Bir Toprak Numunesindeki Organoklorin Pestisitlerinin Amonyum Format Kullanarak Modifiye QuEChERS Yaklaşımı ile Analizi

Özet

Bu protokol, bir toprak örneğindeki organoklor pestisit kalıntılarını başarılı bir şekilde belirlemek için QuEChERS'de faz bölümlemesi için amonyum formatının gaz kromatografisi-kütle spektrometresi ile birlikte kullanılmasını açıklamaktadır.

Özet

Şu anda, QuEChERS yöntemi, hem resmi hem de resmi olmayan laboratuvarlarda çok çeşitli matrislerde pestisit kalıntılarını analiz etmek için dünya çapında en yaygın kullanılan numune hazırlama protokolünü temsil etmektedir. Amonyum format kullanan QuEChERS yönteminin daha önce orijinal ve iki resmi versiyona kıyasla avantajlı olduğu kanıtlanmıştır. Bir yandan, numunenin gramı başına 0,5 g amonyum formatın basit bir şekilde eklenmesi, faz ayrımını indüklemek ve iyi analitik performans elde etmek için yeterlidir. Öte yandan, amonyum format rutin analizlerde bakım ihtiyacını azaltır. Burada, tarım toprağındaki organoklorin pestisit (OCP) kalıntılarının eşzamanlı analizi için amonyum format kullanılarak modifiye edilmiş bir QuEChERS yöntemi uygulanmıştır. Spesifik olarak, numunenin 10 gramı 10 mL su ile nemlendirildi ve daha sonra 10 mL asetonitril ile ekstrakte edildi. Daha sonra, faz ayırma 5 g amonyum format kullanılarak gerçekleştirildi. Santrifüjlemeden sonra, süpernatant susuz magnezyum sülfat, birincil-ikincil amin ve oktadesilsilan içeren dağıtıcı bir katı faz ekstraksiyon temizleme adımına tabi tutuldu. Analitik teknik olarak gaz kromatografisi-kütle spektrometresi kullanılmıştır. Amonyum format kullanan QuEChERS yöntemi, OCP kalıntılarını bir toprak örneğinden çıkarmak için başarılı bir alternatif olarak gösterilmiştir.

Giriş

Gıda üretimini artırma ihtiyacı, son birkaç on yılda dünya çapında pestisitlerin yoğun ve yaygın kullanımına yol açmıştır. Pestisitler, zararlılardan korunmak ve mahsul verimini artırmak için mahsullere uygulanır, ancak kalıntıları genellikle toprak ortamında, özellikle tarım alanlarında sona erer¹. Ayrıca, organoklor pestisitleri (OCP'ler) gibi bazı pestisitler çok kararlı bir yapıya sahiptir, bu nedenle kalıntıları kolayca ayrışmaz ve toprakta uzun süre kalır². Genel olarak, toprak, özellikle yüksek organik madde içeriğine sahip olduğunda, pestisit kalıntılarını biriktirme kapasitesi^{yüksektir 3}. Sonuç olarak, toprak, pestisit kalıntıları tarafından en çok kirlenmiş çevresel bölmelerden biridir. Örnek olarak, bugüne kadar yapılan tüm çalışmalardan biri, Avrupa Birliği genelinde 317 tarım toprağının% 83'ünün bir veya daha fazla pestisit kalıntısı ile kontamine olduğunu bulmuştur⁴.

Pestisit kalıntılarından kaynaklanan toprak kirliliği, kalıntıların yüksek toksisitesi nedeniyle besin zinciri yoluyla hedef olmayan türleri, toprak fonksiyonunu ve tüketici sağlığını etkileyebilir ^5,6. Sonuç olarak, topraklardaki pestisit kalıntılarının değerlendirilmesi, pestisitlerin kullanımına ilişkin katı düzenlemelerin bulunmaması nedeniyle, özellikle gelişmekte olan ülkelerde, çevre ve insan sağlığı üzerindeki potansiyel olumsuz etkilerini değerlendirmek için esastır⁷. Bu, pestisit çoklu kalıntı analizini giderek daha önemli hale getirmektedir. Bununla birlikte, topraklardaki pestisit kalıntılarının hızlı ve doğru analizi, çok sayıda müdahale eden maddenin yanı sıra düşük konsantrasyon seviyesi ve bu analitlerin çeşitli fizikokimyasal özellikleri nedeniyle zor bir zorluktur⁴.

