Analyse von Organochlorpestiziden in einer Bodenprobe mit einem modifizierten QuEChERS-Ansatz unter Verwendung von Ammoniumformiat

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Verwendung von Ammoniumformiat für die Phasenverteilung in QuEChERS, zusammen mit der Gaschromatographie-Massenspektrometrie, um organische Chlorpestizidrückstände in einer Bodenprobe erfolgreich zu bestimmen.

Zusammenfassung

Derzeit stellt die QuEChERS-Methode das weltweit am weitesten verbreitete Probenvorbereitungsprotokoll für die Analyse von Pestizidrückständen in einer Vielzahl von Matrices sowohl in offiziellen als auch in nicht-offiziellen Laboratorien dar. Das QuEChERS-Verfahren mit Ammoniumformiat hat sich bisher gegenüber dem Original und den beiden offiziellen Versionen als vorteilhaft erwiesen. Zum einen reicht die einfache Zugabe von 0,5 g Ammoniumformiat pro Gramm Probe aus, um eine Phasentrennung zu induzieren und eine gute analytische Leistung zu erzielen. Auf der anderen Seite reduziert Ammoniumformiat den Wartungsaufwand bei Routineanalysen. Hier wurde eine modifizierte QuEChERS-Methode unter Verwendung von Ammoniumformiat für die simultane Analyse von Organochlorpestizidrückständen (OCP) in landwirtschaftlichen Böden angewendet. Insbesondere wurden 10 g der Probe mit 10 ml Wasser hydratisiert und dann mit 10 ml Acetonitril extrahiert. Als nächstes wurde die Phasentrennung unter Verwendung von 5 g Ammoniumformiat durchgeführt. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand einem dispersiven Festphasenextraktionsreinigungsschritt mit wasserfreiem Magnesiumsulfat, primär-sekundärem Amin und Octadecylsilan unterzogen. Als Analysetechnik wurde die Gaschromatographie-Massenspektrometrie eingesetzt. Die QuEChERS-Methode unter Verwendung von Ammoniumformiat hat sich als erfolgreiche Alternative zur Extraktion von OCP-Rückständen aus einer Bodenprobe erwiesen.

Einleitung

Die Notwendigkeit, die Nahrungsmittelproduktion zu steigern, hat in den letzten Jahrzehnten weltweit zu einem intensiven und weit verbreiteten Einsatz von Pestiziden geführt. Pestizide werden auf die Pflanzen aufgebracht, um sie vor Schädlingen zu schützen und die Ernteerträge zu steigern, aber ihre Rückstände landen in der Regel in der Bodenumgebung, insbesondere in landwirtschaftlichen Gebieten¹. Darüber hinaus haben einige Pestizide, wie z.B. Organochlorpestizide (OCPs), eine sehr stabile Struktur, so dass sich ihre Rückstände nicht leicht zersetzen und lange im Boden verbleiben². Im Allgemeinen hat der Boden eine hohe Fähigkeit, Pestizidrückstände anzureichern, insbesondere wenn er einen hohen Gehalt an organischer Substanz³ aufweist. Infolgedessen ist der Boden eines der am stärksten durch Pestizidrückstände kontaminierten Umweltkompartimente. So ergab beispielsweise eine der bisherigen vollständigen Studien, dass 83 % der 317 landwirtschaftlichen Böden in der gesamten Europäischen Union mit einem oder mehreren Pestizidrückständen kontaminiert waren⁴.

Die Bodenverschmutzung durch Pestizidrückstände kann aufgrund der hohen Toxizität der Rückstände Auswirkungen auf nicht zu den Zielgruppen gehörende Arten, die Bodenfunktion und die Gesundheit der Verbraucher in der gesamten Lebensmittelkette beeinträchtigen ^5,6. Daher ist die Bewertung von Pestizidrückständen in Böden von wesentlicher Bedeutung, um ihre potenziellen negativen Auswirkungen auf die Umwelt und die menschliche Gesundheit zu bewerten, insbesondere in Entwicklungsländern, da es keine strengen Vorschriften für den Einsatz von Pestiziden gibt⁷. Daher gewinnt die Pestizid-Multi-Residuen-Analyse zunehmend an Bedeutung. Die schnelle und genaue Analyse von Pestizidrückständen in Böden ist jedoch aufgrund der großen Anzahl von Störstoffen sowie der geringen Konzentration und der vielfältigen physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Analyten eine schwierige Herausforderung⁴.

