使用甲酸铵的改进QuEChERS方法分析土壤样品中的有机氯农药

摘要

本协议描述了利用甲酸铵在QuEChERS中进行相分配，以及气相色谱-质谱法，以成功测定土壤样品中的有机氯农药残留。

摘要

目前，QuEChERS方法代表了全球使用最广泛的样品制备方案，用于分析官方和非官方实验室中各种基质中的农药残留。使用甲酸铵的QuEChERS方法以前已被证明与原始版本和两个正式版本相比是有利的。一方面，每克样品只需添加0.5 g甲酸铵，就足以诱导相分离，实现良好的分析性能。另一方面，甲酸铵减少了常规分析中的维护需求。本研究采用改进的甲酸铵QuEChERS方法同时分析农业土壤中的有机氯农药（OCP）残留。具体而言，将10 g样品用10 mL水水合，然后用10 mL乙腈萃取。接下来，使用5g甲酸铵进行相分离。离心后，上清液用无水硫酸镁、伯仲胺和十八烷基硅烷进行分散固相萃取净化步骤。采用气相色谱-质谱联用法进行分析。使用甲酸铵的QuEChERS方法被证明是从土壤样品中提取OCP残留物的成功替代方案。

引言

增加粮食产量的需要导致过去几十年中全球大量广泛使用杀虫剂。农药被施用于作物以保护它们免受害虫侵害并提高作物产量，但它们的残留物通常最终会进入土壤环境，尤其是在农业地区¹.此外，一些农药，如有机氯农药（OCPs），具有非常稳定的结构，因此它们的残留物不易分解，并在土壤中长期^存在2。通常，土壤具有很高的农药残留积累能力，特别是当其^{有机质含量}高时3。因此，土壤是受农药残留污染最严重的环境隔间之一。例如，迄今为止的一项完整研究发现，来自欧盟各地的 317 种农业土壤中有 83% 被一种或多种农药残留物污染⁴。

农药残留造成的土壤污染可能会通过食物链影响非目标物种、土壤功能和消费者健康，因为残留物具有高^毒性5，6。因此，评估土壤中的农药残留对于评估其对环境和人类健康的潜在负面影响至关重要，特别是在发展中国家，因为缺乏对农药使用的严格^规定7。这使得农药多残留分析变得越来越重要。然而，由于干扰物质数量多，浓度低，物理化学性质多样，土壤中农药残留的快速准确分析是一项艰巨^{的挑战4。}

在所有农药残留分析方法中，QuEChERS方法已成为最快、最简单、最便宜、最有效、最稳健和最安全的选择⁸。QuEChERS方法包括两个步骤。第一步，通过水层和乙腈层之间的盐析进行基于分配的微尺度萃取。在第二步中，采用分散固相萃取（dSPE）进行清洁过程;该技术使用少量的几种多孔吸附剂组合来去除基质干扰成分，并克服了传统SPE⁹的缺点。因此，QuEChERS是一种环保的方法，溶剂/化学品几乎没有浪费，可提供非常准确的结果，并最大限度地减少随机和系统错误的潜在来源。事实上，它已成功应用于数百种农药的高通量常规分析，在几乎所有类型的环境、农业食品和^{生物样品中}都具有很强的适用性8^，10。这项工作旨在应用和验证QuEChERS方法的新修改，该方法先前开发并与GC-MS偶联以分析农业土壤中的OCP。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

1. 储备溶液的制备

注意:建议在整个实验方案期间佩戴丁腈手套、实验室外套和安全眼镜。

1. 在 25 mL 容量瓶中以 2，000 mg/L 的 OCP 商业混合物（参见 材料表）制备 400 mg/L 的丙酮储备溶液，加入己烷:甲苯 （1:1） 中。 表 1 显示了每个选定的 OCP。
2. 在10 mL容量瓶中制备浓度为50 mg / L，1 mg / L和0.08 mg / L的丙酮后续储备溶液，并将其储存在-18°C的琥珀色玻璃小瓶中。
   注意:可以在整个工作中使用相同的溶液，但重要的是在每次使用后立即将它们存放在这些条件下。
3. 在10 mL容量瓶中制备浓度为20 mg / L和0.4 mg / L的丙酮储备溶液，浓度为4，4'-DDE-d8，丙酮溶液为100 mg / L，并储存在-18°C的琥珀色玻璃小瓶中。 使用 4，4'-DDE-d8 作为内标 （IS）。

