骨細胞の活性化は通常、骨量減少の兆候と考えられています⁶。生理学的には、RANKL/OPGは、破骨細胞の活性化を調節して骨吸収を促進することにより、骨リモデリングに関与する重要な経路^{として機能します7。}一方、エストロゲンは、RANKL/OPG^{シグナル伝達を}調節することにより、破骨細胞の形成と機能を媒介することもできる8。

近年、伝統医学は、副作用が少なく、予後が良好なさまざまな病気の治療にますます使用されています^9,10。伝統的な漢方薬であるバジブシェンカプセル(BZBS)は、PMOPを予防および治療するための代替アプローチになる可能性があります。Cuscuta、Fructus lycii、Fructus schisandrae、Fructus cnidii、Fructus rosae laevigatae(チェロキーローズフルーツ)、ラズベリー、精液allii tuberosi、Toosendan fructus、Herba epimedii、Morinda officinalis、Herba cistanches、Rehmannia glutinosa、薬用cyathula根、高麗人参、Piloseの角、および海馬ケロギ(表1)には、ホルモン様作用を持つ11種類の植物性エストロゲンが含まれています。以前の研究では、BZBS がエストロゲン様効果¹¹ を通じてアテローム性プラークの形成を遅らせることができることが確認されています。これは、エストロゲンによる骨粗鬆症の治療に似ています¹²。しかし、エストロゲンの欠乏によって引き起こされる骨粗鬆症の予防と治療におけるBZBSの根本的なメカニズムは不明です。したがって、本研究は、BZBSが卵巣摘出術によるラット骨粗鬆症に対して骨保護効果を有するかどうかを確認することを目的としている^13,14。

プロトコル

動物実験は、河北宜陵医学研究所の動物研究と倫理委員会によって承認されました(承認番号:N2020150)。36匹のSprague-Dawley(SD)雌ラット(生後3か月、体重180-200g)( 材料表参照)に、河北宜陵医学研究所の新薬評価センターで通常の餌ときれいな水を与え、温度(20-26°C)と相対湿度(40%-70%)が制御された部屋で1日12時間人工光に曝露しました。

1. 動物実験

1. ラットを無作為に6つのグループに分けます:偽操作グループ(SHAMグループ、10 mL / kg / d生理食塩水)、モデルグループ(OVXグループ、10 mL / kg / d生理食塩水)、プロギノバ¹⁵ グループ(0.2 mg / kg / d)、低用量BZBSグループ(BZBSLグループ、1 g / kg / d)、中用量BZBSグループ(BZBSMグループ、2 g / kg / d)、および高用量BZBSグループ(BZBSHグループ、 4 g / kg / d)。
   注:BZBSMグループの用量は、ヒトの推奨用量から決定され、次のように計算されました:ラットの等価実験用量(mg / kg / d)=ヒト用量(mg / kg)/体重(60 kg)x 6.3。.
2. 手術中のラット麻酔の導入と維持にそれぞれ3%と1.5%のイソフルランを使用します。
   注:ラットがまばたきをせず、ペダル反射がない場合、麻酔の深さが確認され、ラット麻酔の維持がそれぞれ行われます。
3. 滅菌カミソリでラットの腹部の毛皮を取り除き、滅菌綿球でエタノールとポビドンヨードの代替ラウンドを使用してラットの腹部の皮膚を3回消毒します。麻酔後に1.5 mg / kgブピバカインの局所注射で局所鎮痛を適用します。.
   注:消毒方法は、切開部を中心に、中央から外側に向かって円形のパターンを採用しています。
4. SHAMグループの滅菌メスを使用してラットの腹部に2cmの正中線切開を行い、4-0外科用縫合糸を使用して正中線切開を縫合します。
   注:まず、内部の筋肉層を吸収性縫合糸で縫合し、外部/皮膚の閉鎖部をモノフィラメントで縫合します。10日目に、はさみを使ってモノフィラメントを切り開き、ピンセットでモノフィラメントを抽出します。
5. 他のグループのラットについては、滅菌鉗子を使用して無傷の卵巣を分離して露出させ、4-0外科用縫合糸を使用して卵巣の根元で結紮します。滅菌手術用ハサミを使用して無傷の卵巣を取り出します。4-0外科用縫合糸を使用して正中線切開を縫合します。
   注: すべての術後ラットは、ラットが目覚めて自由に動くことができるようになるまで、37°C容器に隔離されました。
6. 指定薬剤の胃内投与を4ヶ月後(ステップ1.1)、まずラットに3%イソフルランを麻酔し、脱毛クリームを用いてラットの背中から毛皮を取り除き、次にエタノールとポビドンヨード3xを用いて鼠径部と下肢全体の皮膚を滅菌コットンボールで消毒します。
   注:薬物は10cmのステンレス鋼の強制針で1日1回投与されました。強制経口投与は、ラットの体重に応じて毎週調整されました。
7. 鼠径部の皮膚を切って剥がし、滅菌済みの手術用ハサミとピンセットを使用して大腿動脈を露出させます。真空採血管を使用して大腿動脈から血液サンプルを採取し、滅菌綿球で圧力をかけて出血を止めます。二酸化炭素を過剰に吸入してラットを安楽死させます。
8. 鼠径部と下肢の皮膚を切開して剥がし続け、無傷の脛骨を無傷の手術用ハサミとピンセットを使用して露出させます。脛骨を切除した後、滅菌生理食塩水で3回洗い、ピンセットと眼科用ハサミで生理食塩水の余分な筋肉組織を引き続き取り除きます。
9. エタノールとポビドンヨード3xを使用して、滅菌コットンボールで腰椎L4の背中の皮膚を消毒します。.滅菌済みの手術用ハサミとピンセットを使用して、背中の皮膚を切断し、腰椎L4を露出させます。
10. 腰椎L4の上部と下部の椎骨をロンジャーで切断し、無菌の手術用ハサミで腰椎L4の周りの仙骨を切り取ります。分離された腰椎L4を生理食塩水で3回洗い、ピンセットとマイクロハサミで生理食塩水中の余分な筋肉組織を引き続き除去します。
11. 脛骨とL4椎骨を10%ホルマリン組織液( 材料の表を参照)に室温で3日間保存します。.
12. 死骸を専用の死体袋に詰め、動物の死骸収納キャビネットに入れます。