Tüm pestisit kalıntı analizi yöntemleri arasında, QuEChERS yöntemi en hızlı, en kolay, en ucuz, en etkili, en sağlam ve en güvenli seçenek⁸ haline gelmiştir. QuEChERS yöntemi iki adımdan oluşur. İlk adımda, bir sulu ve bir asetonitril tabaka arasında tuzlama yoluyla bölümlemeye dayanan mikro ölçekli bir ekstraksiyon gerçekleştirilir. İkinci adımda, dispersif katı faz ekstraksiyonu (dSPE) kullanılarak bir temizleme işlemi gerçekleştirilir; Bu teknik, matrise müdahale eden bileşenleri çıkarmak için az miktarda birkaç gözenekli sorbent kombinasyonu kullanır ve geleneksel SPE^9'un dezavantajlarının üstesinden gelir. Bu nedenle, QuEChERS, çok doğru sonuçlar veren ve potansiyel rastgele ve sistematik hata kaynaklarını en aza indiren, çok az çözücü / kimyasal atıkla çevre dostu bir yaklaşımdır. Aslında, yüzlerce pestisitin yüksek verimli rutin analizi için başarıyla uygulanmıştır ve hemen hemen her türlü çevresel, tarımsal gıda ve biyolojik numunede güçlü uygulanabilirlik ^8,10. Bu çalışma, tarım toprağındaki OCP'leri analiz etmek için daha önce geliştirilen ve GC-MS ile birleştirilen QuEChERS yönteminin yeni bir modifikasyonunu uygulamayı ve doğrulamayı amaçlamaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Stok çözeltilerinin hazırlanması

NOT: Tüm protokol boyunca nitril eldiven, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlüğü takılması önerilir.

1. 25 mL'lik hacimsel bir şişede hekzan:toluen (1:1) içinde 2.000 mg/L'lik ticari bir OCP karışımından (bkz. Malzeme Tablosu) 400 mg/L'de asetonda bir stok çözeltisi hazırlayın. Tablo 1 , seçilen OCP'lerin her birini gösterir.
2. Sonraki stok çözeltilerini asetonda 10 mL hacimsel şişelerde 50 mg / L, 1 mg / L ve 0.08 mg / L konsantrasyonlarında hazırlayın ve bunları -18 ° C'de amber cam şişelerde saklayın.
   NOT: Aynı çözümler çalışma boyunca kullanılabilir, ancak her kullanımdan hemen sonra bunları bu koşullar altında saklamak önemlidir.
3. Stok çözeltilerini 10 mL hacimsel şişelerde asetonda 100 mg / L'de 4,4'-DDE-d8 ticari standardından 20 mg / L ve 0.4 mg / L konsantrasyonlarında hazırlayın ve -18 ° C'de amber cam şişelerde saklayın. Dahili standart (IS) olarak 4,4'-DDE-d8 kullanın.

2. Örnek toplama

1. Bir tarım toprağının üst 10 cm'lik tabakasının yaklaşık 0,5 kg'ını bir cam kapta toplayın. Bu çalışmanın toprak amacı, patates bitkilerinin geleneksel bir tarım bölgesinde toplanmıştır.
   NOT: Spatula ile yüzey örneklemesi yapılmıştır. Bununla birlikte, toprağın derinliği fizikokimyasal özelliklerini etkileyebilir. Bu nedenle, organik karbon içeriği derinliğe göre değişiyorsa, farklı derinliklerde numune almak gerekir.
2. Toprak örneğini laboratuvara götürün, 1 mm çapında bir elek ile eleyin ve amber cam bir kapta 4 ° C'de analize kadar saklayın.
   NOT: Aynı toprak örneği çalışma boyunca kullanılabilir, ancak her kullanımdan hemen sonra bu koşullar altında saklanması önemlidir.

3. Amonyum format kullanarak modifiye QuEChERS yöntemiyle numune hazırlama

NOT: Şekil 1 , değiştirilmiş QuEChERS yönteminin şematik bir temsilini göstermektedir.

1. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 10 g toprak örneğini tartın ve 100 μg/kg verim sağlamak için 20 mg/L'de 50 μL IS çözeltisi ekleyin. Geri kazanım amacıyla, 10 μg / kg, 50 μg / kg ve 200 μg / kg (her biri n = 3) verim sağlamak için adım 1.2'de hazırlanan pestisit çözeltilerini de ekleyin.
2. Başakları numuneye daha iyi entegre etmek için tüpü 30 sn'lik bir vorteks kullanarak sallayın.
3. 10 mL su ekleyin. Tüpü 5 dakika boyunca 10 x g'de otomatik bir çalkalayıcı kullanarak çalkalayın.
4. 10 mL asetonitril ekleyin. Tüpü 5 dakika boyunca 10 x g'de tekrar çalkalayın.
5. 5 g amonyum format ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız), tüpü elle 1 dakika boyunca kuvvetlice sallayın ve 5 dakika boyunca 1.800 x g'de santrifüj yapın.
6. Asetonitril ekstraktının 1 mL'sini, 150 mg susuz MgSO₄, 50 mg birincil-sekonder amin (PSA) ve 50 mg oktadesylsilane (C₁₈) içeren 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne dispersif-katı faz ekstraksiyonu (d-SPE)8, 30 s için vorteks ve 5 dakika boyunca 1.800 x g'de santrifüj ile temizleme amacıyla aktarın.
7. Ekstraktın 200 μL'sini, 300 μL kaynaştırılmış bir kesici uç ile uygun şekilde etiketlenmiş bir otomatik numune alma şişesine aktarın ve bir GC-MS sistemi kullanarak enstrümantal bir analiz gerçekleştirin (adım 4).
   NOT: Matris eşleştirmeli kalibrasyon, daha önce boş ekstraktlar kullanılarak aynı adımlar izlenerek gerçekleştirilir, ancak süpernatantın 5 mL'si d-SPE adımında (adım 3.6) 15 mL tüplerde temizlenir ve ani ve IS çözeltileri adım 3.7'ye kadar eklenmez. 5 μg/kg, 10 μg/kg, 50 μg/kg, 100 μg/kg, 200 μg/kg ve 400 μg/kg verim elde etmek için otomatik numune alma şişelerine kalibrasyon standart çözeltilerini ekleyin, kuruluğa buharlaşın ve matris ekstraktlarının 200 μL'sini ekleyin.

4. GC-MS ile enstrümantal analiz

1. GC-MS analizlerini, tek bir dörtlü kütle spektrometresi ve bir elektron iyonizasyon arayüzü (-70 eV) içeren bir GC-MS sistemi kullanarak gerçekleştirin (bkz.
2. MS transfer hattını 280 °C'ye ve iyon kaynağını 230 °C'ye ayarlayın.
3. % 5-fenil-metilpolissiloksan 30 m x 250 μm x 0,25 μm sütun (bakınız Malzeme Tablosu) ve ultra yüksek saflıkta He 1,2 mL / dak sabit akış hızında taşıyıcı gaz olarak kullanın.
4. GC fırınını başlangıçta 2 dakika boyunca 60 ° C'de tutun, ardından sıcaklığı 25 ° C / dak'da 160 ° C'ye yükseltin ve 1 dakika bekletin. Ardından, sıcaklığı 15 ° C / dak'da 175 ° C'ye yükseltin ve 3 dakika bekleyin. Ardından, 40 °C / dak'da 220 ° C'ye yükseltin ve 3 dakika bekleyin. Yine, 30 ° C / dak'da 250 ° C'ye yükseltin ve 2 dakika bekleyin. Son olarak, sıcaklığı 30 ° C / dak'da 310 ° C'ye alın ve 2 dakika bekleyin. Toplam analiz süresi 22.125 dakikadır.
5. Her sekanstan önce tam bir otomatik ayar ve MS'in hava ve su kontrolünü yapın.
   1. GC-MS sisteminin tüm parametrelerini kontrol eden MassHunter satın alma yazılımını açın.
      NOT: Cihaz sistemi varsayılan olarak MassHunter edinme yazılımını içerir.
   2. Araç çubuğundaki "Görünüm" seçeneğini açın ve Vakum kontrolüne tıklayın, Ayarla'ya tıklayın ve Otomatik Ayarla'ya tıklayın. Otomatik ayar birkaç dakika sonra sona erer.
   3. "Görünüm" seçeneğini açın ve Enstrüman kontrolüne tıklayın.
   4. Evet'e tıklayın ve otomatik ayar için yeni ayar dosyasını kaydedin.
   5. Araç çubuğundaki "Görünüm" seçeneğini açın ve Vakum kontrolüne tıklayın, tekrar Ayarla'ya tıklayın ve Hava ve Su kontrolüne tıklayın. Hava ve su kontrolü birkaç saniye sonra sona erecektir.
   6. "Görünüm" seçeneğini açın ve Enstrüman kontrolüne tıklayın.
   7. Evet'e tıklayın ve hava ve su kontrolü için yeni melodi dosyasını kaydedin.
6. Enjeksiyonu, bölünmemiş modda 280 °C'de bir otomatik örnekleyici kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakınız) gerçekleştirin ve enjeksiyon hacmini 1,5 μL. Enjeksiyondan 0,75 dakika sonra, bölmeyi 40 mL / dak akış hızında açın.
   NOT: Enjeksiyonlar arasında, 10 μL şırınga üç kez etil asetat ve üç kez sikloheksan ile yıkanmalıdır. Tüm enjeksiyonlar kopyadır.
7. Analitleri seçilen iyon izleme (SIM) modunda analiz edin. Bu, tek bir dörtlü MS sistemlerinde kullanılan standart moddur.
   NOT: Tablo 1 , OCP'ler ve IS için bir kantitasyon ve iki tanımlama iyonu kullanmaya dayanan tutma sürelerini (min) ve niceleme parametrelerini göstermektedir. Kantitatif analiz, kantitasyon iyonunun tepe alanının IS iyonuna oranına dayanır.

