포름산암모늄을 사용한 수정된 QuEChERS 접근법에 의한 토양 샘플의 유기염소 살충제 분석

요약

본 프로토콜은 토양 샘플에서 유기염소 농약 잔류물을 성공적으로 측정하기 위해 가스 크로마토그래피-질량분석법과 함께 QuEChERS에서 상 분할을 위한 포름산암모늄의 활용을 설명합니다.

초록

현재 QuEChERS 방법은 공식 및 비공식 실험실의 다양한 매트릭스에서 잔류 농약을 분석하기 위해 전 세계적으로 가장 널리 사용되는 샘플 준비 프로토콜을 나타냅니다. 포름산 암모늄을 사용하는 QuEChERS 방법은 이전에 원래 버전과 두 가지 공식 버전에 비해 유리한 것으로 입증되었습니다. 한편으로, 샘플 그램 당 0.5g의 포름산 암모늄을 간단히 첨가하면 상 분리를 유도하고 우수한 분석 성능을 달성하기에 충분합니다. 반면에 포름산 암모늄은 일상적인 분석에서 유지 보수의 필요성을 줄여줍니다. 여기에서는 포름산 암모늄을 사용하는 변형 된 QuEChERS 방법을 농업 토양의 유기 염소 살충제 (OCP) 잔류 물의 동시 분석에 적용했습니다. 구체적으로, 시료 10g을 물 10mL로 수화시킨 후 아세토니트릴 10mL로 추출하였다. 다음에, 5 g 의 포름산 암모늄을 사용하여 상 분리를 수행하였다. 원심분리 후, 상청액을 무수 황산마그네슘, 1차-2차 아민 및 옥타데실실란을 사용한 분산 고체상 추출 클린업 단계를 거쳤다. 가스 크로마토 그래피-질량 분석법이 분석 기술로 사용되었습니다. 포름산 암모늄을 사용하는 QuEChERS 방법은 토양 샘플에서 OCP 잔류물을 추출하기 위한 성공적인 대안으로 입증되었습니다.

서문

식량 생산을 늘릴 필요성으로 인해 지난 수십 년 동안 전 세계적으로 살충제가 집중적이고 광범위하게 사용되었습니다. 살충제는 해충으로부터 보호하고 작물 수확량을 증가시키기 위해 작물에 적용되지만 잔류 물은 일반적으로 토양 환경, 특히 농업 지역에서 끝납니다¹. 또한 유기 염소 살충제 (OCP)와 같은 일부 살충제는 구조가 매우 안정적이어서 잔류 물이 쉽게 분해되지 않고 토양에 오랫동안 남아 있습니다². 일반적으로 토양은 특히 유기물 함량이 높은 경우 잔류 농약을 축적 할 수있는 능력이 높습니다³. 결과적으로 토양은 잔류 농약으로 가장 오염 된 환경 구획 중 하나입니다. 예를 들어, 현재까지의 완전한 연구 중 하나는 유럽 연합 전역의 317 개 농업 토양 중 83 %가 하나 이상의 잔류 농약으로 오염 된 것으로 나타났습니다⁴.

잔류 농약에 의한 토양 오염은 잔류 물^5,6의 높은 독성으로 인해 먹이 사슬을 통해 비 표적 종^, 토양 기능 및 소비자 건강에 영향을 미칠 수 있습니다. 결과적으로, 토양의 잔류 농약 평가는 특히 살충제 사용에 대한 엄격한 규정이 없기 때문에 개발 도상국에서 환경 및 인체 건강에 대한 잠재적 인 부정적인 영향을 평가하는 데 필수적입니다⁷. 이로 인해 살충제 다중 잔류 물 분석이 점점 더 중요 해지고 있습니다. 그러나, 토양에서 잔류 농약의 신속하고 정확한 분석은 많은 수의 간섭 물질뿐만 아니라 이러한 분석 물질의 낮은 농도 수준 및 다양한 물리 화학적 특성으로 인해 어려운 과제입니다⁴.

