Análise de pesticidas organoclorados em uma amostra de solo por uma abordagem QuEChERS modificada usando formato de amônio

Resumo

O presente protocolo descreve a utilização de formato de amônio para particionamento de fases em QuEChERS, juntamente com cromatografia gasosa-espectrometria de massa, para determinar com sucesso resíduos de pesticidas organoclorados em uma amostra de solo.

Resumo

Atualmente, o método QuEChERS representa o protocolo de preparação de amostras mais utilizado em todo o mundo para a análise de resíduos de pesticidas em uma ampla variedade de matrizes, tanto em laboratórios oficiais quanto não oficiais. O método QuEChERS usando formato de amônio já provou ser vantajoso em comparação com as versões original e oficial. Por um lado, a simples adição de 0,5 g de formato de amónio por grama de amostra é suficiente para induzir a separação de fases e alcançar um bom desempenho analítico. Por outro lado, o formato de amônio reduz a necessidade de manutenção em análises de rotina. Aqui, um método QuEChERS modificado utilizando formato de amônio foi aplicado para a análise simultânea de resíduos de pesticidas organoclorados (OCP) em solo agrícola. Especificamente, 10 g da amostra foram hidratados com 10 mL de água e, em seguida, extraídos com 10 mL de acetonitrila. Em seguida, a separação de fases foi realizada com 5 g de formato de amônio. Após a centrifugação, o sobrenadante foi submetido a uma etapa de limpeza de extração em fase sólida dispersiva com sulfato de magnésio anidro, amina primária-secundária e octadecilsilano. Cromatografia gasosa-espectrometria de massas foi utilizada como técnica analítica. O método QuEChERS usando formato de amônio é demonstrado como uma alternativa bem-sucedida para extrair resíduos de OCP de uma amostra de solo.

Introdução

A necessidade de aumentar a produção de alimentos levou ao uso intensivo e generalizado de pesticidas em todo o mundo nas últimas décadas. Os pesticidas são aplicados nas lavouras para protegê-las de pragas e aumentar o rendimento das culturas, mas seus resíduos geralmente acabam no ambiente do solo, especialmente nas áreas agrícolas¹. Além disso, alguns pesticidas, como os pesticidas organoclorados (OCPs), possuem uma estrutura muito estável, de modo que seus resíduos não se decompõem facilmente e persistem no solo por muito tempo². Geralmente, o solo tem alta capacidade de acumular resíduos de agrotóxicos, principalmente quando apresenta alto teor de matéria orgânica³. Como resultado, o solo é um dos compartimentos ambientais mais contaminados por resíduos de pesticidas. A título de exemplo, um dos estudos completos até à data constatou que 83% dos 317 solos agrícolas de toda a União Europeia estavam contaminados com um ou mais resíduos de pesticidas⁴.

A poluição do solo por resíduos de pesticidas pode afetar espécies não visadas, a função do solo e a saúde do consumidor ao longo da cadeia alimentar, devido à alta toxicidade dos resíduos ^5,6. Consequentemente, a avaliação de resíduos de pesticidas em solos é essencial para avaliar seus potenciais efeitos negativos sobre o meio ambiente e a saúde humana, particularmente nos países em desenvolvimento, devido à falta de regulamentação rigorosa sobre o uso de pesticidas⁷. Isso torna a análise de múltiplos resíduos de pesticidas cada vez mais importante. No entanto, a análise rápida e precisa dos resíduos de agrotóxicos nos solos é um desafio difícil devido ao grande número de substâncias interferentes, bem como ao baixo nível de concentração e às diversas propriedades físico-químicas desses analitos⁴.