Von allen Methoden zur Analyse von Pestizidrückständen ist die QuEChERS-Methode die schnellste, einfachste, billigste, effektivste, robusteste und sicherste Option⁸. Die QuEChERS-Methode besteht aus zwei Schritten. Im ersten Schritt wird eine mikroskalige Extraktion durchgeführt, die auf der Trennung durch Aussalzen zwischen einer wässrigen und einer Acetonitrilschicht basiert. Im zweiten Schritt wird ein Reinigungsprozess mit einer dispersiven Festphasenextraktion (dSPE) durchgeführt; Diese Technik verwendet kleine Mengen mehrerer Kombinationen von porösen Sorptionsmitteln, um matrixstörende Komponenten zu entfernen und überwindet die Nachteile herkömmlicher SPE⁹. Daher ist der QuEChERS ein umweltfreundlicher Ansatz mit wenig Lösungsmittel/Chemikalien, der sehr genaue Ergebnisse liefert und potenzielle Quellen für zufällige und systematische Fehler minimiert. In der Tat wurde es erfolgreich für die Hochdurchsatz-Routineanalyse von Hunderten von Pestiziden eingesetzt, mit starker Anwendbarkeit in fast allen Arten von Umwelt-, Lebensmittel- und biologischen Proben ^8,10. Diese Arbeit zielt darauf ab, eine neue Modifikation der QuEChERS-Methode anzuwenden und zu validieren, die zuvor entwickelt und mit GC-MS gekoppelt wurde, um OCPs in landwirtschaftlichen Böden zu analysieren.

Protokoll

1. Vorbereitung der Stammlösungen

HINWEIS: Es wird empfohlen, während des gesamten Protokolls Nitrilhandschuhe, einen Laborkittel und eine Schutzbrille zu tragen.

1. Herstellen einer Stammlösung in Aceton mit 400 mg/l aus einer handelsüblichen Mischung von OCPs (siehe Materialtabelle) mit 2.000 mg/l in Hexan:Toluol (1:1) in einem 25-ml-Messkolben. Tabelle 1 zeigt die ausgewählten OCPs.
2. Die nachfolgenden Stammlösungen werden in Aceton in Konzentrationen von 50 mg/l, 1 mg/l und 0,08 mg/l in 10-ml-Meßkolben hergestellt und in Braunglasdurchstechflaschen bei −18 °C gelagert.
   HINWEIS: Die gleichen Lösungen können während der gesamten Arbeit verwendet werden, aber es ist wichtig, sie unter diesen Bedingungen direkt nach jedem Gebrauch zu lagern.
3. Die Stammlösungen werden in Aceton in Konzentrationen von 20 mg/l und 0,4 mg/l aus einem handelsüblichen Standard von 4,4'-DDE-d8 bei 100 mg/l in Aceton in 10-ml-Messkolben hergestellt und in Braunglasdurchstechflaschen bei −18 °C gelagert. Verwenden Sie 4,4'-DDE-d8 als internen Standard (IS).

