ギ酸アンモニウムを用いた改変QuEChERS法による土壌試料中の有機塩素系農薬の分析

要約

本プロトコルは、土壌サンプル中の有機塩素系農薬残留物の測定を成功させるために、QuEChERSの相分配にギ酸アンモニウムを利用する方法をガスクロマトグラフィー質量分析とともに説明しています。

要約

現在、QuEChERSメソッドは、公式および非公式の両方のラボで、さまざまなマトリックスの残留農薬を分析するために世界中で最も広く使用されているサンプル調製プロトコルを表しています。ギ酸アンモニウムを使用するQuEChERS法は、オリジナルおよび2つの公式バージョンと比較して有利であることが以前に証明されています。一方では、サンプル1グラム当たり0.5gのギ酸アンモニウムを添加するだけで、相分離を誘導し、良好な分析性能を達成するのに十分である。一方、ギ酸アンモニウムは、日常的な分析におけるメンテナンスの必要性を低減します。ここでは、ギ酸アンモニウムを用いた修飾QuEChERS法を農業土壌中の有機塩素系農薬(OCP)残留物の同時分析に適用した。具体的には、試料10gを水10mLで水和した後、アセトニトリル10mLで抽出した。次に、5gのギ酸アンモニウムを用いて相分離を行った。遠心分離後、上清を無水硫酸マグネシウム、1級-2級アミン、およびオクタデシルシランによる分散固相抽出クリーンアップ工程に供した。分析技術としてガスクロマトグラフィー-質量分析法を使用した。ギ酸アンモニウムを用いたQuEChERS法は、土壌サンプルからOCP残留物を抽出するための成功した代替手段として実証されています。

概要

食糧生産を増やす必要性は、過去数十年にわたって世界中で農薬の集中的かつ広範な使用につながりました。農薬は害虫から作物を保護し、作物の収量を増やすために作物に適用されますが、それらの残留物は通常、土壌環境、特に農業地域に行き着きます¹。さらに、有機塩素系農薬(OCP)などの一部の農薬は非常に安定した構造をしているため、残留物は分解しにくく、土壌中に長期間存続します²。一般に、土壌は、特に有機物の含有量が高い場合、残留農薬を蓄積する能力が高い^3。その結果、土壌は残留農薬によって最も汚染された環境区画の1つです。一例として、これまでの完全な研究の1つでは、欧州連合全土からの317の農業土壌の83%が1つ以上の残留農薬で汚染されていることがわかりました⁴。

残留農薬による土壌汚染は、残留物の毒性が高いため、食物連鎖を通じて非標的種、土壌機能、および消費者の健康に影響を与える可能性があります^5,6。したがって、土壌中の残留農薬の評価は、特に農薬の使用に関する厳格な規制がないため、開発途上国において、環境と人間の健康への潜在的な悪影響を評価するために不可欠です⁷。これにより、農薬の多残留分析がますます重要になっています。しかし、土壌中の残留農薬の迅速かつ正確な分析は、干渉物質の数が多く、これらの分析対象物の低濃度レベルと多様な物理化学的特性のために困難な課題です⁴。

すべての残留農薬分析法の中で、QuEChERS法は、最も迅速、最も簡単で、最も安価で、最も効果的で、堅牢で、最も安全なオプションになりました⁸。QuEChERSメソッドには2つのステップがあります。最初のステップでは、水性層とアセトニトリル層の間の塩析による分配に基づくマイクロスケール抽出が行われます。第2工程では、分散固相抽出(dSPE)を用いた洗浄工程が実施される。この技術は、多孔性吸着剤の少量の組み合わせを使用してマトリックス干渉成分を除去し、従来のSPE⁹の欠点を克服します。したがって、QuEChERSは、非常に正確な結果を提供し、ランダムおよびシステマティックエラーの潜在的な原因を最小限に抑える、無駄になる溶剤/化学物質がほとんどない環境に優しいアプローチです。実際、数百種類の農薬のハイスループットルーチン分析にうまく適用されており、ほぼすべてのタイプの環境、農業食品、および生物学的サンプルに強力に適用できます^8,10。この研究は、農業土壌中のOCPを分析するために以前に開発され、GC-MSに結合されたQuEChERS法の新しい修正を適用および検証することを目的としています。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

1.原液の調製

注意: プロトコル全体を通して、ニトリル手袋、白衣、および安全メガネを着用することをお勧めします。

1. 25 mLメスフラスコ内のヘキサン:トルエン(1:1)溶液2,000 mg/LのOCP( 材料表を参照)の市販ミックスから、400 mg/Lのアセトン溶液を準備します。 表 1 に、選択した各 OCP を示します。
2. その後のストック溶液を10 mLメスフラスコに50 mg/L、1 mg/L、および0.08 mg/Lの濃度でアセトンで調製し、-18°Cの琥珀色のガラスバイアルに保管します。
   注:作業全体で同じソリューションを使用できますが、使用するたびにこれらの条件下で保管することが重要です。
3. 市販の標準物質である4,4'-DDE-d8から20 mg/Lおよび0.4 mg/Lの濃度のアセトン溶液に、10 mLメスフラスコ中のアセトン溶液100 mg/Lで調製し、-18°Cの琥珀色のガラスバイアルに保管します。 内部標準 (IS) として 4,4'-DDE-d8 を使用します。