De todos os métodos de análise de resíduos de pesticidas, o método QuEChERS tornou-se a opção mais rápida, fácil, barata, eficaz, robusta e segura⁸. O método QuEChERS envolve duas etapas. Na primeira etapa, é realizada uma extração em microescala baseada na particionamento via salga entre uma camada aquosa e uma de acetonitrila. Na segunda etapa, um processo de limpeza é realizado empregando uma extração dispersiva em fase sólida (dSPE); esta técnica utiliza pequenas quantidades de várias combinações de sorventes porosos para remover componentes que interferem na matriz e supera as desvantagens do SPE convencional⁹. Assim, o QuEChERS é uma abordagem ambientalmente amigável com pouco solvente / produto químico indo para o desperdício que fornece resultados muito precisos e minimiza fontes potenciais de erros aleatórios e sistemáticos. De fato, tem sido aplicado com sucesso para a análise rotineira de alto rendimento de centenas de agrotóxicos, com forte aplicabilidade em quase todos os tipos de amostras ambientais, agroalimentares e biológicas ^8,10. Este trabalho tem como objetivo aplicar e validar uma nova modificação do método QuEChERS que foi previamente desenvolvido e acoplado ao GC-MS para analisar OCPs em solo agrícola.

Protocolo

1. Preparação das soluções-mãe

NOTA: Recomenda-se o uso de luvas nitrílicas, jaleco de laboratório e óculos de segurança durante todo o protocolo.

1. Preparar uma solução-mãe em acetona a 400 mg/L a partir de uma mistura comercial de OCP (ver Tabela de Materiais) a 2 000 mg/L em hexano:tolueno (1:1) num balão aferido de 25 ml. A Tabela 1 mostra cada um dos OCPs selecionados.
2. Preparar as soluções-mãe subsequentes em acetona nas concentrações de 50 mg/L, 1 mg/L e 0,08 mg/L em frascos volumétricos de 10 ml e guardá-las em frascos para injetáveis de vidro âmbar a -18 °C.
   NOTA: As mesmas soluções podem ser usadas durante todo o trabalho, mas é importante armazená-las nessas condições logo após cada uso.
3. Preparar as soluções-mãe em acetona nas concentrações de 20 mg/L e 0,4 mg/L a partir de um padrão comercial de 4,4'-DDE-d8 a 100 mg/L em acetona em balões aferidos de 10 ml e conservar em frascos para injetáveis de vidro âmbar a -18 °C. Use 4,4'-DDE-d8 como um padrão interno (IS).

2. Coleta de amostras

1. Coletar aproximadamente 0,5 kg da camada superior de 10 cm de um solo agrícola em um recipiente de vidro. O solo objeto deste trabalho foi coletado em uma zona agrícola tradicional de culturas de batata.
   NOTA: Realizou-se amostragem superficial com espátula. No entanto, a profundidade do solo pode influenciar suas características físico-químicas. Portanto, se o teor de carbono orgânico varia com a profundidade, é necessário coletar amostras em diferentes profundidades.
2. Levar a amostra de solo ao laboratório, peneirar-a com uma peneira de 1 mm de diâmetro e armazená-la até à análise a 4 °C num recipiente de vidro âmbar.
   NOTA: A mesma amostra de solo pode ser usada durante todo o trabalho, mas é importante armazená-la nessas condições logo após cada uso.

3. Preparação da amostra através do método QuEChERS modificado utilizando formato de amónio

NOTA: A Figura 1 mostra uma representação esquemática do método QuEChERS modificado.

1. Pesar 10 g da amostra de solo num tubo de centrífuga de 50 ml e adicionar 50 μL da solução de SI a 20 mg/L para obter 100 μg/kg. Para efeitos de recuperação, adicionar também as soluções de pesticidas preparadas na etapa 1.2 para produzir 10 μg/kg, 50 μg/kg e 200 μg/kg (n = 3 cada).
2. Agite o tubo usando um vórtice por 30 s para integrar melhor o pico na amostra.
3. Adicione 10 mL de água. Agite o tubo utilizando um agitador automático a 10 x g durante 5 minutos.
4. Adicionar 10 mL de acetonitrila. Agite o tubo novamente a 10 x g durante 5 minutos.
5. Adicionar 5 g de formato de amónio (ver Tabela de Materiais), agitar o tubo vigorosamente durante 1 min à mão e centrifugar a 1.800 x g durante 5 min.
6. Transferir 1 mL do extrato de acetonitrila para um tubo de centrífuga de 2 mL contendo 150 mg de MgSO₄ anidro, 50 mg de amina primária-secundária (PSA) e 50 mg de octadecilsilano (C₁₈) (ver Tabela de Materiais) para fins de limpeza por extração de fase sólido-dispersiva (d-SPE)⁸, vórtice por 30 s e centrífuga a 1.800 x g por 5 min.
7. Transfira 200 μL do extracto para um frasco para injetáveis de amostrador automático devidamente rotulado com uma inserção fundida de 300 μL e efectue uma análise instrumental utilizando um sistema GC-MS (passo 4).
   NOTA: A calibração combinada com matriz é realizada seguindo as mesmas etapas que anteriormente usando extratos em branco, mas 5 mL do sobrenadante são limpos em tubos de 15 mL na etapa d-SPE (etapa 3.6) e as soluções spike e IS não são adicionadas até a etapa 3.7. Adicionar as soluções-padrão de calibração nos frascos para injetáveis do amostrador automático para produzir 5 μg/kg, 10 μg/kg, 50 μg/kg, 100 μg/kg, 200 μg/kg e 400 μg/kg, evaporar até à secura e adicionar 200 μL dos extractos da matriz.