모든 잔류 농약 분석 방법 중에서 QuEChERS 방법은 가장 빠르고, 쉽고, 저렴하고, 가장 효과적이고, 강력하고, 안전한 옵션⁸이 되었습니다. QuEChERS 방법에는 두 단계가 포함됩니다. 첫 번째 단계에서는 수성 층과 아세토니트릴 층 사이의 염석을 통한 분할을 기반으로 하는 마이크로 스케일 추출이 수행됩니다. 제 2 단계에서, 분산 고체상 추출 (dSPE)을 채용하여 세정 공정이 수행되고; 이 기술은 소량의 다공성 흡착제 조합을 사용하여 매트릭스 간섭 성분을 제거하고 기존 SPE⁹의 단점을 극복합니다. 따라서 QuEChERS는 매우 정확한 결과를 제공하고 무작위 및 시스템 오류의 잠재적 원인을 최소화하는 용매/화학 물질 낭비가 거의 없는 환경 친화적인 접근 방식입니다. 실제로 수백 가지 살충제의 고처리량 일상 분석에 성공적으로 적용되었으며 거의 모든 유형의 환경, 농식품 및 생물학적 샘플 ^8,10에 강력하게 적용할 수 있습니다. 이 작업은 농업 토양에서 OCP를 분석하기 위해 이전에 개발되고 GC-MS에 결합된 QuEChERS 분석법의 새로운 수정을 적용하고 검증하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

1. 저장 용액의 준비

알림: 전체 프로토콜 동안 니트릴 장갑, 실험실 코트 및 보안경을 착용하는 것이 좋습니다.

1. 25mL 부피 플라스크에서 헥산:톨루엔(1:1)에서 2,000mg/L의 OCP( 재료 표 참조)의 상업적 혼합물로부터 400mg/L의 아세톤 원액을 준비합니다. 표 1 은 선택된 각 OCP를 보여줍니다.
2. 후속 저장 용액을 10mL 부피 플라스크에서 50mg/L, 1mg/L 및 0.08mg/L 농도의 아세톤으로 준비하고 -18°C에서 호박색 유리 바이알에 보관합니다.
   알림: 작업 전반에 걸쳐 동일한 솔루션을 사용할 수 있지만 매번 사용한 직후에 이러한 조건에서 보관하는 것이 중요합니다.
3. 10mL 부피 플라스크의 아세톤에서 100mg/L의 4,4'-DDE-d8의 상업 표준에서 20mg/L 및 0.4mg/L의 농도로 아세톤의 스톡 용액을 준비하고 -18°C의 호박색 유리 바이알에 저장합니다. 4,4'-DDE-d8을 내부 표준(IS)으로 사용합니다.

2. 샘플 수집

1. 유리 용기에 농업 토양의 상부 10cm 층의 약 0.5kg을 모으십시오. 본 연구의 토양 대상체는 감자 작물의 전통적인 농업 지역에서 수집되었다.
   참고: 주걱으로 표면 샘플링을 수행했습니다. 그러나 토양의 깊이는 물리 화학적 특성에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 유기 탄소 함량이 깊이에 따라 달라지면 다른 깊이에서 샘플을 채취해야합니다.
2. 토양 샘플을 실험실로 가져가 직경 1mm 체로 체로 치고 4 ° C에서 분석 될 때까지 호박색 유리 용기에 보관하십시오.
   알림: 작업 전반에 걸쳐 동일한 토양 샘플을 사용할 수 있지만 매번 사용 직후에 이러한 조건에서 보관하는 것이 중요합니다.

3. 포름산암모늄을 사용한 변형된 QuEChERS 방법을 통한 시료 전처리

참고: 그림 1 은 수정된 QuEChERS 분석법의 개략도를 보여줍니다.

1. 50mL 원심분리 튜브에 토양 샘플 10g을 칭량하고 IS 용액 50μL를 20mg/L로 추가하여 100μg/kg을 산출합니다. 회수 목적으로 1.2단계에서 준비한 살충제 용액을 추가하여 10μg/kg, 50μg/kg 및 200μg/kg(각각 n = 3)을 산출합니다.
2. 스파이크를 샘플에 더 잘 통합하기 위해 와류를 사용하여 튜브를 30초 동안 흔듭니다.
3. 물 10mL를 추가합니다. 10 x g 의 자동 셰이커를 사용하여 튜브를 5분 동안 흔듭니다.
4. 아세토 니트릴 10mL를 첨가하십시오. 튜브를 10 x g 에서 5분 동안 다시 흔듭니다.
5. 포름산 암모늄 5g을 넣고 ( 재료 표 참조) 튜브를 손으로 1 분 동안 세게 흔든 다음 1,800 x g 에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
6. 아세토니트릴 추출물 1mL를 무수 MgSO₄ 150mg, 1차 2차 아민(PSA) 50mg 및 옥타데실실란(_C18) 50mg이 포함된 2mL 원심분리 튜브에 옮깁니다( 재료 표 참조) 분산 고체상 추출(d-SPE)⁸, 30초 동안 와동, 1,800 x g 에서 5분 동안 원심분리.
7. 추출물 200μL를 300μL 융합 삽입물이 있는 적절하게 라벨링된 자동 시료 주입기 바이알로 옮기고 GC-MS 시스템을 사용하여 기기 분석을 수행합니다(4단계).
   알림: 매트릭스 일치 보정은 이전에 블랭크 추출물을 사용한 것과 동일한 단계에 따라 수행되지만 d-SPE 단계(3.6단계)에서 5mL의 상청액을 15mL 튜브에서 세척하고 스파이크 및 IS 용액은 3.7단계까지 추가하지 않습니다. 자동 시료 주입기 바이알에 교정 표준 용액을 추가하여 5 μg/kg, 10 μg/kg, 50 μg/kg, 100 μg/kg, 200 μg/kg 및 400 μg/kg을 생성하고 증발하여 건조시킨 다음 200μL의 매트릭스 추출물을 추가합니다.