2. マイクロCTイメージング¹⁶

1. 緑色の電源ボタンを押してマイクロCTスキャナーの電源を入れ( 材料の表を参照)、X線源を加熱するソフトウェアを起動します。
   注意: X線の散乱を避けるために、開始する前にイメージングエリアの近くに金属物体を移動させてください。X線照射が不十分なステップ1.11でのラット脛骨組織のマイクロCT検査は、所見に影響を与える可能性があります。マイクロCTスキャン中は、骨を湿らせておく必要があります。動物のベッドは、ウォーミングアップ中に取り出す必要があります。CT機器の前にある左下隅にある SAFETY KEY のキーがONの位置に回されていることを確認してください。
2. 新しいデータベースをクリックしてデータベースを作成し、次に取得するデータを保存するためのファイルを作成します。
3. ソフトウェア制御ウィンドウでデータ収集パラメータを次のように設定します:X線管電圧(50 kV);CT X線管電流(100μA);生X線管電流(100μA);視野(FOV)(18 mm);ゲート技術はありません。スキャン技術(高解像度4分)。
4. 脛骨を生理食塩水で3回洗い、濾紙で余分な水分を拭き取ります。ベッドの上の脛骨ティッシュをプラスチックフィルムで包み、その位置を固定します。装置のボタンを回転させて、脛骨組織をイメージングフィールドの中心に調整します。
5. 楽器のドアを閉じ、 ライブ モードをオンにします。 キャプチャ ボタンを押して view 脛骨組織。
6. CTスキャンボタンをクリックしてスキャンを開始します。[はい] をクリックして画像を生成します。
   注意: X線がオンになると、機器の上部にあるオレンジ色のライトが点灯し、オペレーターの安全のためにスライドドアが開かなくなります。スキャンが完了すると、2D Viewerソフトウェアに新しいウィンドウが表示され、再構築された交差軸、冠状面、矢状面が表示されます。 [製図板に貼り付け ]をクリックして保存します。
7. 脛骨を動物のベッドから取り出します。 Analyze 12.0 ソフトウェアを開き、[ File]>[Load of Process ]をクリックして対物CT画像をインポートし>。 「Image Calculator... 」オプションと 「Region Pad 」オプションをクリックして、「 SubRegion 」ダイアログボックスを表示します。
   1. [Interactive] オプションをクリックし、厚さ 2 mm の領域でボーンを選択します。[Apply] をクリックして、[Change a Copy of the Loaded Volume] を選択します。[Analyze 12.0] 画面で、[Apps] オプションをクリックして [BMA] を選択します。
   2. 「Segment Cortex」と「Segment Trabeculae」をクリックし、「Save Final Object Map」をクリックします。[Measure Bone] をクリックすると、骨密度 (BMD, g/cm³)、骨体積分率 (骨組織体積/組織体積 [BV/TV], %) 、骨小柱数 (Tb.N, 1/mm)、骨小柱の厚さ (TB.Th, μm)、小柱分離度 (Tb.Sp, μm) などの特定のパラメータインジケータの値が表示されます。
      注:マイクロCTはL4椎骨では行われませんでした。

3. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色

1. ステップ1.11でラットの脛骨とL4椎骨のサンプルを取り出し、20%ギ酸溶液に保存して4日間の脱灰します。
   注:20%ギ酸溶液は、2,400mLのホルムアルデヒド溶液と600mLのギ酸溶液を混合して調製されます。
2. ステップ3.1でラットの脛骨とL4椎骨のサンプルを処理したものを埋め込みボックスに入れ、流水で6時間以上洗浄します。
3. 自動ティッシュプロセッサーを使用して、グラジエント濃度アルコール溶液(60%エタノールで1時間、70%エタノールで1時間、90%エタノールで1時間、95%エタノールで2時間、100%エタノールで2時間)でサンプルを脱水します。
4. 組織標本をキシレンに2時間置いて半透明にします。脱水処理の最後に、透過処理したサンプルをパラフィンワックスに60°Cで3時間入れ、自動処理装置に埋め込みます。
5. ロータリースライサーを使用して4μmの切片を取得します。切片をヘマトキシリン染色液に3〜8分間、エオシン染色液に1〜3分間置く。
6. 染色した切片をそれぞれ純アルコールとキシレンに移します。光学顕微鏡下での病理学的検査のために、染色された部分を中性ガムで密封して固定します。
7. スライドスキャナー( 材料の表を参照)でスライスを40倍に拡大してスキャンし、表示ソフトウェアを使用して脛骨全体とL4椎骨のH&E染色結果を取得します。

4. 免疫組織化学

1. ステップ3.5で得られた4μmの脛骨切片を用いて、熱誘起エピトープ賦活化を行います。適切な抗原修復バッファー(クエン酸バッファー、pH = 6.0)を電子レンジ対応容器に加えます。キャリアシートを電子レンジ対応容器に入れ、容器を電子レンジに入れます。抗原修復を98°Cで20分間保持するようにプログラムを設定します。
2. 容器を取り出し、内部を冷たい水道水で10分間すすぎます。過酸化水素(3% H₂O₂)で内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックし( 材料表を参照)、スライスを室温で15分間インキュベートします。
3. リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)( 材料表を参照)で切片を3回、各5分間洗浄します。
4. 切片を通常のヤギ血清ブロッキング溶液( 材料表を参照)に入れ、湿ったチャンバーでサンプルを室温で15分間インキュベートします。
5. 200 μL の RANKL 抗体 (1:200) ( 材料表参照)、OPG 抗体 (1:300) ( 材料表参照)、およびスクレロスチン抗体¹⁷ (1:200) ( 材料表参照) をスライスサンプルに加え、暗所 4 °C で一晩インキュベートします。
   注:スクレロスチンは骨成長の負の調節因子です。これは、C末端システイン結び目様ドメインを持つ分泌型糖タンパク質であり、骨形成タンパク質拮抗薬¹⁷のDANファミリーと配列が類似している。このタンパク質はRANKL経路のメンバーではありません。
6. ビオチン標識ヤギ抗ウサギIgG( 材料表を参照)を切片に添加し、室温で30分間インキュベートします。切片をPBSですすぎ、ジアミノベンジジン(DAB)( 材料表を参照)を使用して、室温で3〜5分間切片を染色します。
7. 切片をヘマトキシリンで1〜2分間染色します。切片を脱水して乾燥させた後、中性ガムで密封します。
8. スライドスキャナーを使用して40倍倍で切片をスキャンし( 「材料の表」を参照)、自動顕微鏡イメージングシステム( 「材料の表」を参照)を使用してデジタル画像をキャプチャします。
9. Imagepro Plus ソフトウェアを開きます (資料の表を参照)。
   1. [ファイル] をクリックして、解析画像をインポートします。「Measure > Calibration > Intensity Calibration をクリックして、光学濃度補正を行います。「メジャー」、「IOD」、「カウント/サイズ」、および「色の選択」オプションを 1 つずつクリックして、セグメンテーション インターフェイスを表示します。
   2. 「 ヒストグラム・ベース 」オプションをクリックして 「HIS 」を選択し、「 ファイルの読み込み」をクリックします。[ カウント ] をクリックして、 IOD 値と 面積 値を生成します。

5. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) プロトコール

1. 17β-エストラジオールを検出するためのELISAキットには、抗-17β-エストラジオールIgGコーティングマイクロプレート(12 x 8ウェル)、15 mLのストップ溶液、22 mLの17β-エストラジオール-HRPコンジュゲート、15 mLの3,3',5,5'テトラメチルベンジジン(TMB)基質溶液、50 mLの10倍洗浄液、カバーホイル、ストリップホルダー、17β-エストラジオールコントロール、および17β-エストラジオール標準の異なる濃度勾配が含まれていることを確認してください( 材料の表を参照)。
2. 17β-エストラジオールキットを冷蔵庫から取り出し、すべての試薬を室温(18-25°C)に置きます。
3. 試薬の調製:10倍洗浄液を脱イオン水で希釈し、1倍洗浄液を調製します。50 mLの10倍洗浄液と450 mLの脱イオン水を混合して、500 mLの1倍洗浄液を調製します。
4. 血清サンプルを冷蔵庫から取り出し、室温で解凍します。
5. プレートフレームから余分なマイクロタイターストリップを取り出し、乾燥剤パックが入ったホイルバッグに戻し、再度密封して、4°Cで保存します。
6. 25 μLのコントロール、スタンダード、またはサンプルをそれぞれのウェルに加えます。次に、200 μLの17β-エストラジオール-HRPコンジュゲートを各ウェルに加えます。
7. すべてのウェルをホイルで覆い、プレートを37°Cで2時間インキュベートします。
8. 各ウェルからホイルと液体を取り出し、1x洗浄液300μLでウェルを3回洗浄します。
   注:反応ウェルのオーバーフローを避けてください。また、各洗浄サイクル間の浸漬時間は>5秒である必要があります。最後に、次のステップの前にティッシュペーパーストリップを軽くたたいて、残りの液体を慎重に取り除きます。
9. 各ウェルに100 μLのTMB基質溶液を加え、暗所で室温で30分間インキュベートします。
10. 各ウェルに100 μLの停止溶液を加え、マイクロタイタープレートを30秒間静かに振とうします。450 nmでのサンプルの吸光度を30分以内に測定します。
11. 濃度に対する標準試料の平均吸光度を導きます。プロットされた点によって最適な曲線をプロットします。
12. 標準曲線上のサンプルの値を補間することにより、pg/mLで表される対応する濃度値を取得します。
    注:血清Ca²⁺、リン、SOST、TRACP-5b、およびβ-CTXを検出するための他のプロトコルは、製造元の指示に従って、17β-エストラジオール測定と同じです。

6. 統計分析

1. データは平均±標準偏差として示されました。多重比較は、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの検定によって実行されました。 p < 0.05は統計的に有意であると考えられました。

結果

脛骨の骨の微細構造をマイクロCTスキャンで評価した
卵巣摘出ラットのBZBSによる治療は、OVX誘発性線維柱帯構造変化を有意に減少させた。再構成された右脛骨のマイクロCT画像(図1A、B)に示されているように、OVX群の海綿骨は、SHAM群と比較して、BMD(図1C)、BV/TV(図1D)、Tb.Th(<...

ディスカッション

卵巣摘出術後、海綿骨の継続的な減少と骨代謝回転の増加により、エストロゲンレベルは急激に減少しました。基本的に、閉経後のエストロゲン分泌の減少は、卵巣摘出ラット^19,20の^Ca2+の損失につながる、重大な骨量減少を引き起こす可能性がある¹⁸。エストロゲンを服用すると、卵巣摘出ラット...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Proteintech Group, Inc.	23408-1AP-100
17-Beta-Estradiol ELISA kits	Proteintech Group, Inc.	21933-1-AP
3%H2O2	ShanDong LIRCON Medical Technology Incorporated Company	20221027
Anti-osteoprotegerin antibody	Abcam	ab203061
Bazibushen capsules	Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co. Ltd.	XB2103001
Biotin goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab207995
Calcium assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C004-2-1
Diaminobenzidine	ZSGB-BIO	ZLI-9018
Estradiol valerate tablets	Bayer AG	156A
Gene 1580R centrifuge	GENE Co. Ltd.	GZ422515090077
Image-Pro Plus	Media Cybernetics	IPP 6.0
Leica DM6000B Microscope (fully automated upright microscope system)	Leica	361715
Normal Goat Serum Blocking Solution	Vector Laboratories	S-1000-20
Phosphate assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C006-1-1
Phosphate buffered saline	Servicebio, Wuhan, China	CR10201M
Quantum GX2 microCT Imaging System	PerkinElmer	CLS149276
RANKL rabbit polyclonal antibody	Elabscience Biotechnology Co. Ltd.	E-EL-R3032-96T
Rat SOST (Sclerostin) ELISA kit	Elabscience Biotechnology Co. Ltd.	E-EL-R1405c-96T
Rat TRACP-5b (Tartrate Resistant Acid Phosphatase 5b) ELISA kit	Abcam	ab108667
Rat β-CTx (Beta Crosslaps) ELISA kit	Elabscience Biotechnology Co., Ltd.	E-EL-R0939c-96T
Sclerostin rabbit polyclonal antibody	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	SCXK(JING)2016-0006
Slide scanner	Hamamatsu Photonics K.K.	Nano Zoomer-SQ
Sprague Dawley female rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	ZLI-9381