4. Análise instrumental por GC-MS

1. Realizar as análises GC-MS usando um sistema GC-MS com um único espectrômetro de massa quadrupolo e uma interface de ionização eletrônica (-70 eV) (ver Tabela de Materiais).
2. Ajuste a linha de transferência MS a 280 °C e a fonte iónica a 230 °C.
3. Use uma coluna de 5%-fenil-metilpolissiloxano 30 m x 250 μm x 0,25 μm (ver Tabela de Materiais) e um He de pureza ultra-alta como gás transportador a uma taxa de fluxo constante de 1,2 mL/min.
4. Manter o forno GC a 60 °C inicialmente durante 2 min, depois aumentar a temperatura para 160 °C a 25 °C/min e manter a temperatura durante 1 min. Em seguida, aumente a temperatura para 175 °C a 15 °C/min e segure por 3 min. Em seguida, aumente para 220 °C a 40 °C/min e segure por 3 min. Novamente, aumente para 250 °C a 30 °C/min e segure por 2 min. Finalmente, leve a temperatura a 310 °C a 30 °C/min e segure por 2 min. O tempo total de análise é de 22.125 min.
5. Realize um autotune completo e uma verificação de ar e água do MS antes de cada sequência.
   1. Abra o software de aquisição MassHunter que controla todos os parâmetros do sistema GC-MS.
      NOTA: O sistema de instrumentos inclui o software de aquisição MassHunter por padrão.
   2. Abra a opção "Visualizar" na barra de ferramentas e clique em Controle de vácuo, clique em Ajustar e clique em Autotune. O autotune terminará após alguns minutos.
   3. Abra a opção "Visualizar" e clique em Controle de instrumentos.
   4. Clique em Sim e salve o novo arquivo de sintonia para o autotune.
   5. Abra a opção "Visualizar" na barra de ferramentas e clique em Controle de vácuo, clique em Sintonizar novamente e clique em Verificar ar e Água. A verificação de ar e água terminará após alguns segundos.
   6. Abra a opção "Visualizar" e clique em Controle de instrumentos.
   7. Clique em Sim e salve o novo arquivo de sintonia para a verificação de ar e água.
6. Efectuar a injecção utilizando um amostrador automático (ver Tabela de Materiais) a 280 °C no modo splitless, mantendo o volume de injeção 1,5 μL. Após 0,75 min da injecção, abra a fractura a um caudal de 40 ml/min.
   NOTA: Entre as injecções, a seringa de 10 μL deve ser lavada três vezes com acetato de etila e três vezes com ciclohexano. Todas as injeções estão em duplicata.
7. Analise os analitos no modo de monitoramento de íons selecionados (SIM). Este é o modo padrão usado em sistemas MS com um único quadrupolo.
   NOTA: A Tabela 1 mostra os tempos de retenção (min) e os parâmetros de quantificação com base no uso de uma quantificação e dois íons de identificação para os OCPs e o IS. A análise quantitativa baseia-se na razão entre a área de pico da ião de quantificação e o íon de SI.