2. サンプル収集

1. ガラス容器に農業用土壌の上部10 cmの層を約0.5 kg集めます。この研究の土壌対象は、ジャガイモ作物の伝統的な農業地帯で収集されました。
   注:スパチュラによる表面サンプリングを実施しました。しかし、土壌の深さはその物理化学的特性に影響を与える可能性があります。したがって、有機炭素含有量が深さによって変化する場合は、異なる深さでサンプルを採取する必要があります。
2. 土壌サンプルを実験室に持ち込み、直径1 mmのふるいでふるいにかけ、4°Cで分析するまで琥珀色のガラス容器に保管します。
   注:作業全体を通して同じ土壌サンプルを使用できますが、使用するたびにこれらの条件下で保管することが重要です。

3. ギ酸アンモニウムを用いた修飾QuEChERS法 による サンプル調製

注:図1は、修正されたQuEChERSメソッドの概略 図 を示しています。

1. 50 mLの遠沈管で10 gの土壌サンプルを計量し、20 mg/Lで50 μLのIS溶液を加えて100 μg/kgを得ます。回復のために、ステップ1.2で調製した農薬溶液も追加して、10 μg / kg、50 μg / kg、および200 μg / kg(それぞれn = 3)を生成します。
2. 渦を使用してチューブを30秒間振って、スパイクをサンプルにうまく統合します。
3. 10mLの水を加える。自動シェーカーを使用して10 x g で5分間チューブを振とうします。
4. アセトニトリル10mLを加えます。チューブを10 x g で5分間再び振とうします。
5. ギ酸アンモニウム5 gを加え( 材料表を参照)、チューブを手で1分間激しく振って、1,800 x g で5分間遠心分離します。
6. アセトニトリル抽出物1 mLを、無水MgSO₄ 150 mg、1級-2級アミン(PSA)50 mg、およびオクタデシルシラン(C₁₈)50 mg( 材料表を参照)を含む2 mLの遠沈管に移し、分散固相抽出(d-SPE)⁸、ボルテックス30秒、および1,800 x g で5分間遠心分離してクリーンアップします。
7. 200 μLの抽出物を、300 μLの融合インサートを備えた適切に標識されたオートサンプラーバイアルに移し、GC-MSシステムを使用して機器分析を実行します(ステップ4)。
   注:マトリックスマッチングキャリブレーションは、ブランク抽出物を使用したのと同じ手順に従って実行されますが、d-SPEステップ(ステップ3.6)で5 mLの上清を15 mLチューブで洗浄し、スパイクおよびIS溶液はステップ3.7まで追加されません。オートサンプラーバイアルに校正標準溶液を加えて、5 μg/kg、10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg、200 μg/kg、および400 μg/kgを生成し、蒸発乾固させ、200 μLのマトリックス抽出物を追加します。

4. GC-MSによる機器分析

1. 単一の四重極質量分析計と電子イオン化界面(−70 eV)を備えたGC-MSシステムを使用してGC-MS分析を実行します( 材料表を参照)。
2. MSトランスファーラインを280°C、イオン源を230°Cに設定します。
3. キャリアガスとして5%フェニルメチルポリシロキサン30 m x 250 μm x 0.25 μmカラム( 材料表を参照)と超高純度Heを1.2 mL/minの一定流量で使用します。
4. GCオーブンを最初に60°Cに2分間維持し、次に25°C / minで温度を160°Cに上げ、1分間保持します。その後、15°C/分で175°Cまで昇温し、3分間保持します。その後、40°C/minで220°Cまで上昇させ、3分間保持します。再度、30°C/分で250°Cまで上昇させ、2分間保持します。最後に、温度を30°C / minで310°Cに保ち、2分間保持します。合計分析時間は22.125分です。
5. 各シーケンスの前に、MSの完全なオートチューンと空気と水のチェックを実行します。
   1. GC-MSシステムのすべてのパラメータを制御するMassHunter取得ソフトウェアを開きます。
      注意: 機器システムには、デフォルトでMassHunter取得ソフトウェアが含まれています。
   2. ツールバーの[表示]オプションを開き、[ 真空制御]、[ 調整]の順にクリックし、[ オートチューン]をクリックします。オートチューンは数分後に終了します。
   3. 「表示」オプションを開き、 機器制御をクリックします。
   4. [ はい]をクリックして、オートチューン用の新しいチューンファイルを保存します。
   5. ツールバーの「表示」オプションを開き、 真空制御をクリックし、もう一度 「調整 」をクリックして、 空気と水のチェックをクリックします。空気と水のチェックは数秒後に終了します。
   6. 「表示」オプションを開き、 機器制御をクリックします。
   7. [ はい]をクリックし、空気と水のチェック用に新しいチューンファイルを保存します。
6. オートサンプラー( 材料表を参照)を使用して、注入量を1.5 μLに保ちながら、スプリットレスモードで280°Cで注入を実行します。 注入の0.75分後、40 mL /分の流速でスプリットを開きます。
   注:注射の合間に、10 μLシリンジを酢酸エチルで3回、シクロヘキサンで3回洗浄する必要があります。すべての注射は重複しています。
7. 選択したイオンモニタリング(SIM)モードで分析対象物を分析します。これは、単一の四重極を備えたMSシステムで使用される標準モードです。
   注: 表 1は、OCPとISに1つの定量イオンと2つの同定イオンを使用した場合の保持時間(分)と定量パラメータを示しています。定量分析は、ISのイオンに対する定量イオンのピーク面積の比に基づいています。