2. Probenentnahme

1. Sammeln Sie ca. 0,5 kg der oberen 10 cm Schicht eines landwirtschaftlichen Bodens in einem Glasbehälter. Das Bodenobjekt dieser Studie wurde in einer traditionellen landwirtschaftlichen Zone des Kartoffelanbaus gesammelt.
   HINWEIS: Es wurde eine Oberflächenprobenahme mit einem Spachtel durchgeführt. Die Tiefe des Bodens könnte jedoch seine physikalisch-chemischen Eigenschaften beeinflussen. Wenn der Gehalt an organischem Kohlenstoff mit der Tiefe variiert, ist es daher notwendig, Proben in verschiedenen Tiefen zu entnehmen.
2. Die Bodenprobe wird ins Labor gebracht, mit einem Sieb von 1 mm Durchmesser gesiebt und bis zur Analyse bei 4 °C in einem Braunglasbehälter aufbewahrt.
   HINWEIS: Die gleiche Bodenprobe kann während der gesamten Arbeit verwendet werden, aber es ist wichtig, sie unter diesen Bedingungen direkt nach jedem Gebrauch zu lagern.

3. Probenvorbereitung nach der modifizierten QuEChERS-Methode unter Verwendung von Ammoniumformiat

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der modifizierten QuEChERS-Methode.

1. 10 g der Bodenprobe werden in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen eingewogen und 50 μl der IS-Lösung mit 20 mg/l zugegeben, um 100 μg/kg zu erhalten. Zu Rückgewinnungszwecken werden auch die in Schritt 1.2 hergestellten Pestizidlösungen zugegeben, um 10 μg/kg, 50 μg/kg und 200 μg/kg (jeweils n = 3) zu erhalten.
2. Schütteln Sie das Röhrchen 30 Sekunden lang mit einem Wirbel, um den Spike besser in die Probe zu integrieren.
3. Fügen Sie 10 ml Wasser hinzu. Schütteln Sie das Röhrchen mit einem automatischen Schüttelautomaten bei 10 x g für 5 Minuten.
4. Fügen Sie 10 ml Acetonitril hinzu. Schütteln Sie die Tube erneut bei 10 x g für 5 min.
5. Fügen Sie 5 g Ammoniumformiat hinzu (siehe Materialtabelle), schütteln Sie das Röhrchen kräftig für 1 min mit der Hand und zentrifugieren Sie bei 1.800 x g für 5 min.
6. 1 ml des Acetonitril-Extrakts in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen mit 150 mg wasserfreiem MgSO₄, 50 mg primär-sekundärem Amin (PSA) und 50 mg Octadecylsilan (C₁₈) (siehe Materialtabelle) zu Reinigungszwecken durch dispersive Festphasenextraktion (d-SPE)⁸, Wirbel für 30 s und Zentrifuge bei 1.800 x g für 5 min.
7. Übertragen Sie 200 μL des Extrakts in ein entsprechend markiertes Autosampler-Fläschchen mit einem 300 μL Schmelzeinsatz und führen Sie eine instrumentelle Analyse mit einem GC-MS-System durch (Schritt 4).
   ANMERKUNG: Die matrixangepasste Kalibrierung wird nach den gleichen Schritten wie zuvor unter Verwendung von Blindextrakten durchgeführt, jedoch werden 5 ml des Überstands in 15-ml-Röhrchen im d-SPE-Schritt (Schritt 3.6) gereinigt und die Spike- und IS-Lösungen werden erst in Schritt 3.7 hinzugefügt. Geben Sie die Kalibrierstandardlösungen in die Durchstechflaschen des Autosamplers, um 5 μg/kg, 10 μg/kg, 50 μg/kg, 100 μg/kg, 200 μg/kg und 400 μg/kg zu erhalten, verdampfen Sie bis zur Trockne und fügen Sie 200 μl der Matrixextrakte hinzu.