5. Aquisição de dados

1. Abra o software de aquisição MassHunter que controla todos os parâmetros do sistema GC-MS.
2. Abra a opção "Sequência" na barra de ferramentas e edite a sequência, incluindo o nome da amostra, o número do frasco para injetáveis, o número de injeções, o método instrumental e o nome do ficheiro a gerar. Adicione quantas linhas forem necessárias.
3. Clique em OK e salve a nova sequência.
4. Abra a opção "Sequência" na barra de ferramentas novamente e clique em Executar sequência no menu suspenso. Uma nova janela será aberta para confirmar o método de injeção e a pasta onde as amostras serão salvas. Clique em Executar sequência novamente, e a injeção começará.

Resultados

A validação completa do método analítico foi realizada em termos de linearidade, efeitos matriciais, recuperação e repetibilidade.

Curvas de calibração pareadas por matriz com amostras em branco cravadas em seis níveis de concentração (5 μg/kg, 10 μg/kg, 50 μg/kg, 100 μg/kg, 200 μg/kg e 400 μg/kg) foram utilizadas para a avaliação da linearidade. Os coeficientes de determinação (R²) foram maiores ou iguais a 0,99 para todos os OCPs. O menor nível de calibraçã...

Discussão

O⁹ original e as duas versões oficiais^13,14 do método QuEChERS usam sulfato de magnésio juntamente com sais de cloreto de sódio, acetato ou citrato para promover a separação da mistura acetonitrila/água durante a extração. No entanto, esses sais tendem a ser depositados como sólidos nas superfícies na fonte de espectrometria de massa (MS), o que causa a necessidade de maior manutenção de métodos baseados em cromatografia líq...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL disposable glass conical centrifuge tubes	PYREX	99502-15
2 mL centrifuge tubes	Eppendorf	30120094
50 mL centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-169
5977B mass-selective detector	Agilent Technologies	1617R019
7820A gas chromatography system	Agilent Technologies	16162016
Acetone	Supelco	1006582500
Acetonitrile	VWR	83642320
Ammonium formate	VWR	21254260
Automatic shaker KS 3000 i control	IKA	3940000
Balance	Sartorius Lab Instruments Gmbh & Co	ENTRIS224I-1S
Bondesil-C18, 40 µm	Agilent Technologies	12213012
Bondesil-PSA, 40 µm	Agilent Technologies	12213024
Cyclohexane	VWR	85385320
EPA TCL pesticides mix	Sigma Aldrich	48913
Ethyl acetate	Supelco	1036492500
G4567A automatic sampler	Agilent Technologies	19490057
HP-5ms Ultra Inert (5%-phenyl)-methylpolysiloxane 30 m x 250 µm x 0.25 µm column	Agilent Technologies	19091S-433UI
Magnesium sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	434183-1KG
Mega Star 3.R centrifuge	VWR	521-1752
Milli-Q gradient A10	Millipore	RR400Q101
p,p'-DDE-d8	Dr Ehrenstorfer	DRE-XA12041100AC
Pipette tips 2 - 200 µL	BRAND	732008
Pipette tips 5 mL	BRAND	702595
Pipette tips 50 - 1000 uL	BRAND	732012
Pippette Transferpette S variabel 10 - 100 µL	BRAND	704774
Pippette Transferpette S variabel 100 - 1000 µL	BRAND	704780
Pippette Transferpette S variabel 20 - 200 µL	BRAND	704778
Pippette Transferpette S variabel 500 - 5000 µL	BRAND	704782
Vials with fused-in insert	Sigma Aldrich	29398-U
OCPs		CAS registry number
α-BHC		319-84-6
β-BHC		319-85-7
Lindane		58-89-9
δ-BHC		319-86-8
Heptachlor		76-44-8
Aldrin		309-00-2
Heptachlor epoxide		1024-57-3
α-Endosulfan		959-98-8
4,4'-DDE-d8 (IS)		93952-19-3
4,4'-DDE		72-55-9
Dieldrin		60-57-1
Endrin		72-20-8
β-Endosulfan		33213-65-9
4,4'-DDD		72-54-8
Endosulfan sulfate		1031-07-8
4,4'-DDT		50-29-3
Endrin ketone		53494-70-5
Methoxychlor		72-43-5