4. GC-MS에 의한 기기 분석

1. 단일 사중극자 질량분석기와 전자 이온화 계면(-70eV)이 있는 GC-MS 시스템을 사용하여 GC-MS 분석을 수행합니다( 재료 표 참조).
2. MS 이송 라인을 280°C로 설정하고 이온 소스를 230°C로 설정합니다.
3. 5%-페닐-메틸폴리실록산 30m x 250μm x 0.25μm 컬럼( 재료 표 참조) 및 초고순도 He를 1.2mL/min의 일정한 유속으로 캐리어 가스로 사용합니다.
4. GC 오븐을 처음에 60°C에서 2분 동안 유지한 다음 25°C/min에서 온도를 160°C로 높이고 1분 동안 유지합니다. 그런 다음 15 °C / min에서 175 °C로 온도를 높이고 3 분 동안 유지합니다. 그런 다음 40°C/min에서 220°C로 증가시키고 3분 동안 유지합니다. 다시 30°C/min에서 250°C로 증가시키고 2분 동안 유지합니다. 마지막으로 온도를 30°C/min에서 310°C로 가져가 2분 동안 유지합니다. 총 분석 시간은 22.125 분입니다.
5. 각 시퀀스 전에 MS의 완전 자동 튜닝 및 공기 및 물 검사를 수행합니다.
   1. GC-MS 시스템의 모든 파라미터를 제어하는 매스헌터 획득 소프트웨어를 엽니다.
      알림: 기기 시스템에는 기본적으로 MassHunter 획득 소프트웨어가 포함되어 있습니다.
   2. 도구 모음에서 "보기" 옵션을 열고 진공 제어를 클릭하고 조정을 클릭한 다음 자동 조정을 클릭합니다. 자동 튜닝은 몇 분 후에 종료됩니다.
   3. "보기" 옵션을 열고 계측기 제어를 클릭합니다.
   4. Yes( 예)를 클릭하고 자동 튜닝을 위해 새 튜닝 파일을 저장합니다.
   5. 도구 모음에서 "보기" 옵션을 열고 진공 제어를 클릭하고 조정을 다시 클릭한 다음 Air & Water check를 클릭합니다. 공기 및 물 검사는 몇 초 후에 종료됩니다.
   6. "보기" 옵션을 열고 계측기 제어를 클릭합니다.
   7. 예를 클릭하고 공기 및 물 검사를 위해 새 튜닝 파일을 저장합니다.
6. 주입 부피를 1.5 μL로 유지하면서 분할되지 않은 모드에서 280 ° C에서 자동 시료 주입기 ( 재료 표 참조)를 사용하여 주입을 수행합니다. 주입 0.75 분 후, 40 mL / min 유속으로 분할을 엽니 다.
   알림: 주사 사이에 10 μL 주사기는 에틸 아세테이트로 세 번, 시클로 헥산으로 세 번 씻어야합니다. 모든 주사는 중복됩니다.
7. 선택한 이온 모니터링(SIM) 모드에서 분석물을 분석합니다. 이것은 단일 사중극자가 있는 MS 시스템에서 사용되는 표준 모드입니다.
   참고: 표 1 은 OCP 및 IS에 대해 하나의 정량 및 두 개의 식별 이온을 사용한 것을 기반으로 한 머무름 시간(최소) 및 정량화 매개변수를 보여줍니다. 정량 분석은 정량 이온의 피크 면적과 IS의 이온의 비율에 기초한다.