2. 样品采集

1. 在玻璃容器中收集约0.5公斤农业土壤的上层10厘米。本研究的土壤对象是在马铃薯作物的传统农业区采集的。
   注意:用刮刀进行表面取样。然而，土壤的深度会影响其物理化学特性。因此，如果有机碳含量随深度变化，则需要在不同深度取样。
2. 将土壤样品带到实验室，用直径为1毫米的筛子过筛，并将其储存在琥珀色玻璃容器中直到4°C分析。
   注意:相同的土壤样品可以在整个工作中使用，但重要的是在每次使用后将其储存在这些条件下。

3. 使用甲酸铵通过改进的QuEChERS方法 制备 样品

注意: 图1 显示了修改后的QuEChERS方法的示意图。

1. 在 50 mL 离心管中称取 10 g 土壤样品，并以 20 mg/L 加入 50 μL 的 IS 溶液，得到 100 μg/kg。出于回收目的，还加入步骤1.2中制备的农药溶液，以产生10μg/ kg，50μg/ kg和200μg/ kg（每个n = 3）。
2. 使用涡旋摇动试管30秒，以更好地将尖峰整合到样品中。
3. 加入 10 mL 水。使用自动摇床以10 x g 摇动试管5分钟。
4. 加入 10 mL 乙腈。再次以10× g 摇动试管5分钟。
5. 加入5g甲酸铵（见 材料表），用手剧烈摇动试管1分钟，并以1，800× g 离心5分钟。
6. 将 1 mL 乙腈提取物转移到含有 150 mg 无水 MgSO₄、50 mg 伯仲胺 （PSA） 和 50 mg 十八烷基硅烷 （C₁₈） 的 2 mL 离心管中，用于通过分散固相萃取 （d-SPE）⁸ 净化目的，涡旋 30 秒，并以 1，800 x g 离心 5 分钟。
7. 将 200 μL 提取物转移到带有 300 μL 熔融插入物的适当标记的自动进样器样品瓶中，并使用 GC-MS 系统进行仪器分析（步骤 4）。
   注意:基质匹配校准按照与之前使用空白提取物相同的步骤进行，但在d-SPE步骤（步骤3.6）中在15 mL管中清洁5 mL上清液，直到步骤3.7才添加加标和IS溶液。将校准标准溶液加入自动进样器样品瓶中，得到5 μg/kg、10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg、200 μg/kg和400 μg/kg，蒸发至干，加入200 μL基质提取物。

4. 气相色谱-质谱仪仪器分析

1. 使用带有单个四极杆质谱仪和电子电离界面（−70 eV）的GC-MS系统进行GC-MS分析（参见 材料表）。
2. 将MS转移线设置为280°C，将离子源设置为230°C。
3. 使用5%苯基甲基聚硅氧烷30 m x 250 μm x 0.25 μm色谱柱（参见 材料表）和超高纯度He作为载气，恒定流速为1.2 mL/min。
4. 最初将GC炉保持在60°C下2分钟，然后以25°C / min的速度将温度升至160°C，并保持1分钟。然后，以15°C / min的速度将温度升至175°C，并保持3分钟。然后，以40°C / min的速度升至220°C，并保持3分钟。再次，以30°C / min的速度升至250°C，并保持2分钟。最后，以30°C / min的速度将温度降至310°C，并保持2分钟。总分析时间为 22.125 分钟。
5. 在每个序列之前对MS进行全自动调谐以及空气和水检查。
   1. 打开控制 GC-MS 系统所有参数的 MassHunter 采集软件。
      注意:仪器系统默认包括 MassHunter 采集软件。
   2. 打开工具栏上的"查看"选项，然后单击 真空控制，单击 调谐，然后单击 自动调谐。自动调谐将在几分钟后结束。
   3. 打开"查看"选项，然后单击 仪器控制。
   4. 单击" 是"，然后保存新的调谐文件以进行自动调谐。
   5. 打开工具栏上的"查看"选项，然后单击 真空控制，再次单击 "调谐 "，然后单击 "空气和水检查"。空气和水检查将在几秒钟后结束。
   6. 打开"查看"选项，然后单击 仪器控制。
   7. 单击" 是"，然后保存新的曲调文件以进行空气和水检查。
6. 在280°C的无分流模式下使用自动进样器（参见 材料表）进行进样，保持进样体积为1.5μL。 进样0.75分钟后，以40 mL/min的流速打开分流。
   注意:在两次进样之间，10μL注射器必须用乙酸乙酯洗涤三次，用环己烷洗涤三次。所有注射都是一式两份。
7. 在选定的离子监测（SIM）模式下分析分析物。这是具有单个四极杆的MS系统中使用的标准模式。
   注意: 表1 显示了保留时间（分钟）和定量参数，基于对OCP和IS使用一种定量和两种鉴定离子。定量分析基于定量离子的峰面积与IS离子的比值。