5. Veri toplama

1. GC-MS sisteminin tüm parametrelerini kontrol eden MassHunter satın alma yazılımını açın.
2. Araç çubuğundaki "Sıra" seçeneğini açın ve örnek adı, şişe numarası, enjeksiyon sayısı, enstrümantal yöntem ve oluşturulacak dosyanın adı dahil olmak üzere sırayı düzenleyin. Gerektiği kadar satır ekleyin.
3. Tamam'a tıklayın ve yeni diziyi kaydedin.
4. Araç çubuğundaki "Sıra" seçeneğini tekrar açın ve açılır menüden Sırayı Çalıştır'a tıklayın. Enjeksiyon yöntemini ve örneklerin kaydedileceği klasörü onaylamak için yeni bir pencere açılacaktır. Sırayı Çalıştır'a tekrar tıklayın ve enjeksiyon başlayacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Analitik yöntemin tam doğrulaması, doğrusallık, matris etkileri, geri kazanım ve tekrarlanabilirlik açısından gerçekleştirildi.

Doğrusallık değerlendirmesi için altı konsantrasyon seviyesinde (5 μg/kg, 10 μg/kg, 50 μg/kg, 100 μg/kg, 200 μg/kg ve 400 μg/kg) çivili boş numunelerle matris uyumlu kalibrasyon eğrileri kullanılmıştır. Belirleme katsayıları (R²), tüm OCP'ler için 0,99'dan yüksek veya ona eşitti. En düşük kalibrasyon seviyesi (LCL), gı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

QuEChERS yönteminin orijinal⁹ ve iki resmi versiyonu ^13,14, ekstraksiyon sırasında asetonitril / su karışımı ayrımını teşvik etmek için sodyum klorür^, asetat veya sitrat tuzları ile birlikte magnezyum sülfat kullanır. Bununla birlikte, bu tuzlar kütle spektrometresi (MS) kaynağındaki yüzeylerde katı madde olarak birikme eğilimindedir, bu da sıvı kromatografisi (LC)-MS tabanlı yöntemlerin daha fazla korunmasına ih...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL disposable glass conical centrifuge tubes	PYREX	99502-15
2 mL centrifuge tubes	Eppendorf	30120094
50 mL centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-169
5977B mass-selective detector	Agilent Technologies	1617R019
7820A gas chromatography system	Agilent Technologies	16162016
Acetone	Supelco	1006582500
Acetonitrile	VWR	83642320
Ammonium formate	VWR	21254260
Automatic shaker KS 3000 i control	IKA	3940000
Balance	Sartorius Lab Instruments Gmbh & Co	ENTRIS224I-1S
Bondesil-C18, 40 µm	Agilent Technologies	12213012
Bondesil-PSA, 40 µm	Agilent Technologies	12213024
Cyclohexane	VWR	85385320
EPA TCL pesticides mix	Sigma Aldrich	48913
Ethyl acetate	Supelco	1036492500
G4567A automatic sampler	Agilent Technologies	19490057
HP-5ms Ultra Inert (5%-phenyl)-methylpolysiloxane 30 m x 250 µm x 0.25 µm column	Agilent Technologies	19091S-433UI
Magnesium sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	434183-1KG
Mega Star 3.R centrifuge	VWR	521-1752
Milli-Q gradient A10	Millipore	RR400Q101
p,p'-DDE-d8	Dr Ehrenstorfer	DRE-XA12041100AC
Pipette tips 2 - 200 µL	BRAND	732008
Pipette tips 5 mL	BRAND	702595
Pipette tips 50 - 1000 uL	BRAND	732012
Pippette Transferpette S variabel 10 - 100 µL	BRAND	704774
Pippette Transferpette S variabel 100 - 1000 µL	BRAND	704780
Pippette Transferpette S variabel 20 - 200 µL	BRAND	704778
Pippette Transferpette S variabel 500 - 5000 µL	BRAND	704782
Vials with fused-in insert	Sigma Aldrich	29398-U
OCPs		CAS registry number
α-BHC		319-84-6
β-BHC		319-85-7
Lindane		58-89-9
δ-BHC		319-86-8
Heptachlor		76-44-8
Aldrin		309-00-2
Heptachlor epoxide		1024-57-3
α-Endosulfan		959-98-8
4,4'-DDE-d8 (IS)		93952-19-3
4,4'-DDE		72-55-9
Dieldrin		60-57-1
Endrin		72-20-8
β-Endosulfan		33213-65-9
4,4'-DDD		72-54-8
Endosulfan sulfate		1031-07-8
4,4'-DDT		50-29-3
Endrin ketone		53494-70-5
Methoxychlor		72-43-5