5. 데이터 수집

1. GC-MS 시스템의 모든 파라미터를 제어하는 매스헌터 획득 소프트웨어를 엽니다.
2. 도구 모음에서 "시퀀스" 옵션을 열고 샘플 이름, 바이알 번호, 주입 횟수, 기기 방법 및 생성할 파일 이름을 포함한 시퀀스를 편집합니다. 필요한 만큼 행을 추가합니다.
3. 확인을 클릭하고 새 시퀀스를 저장합니다.
4. 도구 모음에서 "시퀀스" 옵션을 다시 열고 드롭다운 메뉴에서 Run Sequence (시퀀스 실행)를 클릭합니다. 주입 방법과 샘플을 저장할 폴더를 확인하는 새 창이 열립니다. 시퀀스 실행을 다시 클릭하면 주입이 시작됩니다.

결과

분석 방법의 전체 검증은 선형성, 매트릭스 효과, 회수율 및 반복성 측면에서 수행되었습니다.

선형성 평가를 위해 6가지 농도 수준(5μg/kg, 10μg/kg, 50μg/kg, 100μg/kg, 200μg/kg 및 400μg/kg)에서 스파이크된 블랭크 샘플이 있는 매트릭스 일치 검량선을 사용했습니다. 결정 계수(^R2)는 모든 OCP에 대해 0.99 이상이었다. 최저 교정 수준(LCL)은 5μg/kg으로 설정되었으며, 이는 식품 응?...

토론

QuEChERS 방법의 원래⁹ 및 두 공식 버전^13,14는 황산마그네슘을 염화나트륨^, 아세테이트 또는 구연산염 염과 함께 사용하여 추출 중에 아세토니트릴/물 혼합물 분리를 촉진합니다. 그러나 이러한 염은 질량 분석법(MS) 소스의 표면에 고체로 증착되는 경향이 있으므로 액체 크로마토그래피(LC)-MS 기반 방법의 유지 관리가 증가합니다. 이러한...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL disposable glass conical centrifuge tubes	PYREX	99502-15
2 mL centrifuge tubes	Eppendorf	30120094
50 mL centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-169
5977B mass-selective detector	Agilent Technologies	1617R019
7820A gas chromatography system	Agilent Technologies	16162016
Acetone	Supelco	1006582500
Acetonitrile	VWR	83642320
Ammonium formate	VWR	21254260
Automatic shaker KS 3000 i control	IKA	3940000
Balance	Sartorius Lab Instruments Gmbh & Co	ENTRIS224I-1S
Bondesil-C18, 40 µm	Agilent Technologies	12213012
Bondesil-PSA, 40 µm	Agilent Technologies	12213024
Cyclohexane	VWR	85385320
EPA TCL pesticides mix	Sigma Aldrich	48913
Ethyl acetate	Supelco	1036492500
G4567A automatic sampler	Agilent Technologies	19490057
HP-5ms Ultra Inert (5%-phenyl)-methylpolysiloxane 30 m x 250 µm x 0.25 µm column	Agilent Technologies	19091S-433UI
Magnesium sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	434183-1KG
Mega Star 3.R centrifuge	VWR	521-1752
Milli-Q gradient A10	Millipore	RR400Q101
p,p'-DDE-d8	Dr Ehrenstorfer	DRE-XA12041100AC
Pipette tips 2 - 200 µL	BRAND	732008
Pipette tips 5 mL	BRAND	702595
Pipette tips 50 - 1000 uL	BRAND	732012
Pippette Transferpette S variabel 10 - 100 µL	BRAND	704774
Pippette Transferpette S variabel 100 - 1000 µL	BRAND	704780
Pippette Transferpette S variabel 20 - 200 µL	BRAND	704778
Pippette Transferpette S variabel 500 - 5000 µL	BRAND	704782
Vials with fused-in insert	Sigma Aldrich	29398-U
OCPs		CAS registry number
α-BHC		319-84-6
β-BHC		319-85-7
Lindane		58-89-9
δ-BHC		319-86-8
Heptachlor		76-44-8
Aldrin		309-00-2
Heptachlor epoxide		1024-57-3
α-Endosulfan		959-98-8
4,4'-DDE-d8 (IS)		93952-19-3
4,4'-DDE		72-55-9
Dieldrin		60-57-1
Endrin		72-20-8
β-Endosulfan		33213-65-9
4,4'-DDD		72-54-8
Endosulfan sulfate		1031-07-8
4,4'-DDT		50-29-3
Endrin ketone		53494-70-5
Methoxychlor		72-43-5