5. 数据采集

1. 打开控制 GC-MS 系统所有参数的 MassHunter 采集软件。
2. 打开工具栏上的"序列"选项，然后编辑序列，包括样品名称、样品瓶编号、进样次数、仪器方法和要生成的文件名。根据需要添加任意数量的行。
3. 单击" 确定"，然后保存新序列。
4. 再次打开工具栏上的"序列"选项，然后单击下拉菜单中的 "运行序列 "。将打开一个新窗口，以确认进样方法和保存样品的文件夹。再次单击 "运行序列 "，注射将开始。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

分析方法在线性、基质效应、回收率和重复性方面进行了全面验证。

线性评估使用六种浓度水平（5 μg/kg、10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg、200 μg/kg和400 μg/kg）加标空白样品的基质匹配校准曲线进行线性评估。所有OCP的决定系数（R²）均高于或等于0.99。最低校准水平（LCL）设定为5微克/千克，符合为食品应用监测目的确定的最大允许限值10微克/千克¹¹。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

QuEChERS方法的原始版本⁹和两个正式版本¹³，¹⁴使用硫酸镁与氯化钠^，乙酸盐或柠檬酸盐一起促进提取过程中的乙腈/水混合物分离。然而，这些盐倾向于以固体形式沉积在质谱（MS）源的表面上，这导致需要增加基于液相色谱（LC）-MS的方法的维护。在克服这些缺点方面，González-Curbelo等人¹⁵报告说，挥发性更强的甲酸铵?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL disposable glass conical centrifuge tubes	PYREX	99502-15
2 mL centrifuge tubes	Eppendorf	30120094
50 mL centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-169
5977B mass-selective detector	Agilent Technologies	1617R019
7820A gas chromatography system	Agilent Technologies	16162016
Acetone	Supelco	1006582500
Acetonitrile	VWR	83642320
Ammonium formate	VWR	21254260
Automatic shaker KS 3000 i control	IKA	3940000
Balance	Sartorius Lab Instruments Gmbh & Co	ENTRIS224I-1S
Bondesil-C18, 40 µm	Agilent Technologies	12213012
Bondesil-PSA, 40 µm	Agilent Technologies	12213024
Cyclohexane	VWR	85385320
EPA TCL pesticides mix	Sigma Aldrich	48913
Ethyl acetate	Supelco	1036492500
G4567A automatic sampler	Agilent Technologies	19490057
HP-5ms Ultra Inert (5%-phenyl)-methylpolysiloxane 30 m x 250 µm x 0.25 µm column	Agilent Technologies	19091S-433UI
Magnesium sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	434183-1KG
Mega Star 3.R centrifuge	VWR	521-1752
Milli-Q gradient A10	Millipore	RR400Q101
p,p'-DDE-d8	Dr Ehrenstorfer	DRE-XA12041100AC
Pipette tips 2 - 200 µL	BRAND	732008
Pipette tips 5 mL	BRAND	702595
Pipette tips 50 - 1000 uL	BRAND	732012
Pippette Transferpette S variabel 10 - 100 µL	BRAND	704774
Pippette Transferpette S variabel 100 - 1000 µL	BRAND	704780
Pippette Transferpette S variabel 20 - 200 µL	BRAND	704778
Pippette Transferpette S variabel 500 - 5000 µL	BRAND	704782
Vials with fused-in insert	Sigma Aldrich	29398-U
OCPs		CAS registry number
α-BHC		319-84-6
β-BHC		319-85-7
Lindane		58-89-9
δ-BHC		319-86-8
Heptachlor		76-44-8
Aldrin		309-00-2
Heptachlor epoxide		1024-57-3
α-Endosulfan		959-98-8
4,4'-DDE-d8 (IS)		93952-19-3
4,4'-DDE		72-55-9
Dieldrin		60-57-1
Endrin		72-20-8
β-Endosulfan		33213-65-9
4,4'-DDD		72-54-8
Endosulfan sulfate		1031-07-8
4,4'-DDT		50-29-3
Endrin ketone		53494-70-5
Methoxychlor		72-43-5