4. Instrumentelle Analytik mittels GC-MS

1. Führen Sie die GC-MS-Analysen mit einem GC-MS-System mit einem einzigen Quadrupol-Massenspektrometer und einer Elektronenionisationsschnittstelle (−70 eV) durch (siehe Materialtabelle).
2. Stellen Sie die MS-Transferleitung auf 280 °C und die Ionenquelle auf 230 °C ein.
3. Verwenden Sie eine 5%ige Phenyl-Methylpolysiloxan-Säule von 30 m x 250 μm x 0,25 μm (siehe Materialtabelle) und ultrahochreines He als Trägergas bei einer konstanten Durchflussrate von 1,2 ml/min.
4. Halten Sie den GC-Ofen zunächst 2 Minuten lang auf 60 °C, dann erhöhen Sie die Temperatur auf 160 °C bei 25 °C/min und halten Sie ihn 1 Minute lang. Erhöhen Sie dann die Temperatur auf 175 °C bei 15 °C/min und halten Sie sie 3 Minuten lang. Dann auf 220 °C bei 40 °C/min erhöhen und 3 Minuten halten. Wieder auf 250 °C bei 30 °C/min erhöhen und 2 Minuten halten. Zum Schluss die Temperatur auf 310 °C bei 30 °C/min bringen und 2 Minuten halten. Die gesamte Analysezeit beträgt 22.125 min.
5. Führen Sie vor jeder Sequenz ein vollständiges Autotune und einen Luft- und Wassertest der MS durch.
   1. Öffnen Sie die MassHunter-Erfassungssoftware, die alle Parameter des GC-MS-Systems steuert.
      HINWEIS: Das Instrumentensystem enthält standardmäßig die MassHunter-Erfassungssoftware.
   2. Öffnen Sie die Option "Ansicht" in der Symbolleiste und klicken Sie auf Vakuumsteuerung, klicken Sie auf Tune und klicken Sie auf Autotune. Das Autotune endet nach einigen Minuten.
   3. Öffnen Sie die Option "Ansicht" und klicken Sie auf Instrumentensteuerung.
   4. Klicken Sie auf Ja und speichern Sie die neue Tune-Datei für das Autotune.
   5. Öffnen Sie die Option "Ansicht" in der Symbolleiste und klicken Sie auf Vakuumsteuerung, klicken Sie erneut auf Abstimmung und klicken Sie auf Luft- und Wasserprüfung. Die Luft- und Wasserkontrolle endet nach wenigen Sekunden.
   6. Öffnen Sie die Option "Ansicht" und klicken Sie auf Instrumentensteuerung.
   7. Klicken Sie auf Ja und speichern Sie die neue Tune-Datei für den Luft- und Wassercheck.
6. Führen Sie die Injektion mit einem Autosampler (siehe Materialtabelle) bei 280 °C im Splitless-Modus durch, wobei das Injektionsvolumen bei 1,5 μL gehalten wird. Nach 0,75 min der Injektion wird der Split bei einer Durchflussrate von 40 ml/min geöffnet.
   HINWEIS: Zwischen den Injektionen muss die 10-μl-Spritze dreimal mit Ethylacetat und dreimal mit Cyclohexan gewaschen werden. Alle Injektionen sind in doppelter Ausfertigung.
7. Analysieren Sie die Analyten im ausgewählten Ionenüberwachungsmodus (SIM). Dies ist der Standardmodus, der in MS-Systemen mit einem einzelnen Quadrupol verwendet wird.
   ANMERKUNG: Tabelle 1 zeigt die Retentionszeiten (min) und die Quantifizierungsparameter basierend auf einer Quantifizierung und zwei Identifikationsionen für die OCPs und die IS. Die quantitative Analyse basiert auf dem Verhältnis der Peakfläche des Quantifizierungsions zum IS-Ion.

5. Datenerfassung

1. Öffnen Sie die MassHunter-Erfassungssoftware, die alle Parameter des GC-MS-Systems steuert.
2. Öffnen Sie die Option "Sequenz" in der Symbolleiste und bearbeiten Sie die Sequenz, einschließlich des Probennamens, der Fläschchennummer, der Anzahl der Injektionen, der instrumentellen Methode und des Namens der zu generierenden Datei. Fügen Sie so viele Zeilen wie nötig hinzu.
3. Klicken Sie auf OK und speichern Sie die neue Sequenz.
4. Öffnen Sie erneut die Option "Sequenz" in der Symbolleiste und klicken Sie im Dropdown-Menü auf Sequenz ausführen . Es öffnet sich ein neues Fenster, in dem Sie die Injektionsmethode und den Ordner, in dem die Proben gespeichert werden, bestätigen können. Klicken Sie erneut auf Sequenz ausführen , und die Injektion beginnt.