5. データ取得

1. GC-MSシステムのすべてのパラメータを制御するMassHunter取得ソフトウェアを開きます。
2. ツールバーの「シーケンス」オプションを開き、サンプル名、バイアル番号、注入回数、機器メソッド、生成するファイルの名前など、シーケンスを編集します。必要な数の行を追加します。
3. [OK]をクリックして、新しいシーケンスを保存します。
4. ツールバーの[シーケンス]オプションを再度開き、ドロップダウンメニューの [シーケンスの実行 ]をクリックします。新しいウィンドウが開き、注入方法とサンプルが保存されるフォルダーを確認します。[ シーケンスの実行] をもう一度クリックすると、インジェクションが開始されます。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

分析方法の完全な検証は、直線性、マトリックス効果、回復率、および再現性の観点から実行されました。

直線性評価には、6つの濃度レベル(5 μg/kg、10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg、200 μg/kg、および400 μg/kg)のスパイクブランクサンプルを使用したマトリックスマッチング検量線を使用しました。決定係数(^R2)は、すべてのOCPで0.99以上でした。最低校正レベル(LCL)は5 ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

QuEChERS法の元の⁹と2つの公式バージョン^13,14は、硫酸マグネシウムを塩化ナトリウム、酢酸塩、またはクエン酸塩と一緒に使用して、抽出中のアセトニトリル/水混合物の分離を促進します。ただし、これらの塩は質量分析(MS)ソースの表面に固体として堆積する傾向があり、液体クロマトグラフィー(LC)-MSベースの方法のメンテナン?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL disposable glass conical centrifuge tubes	PYREX	99502-15
2 mL centrifuge tubes	Eppendorf	30120094
50 mL centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-169
5977B mass-selective detector	Agilent Technologies	1617R019
7820A gas chromatography system	Agilent Technologies	16162016
Acetone	Supelco	1006582500
Acetonitrile	VWR	83642320
Ammonium formate	VWR	21254260
Automatic shaker KS 3000 i control	IKA	3940000
Balance	Sartorius Lab Instruments Gmbh & Co	ENTRIS224I-1S
Bondesil-C18, 40 µm	Agilent Technologies	12213012
Bondesil-PSA, 40 µm	Agilent Technologies	12213024
Cyclohexane	VWR	85385320
EPA TCL pesticides mix	Sigma Aldrich	48913
Ethyl acetate	Supelco	1036492500
G4567A automatic sampler	Agilent Technologies	19490057
HP-5ms Ultra Inert (5%-phenyl)-methylpolysiloxane 30 m x 250 µm x 0.25 µm column	Agilent Technologies	19091S-433UI
Magnesium sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	434183-1KG
Mega Star 3.R centrifuge	VWR	521-1752
Milli-Q gradient A10	Millipore	RR400Q101
p,p'-DDE-d8	Dr Ehrenstorfer	DRE-XA12041100AC
Pipette tips 2 - 200 µL	BRAND	732008
Pipette tips 5 mL	BRAND	702595
Pipette tips 50 - 1000 uL	BRAND	732012
Pippette Transferpette S variabel 10 - 100 µL	BRAND	704774
Pippette Transferpette S variabel 100 - 1000 µL	BRAND	704780
Pippette Transferpette S variabel 20 - 200 µL	BRAND	704778
Pippette Transferpette S variabel 500 - 5000 µL	BRAND	704782
Vials with fused-in insert	Sigma Aldrich	29398-U
OCPs		CAS registry number
α-BHC		319-84-6
β-BHC		319-85-7
Lindane		58-89-9
δ-BHC		319-86-8
Heptachlor		76-44-8
Aldrin		309-00-2
Heptachlor epoxide		1024-57-3
α-Endosulfan		959-98-8
4,4'-DDE-d8 (IS)		93952-19-3
4,4'-DDE		72-55-9
Dieldrin		60-57-1
Endrin		72-20-8
β-Endosulfan		33213-65-9
4,4'-DDD		72-54-8
Endosulfan sulfate		1031-07-8
4,4'-DDT		50-29-3
Endrin ketone		53494-70-5
Methoxychlor		72-43-5