Ergebnisse

Die vollständige Validierung der analytischen Methode wurde in Bezug auf Linearität, Matrixeffekte, Wiederfindung und Wiederholbarkeit durchgeführt.

Für die Linearitätsbeurteilung wurden matrixangepasste Kalibrierkurven mit spitzen Blindproben in sechs Konzentrationsstufen (5 μg/kg, 10 μg/kg, 50 μg/kg, 100 μg/kg, 200 μg/kg und 400 μg/kg) verwendet. Die Bestimmungskoeffizienten (^R2) waren für alle OCPs größer oder gleich 0,99. Der niedrigste Kalibrierwert (LCL) wurde au...

Diskussion

Die ursprüngliche⁹ und die beiden offiziellen Versionen¹³, ¹⁴ der QuEChERS-Methode verwenden Magnesiumsulfat zusammen mit Natriumchlorid-, Acetat- oder Citratsalzen^, um die Trennung von Acetonitril und Wassergemisch während der Extraktion zu fördern. Diese Salze neigen jedoch dazu, als Feststoffe auf den Oberflächen in der Massenspektrometrie (MS) -Quelle abgeschieden zu werden, was zu einer erhöhten Wartung von Flüssigchromatographi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL disposable glass conical centrifuge tubes	PYREX	99502-15
2 mL centrifuge tubes	Eppendorf	30120094
50 mL centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-169
5977B mass-selective detector	Agilent Technologies	1617R019
7820A gas chromatography system	Agilent Technologies	16162016
Acetone	Supelco	1006582500
Acetonitrile	VWR	83642320
Ammonium formate	VWR	21254260
Automatic shaker KS 3000 i control	IKA	3940000
Balance	Sartorius Lab Instruments Gmbh & Co	ENTRIS224I-1S
Bondesil-C18, 40 µm	Agilent Technologies	12213012
Bondesil-PSA, 40 µm	Agilent Technologies	12213024
Cyclohexane	VWR	85385320
EPA TCL pesticides mix	Sigma Aldrich	48913
Ethyl acetate	Supelco	1036492500
G4567A automatic sampler	Agilent Technologies	19490057
HP-5ms Ultra Inert (5%-phenyl)-methylpolysiloxane 30 m x 250 µm x 0.25 µm column	Agilent Technologies	19091S-433UI
Magnesium sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	434183-1KG
Mega Star 3.R centrifuge	VWR	521-1752
Milli-Q gradient A10	Millipore	RR400Q101
p,p'-DDE-d8	Dr Ehrenstorfer	DRE-XA12041100AC
Pipette tips 2 - 200 µL	BRAND	732008
Pipette tips 5 mL	BRAND	702595
Pipette tips 50 - 1000 uL	BRAND	732012
Pippette Transferpette S variabel 10 - 100 µL	BRAND	704774
Pippette Transferpette S variabel 100 - 1000 µL	BRAND	704780
Pippette Transferpette S variabel 20 - 200 µL	BRAND	704778
Pippette Transferpette S variabel 500 - 5000 µL	BRAND	704782
Vials with fused-in insert	Sigma Aldrich	29398-U
OCPs		CAS registry number
α-BHC		319-84-6
β-BHC		319-85-7
Lindane		58-89-9
δ-BHC		319-86-8
Heptachlor		76-44-8
Aldrin		309-00-2
Heptachlor epoxide		1024-57-3
α-Endosulfan		959-98-8
4,4'-DDE-d8 (IS)		93952-19-3
4,4'-DDE		72-55-9
Dieldrin		60-57-1
Endrin		72-20-8
β-Endosulfan		33213-65-9
4,4'-DDD		72-54-8
Endosulfan sulfate		1031-07-8
4,4'-DDT		50-29-3
Endrin ketone		53494-70-5
Methoxychlor		72-43-5