JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • Erratum Notice
  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • Erratum
  • 转载和许可

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

摘要

我们设计、制造并验证了一种快速处理富含韧皮部的树皮柑橘接穗组织的仪器。与现有方法相比，接穗组织提取器（BTE）提高了样品通量，并降低了所需的劳动力和设备成本。

摘要

移植传播、韧皮部限制的柑橘病原体，如病毒、类病毒和细菌，是造成全球毁灭性流行病和严重经济损失的原因。例如，柑橘tristeza病毒杀死了全球超过1亿棵柑橘树，而"念珠菌亚洲自由杆菌"使佛罗里达州损失了90亿美元。使用经过病原体测试的柑橘接穗进行树木繁殖是管理此类病原体的关键。加州大学河滨分校的柑橘克隆保护计划 （CCPP） 使用聚合酶链反应 （PCR） 测定每年测试来自柑橘接穗树的数千个样品，以保护加州的柑橘并为国家清洁植物网络提供清洁繁殖装置。柑橘病毒和类病毒的高通量分子检测的一个严重瓶颈是植物组织处理步骤。

正确的组织制备对于提取优质核酸和PCR测定的下游使用至关重要。植物组织在低温下切碎、称重、冷冻干燥、研磨和离心以避免核酸降解是时间和劳动密集型的，需要昂贵且专业的实验室设备。本文介绍了一种专门用于快速处理柑橘接穗木富含韧皮部的树皮组织的仪器的验证，称为接穗组织提取器 （BTE）。与现有方法相比，BTE 可将样品通量提高 100%。此外，它还减少了劳动力和设备成本。在这项工作中，BTE样品的DNA产量（80.25 ng / μL）与CCPP的手工切碎方案（77.84 ng / μL）相当。该仪器和快速植物组织处理方案可以使加利福尼亚州的几个柑橘诊断实验室和项目受益，并成为全球其他木本多年生作物组织处理的模型系统。

引言

柑橘的嫁接传播限制韧皮部病原体，如类病毒、病毒和细菌，在世界每个柑橘产区都造成了毁灭性的流行病和严重的经济损失。柑橘类病毒限制了生产因素，因为它们在经济上重要的柑橘类型中引起外皮质炎和恶病质疾病，例如三叶、三叶杂交种、柑橘、柑橘和橘子 1,2,3。在加利福尼亚州，这些对类病毒敏感的柑橘类型是"易去皮者"市场增长和盈利的基础，跟随消费者对易于去皮、分段和无籽水果的偏好变化趋势4,5,6。因此，柑橘类病毒受到加州食品和农业部（CDFA）"柑橘苗圃害虫清洁计划-参议院法案140"的监管，CDFA植物害虫诊断处的实验室每年进行数千次柑橘类病毒测试7,8,9,10.自 1930 年代全球流行病开始以来，柑橘 tristeza 病毒 （CTV） 已造成超过 1 亿棵柑橘树死亡 3,9,10,11。在加利福尼亚州，病毒的茎点蚀和三叶断裂抗性对价值 36 亿美元的加州柑橘产业构成严重威胁12,13,14。因此，CDFA将CTV归类为受管制的A类植物害虫，中加州Tristeza根除局（CCTEA）的实验室每年进行广泛的实地调查和数千次病毒测试15,16。据估计，细菌"亚洲念珠菌"（CLas）和黄龙冰病（HLB）对佛罗里达州造成了近90亿美元的经济损失，原因是柑橘种植面积减少了40%，柑橘业务减少了57%，并损失了近8,000个工作岗位17,18。在加利福尼亚州，假设HLB导致的柑橘种植面积减少20%，预计将导致8,200多个工作岗位流失，该州国内生产总值减少超过五亿美元。因此，柑橘病虫害预防计划每年花费超过 4000 万美元进行调查，以测试、检测和根除来自加利福尼亚州14、17、19、20 的 CLas。

管理柑橘类病毒、病毒和细菌的一个关键要素是使用经过病原体测试的繁殖材料（即接穗）进行树木生产。经过病原体测试的柑橘接穗是在采用先进病原体消除和检测技术的综合检疫计划中生产和维护的10,21。加州大学河滨分校的柑橘克隆保护计划 （CCPP） 每年测试来自新进口到该州和美国的柑橘品种以及柑橘接穗树的数千个接穗样品，以保护加州的柑橘并支持国家柑橘清洁植物网络的功能10,17,22.为了处理大量的柑橘检测，高通量、可靠且具有成本效益的病原体检测检测是CCPP 7,10,22等项目成功的基本组成部分。

虽然聚合酶链反应（PCR）等基于分子的病原体检测分析已显著提高植物诊断实验室的通量，但根据我们的经验，实施高通量方案的最关键瓶颈之一是植物组织样品处理步骤。对于柑橘来说尤其如此，因为目前可用于处理富含韧皮部的组织（如叶柄和接穗树皮）的方案是劳动密集型的，耗时的，并且需要昂贵且专业的实验室设备。这些方案需要在低温下手工切碎、称重、冷冻干燥、研磨和离心，以避免核酸降解8,23,24。例如，在CCPP诊断实验室，样品处理包括（i）手工切碎（6-9个样品/小时/操作员），（ii）冷冻干燥（16-24小时），（iii）粉碎（30-60秒）和（iv）离心（1-2小时）。该过程还需要专门的用品（例如，重型安全锁定管，不锈钢研磨球，适配器，刀片，手套）和多件昂贵的实验室设备（例如，超低温冰箱，冷冻干燥机，组织粉碎机，液氮低温，冷冻离心机）。

与任何行业一样，设备工程和流程自动化是降低成本、提高产量以及提供高质量、统一的产品和服务的关键。柑橘行业需要低成本的组织处理仪器，这些仪器需要最少的操作技能，因此易于转移到诊断实验室和现场操作，以实现快速下游病原体检测的高样品处理能力。技术演进解决方案（TES）和CCPP开发（即设计和制造）并验证（即用柑橘样品进行测试并与标准实验室程序进行比较）一种低成本（即消除了对专业实验室设备的需求）仪器，用于快速处理富含韧皮部的柑橘组织（即接穗），称为接穗组织提取器（BTE）。 如图1所示，BTE包括一个用于电源和控制的基本组件，以及一个用于处理柑橘接穗木的可拆卸腔室。BTE腔室由一个砂轮组成，专门设计用于从柑橘接穗中剥离富含韧皮部的树皮组织。切碎的树皮组织通过滑动端口快速喷射到含有提取缓冲液的注射器中，过滤，并准备好进行核酸提取和纯化，无需任何额外的处理或制备（图1）。BTE系统还包括无纸化样品跟踪应用程序和集成称重应用程序，可将样品处理信息实时记录在在线数据库中。

BTE系统将CCPP的实验室诊断能力提高了100%以上，并始终如一地生产出适合纯化高质量核酸和使用PCR测定法检测柑橘移植传播病原体的柑橘组织提取物。更具体地说，BTE将组织处理时间从每个样品的24小时减少到~3分钟，取代了成本超过60,000美元的实验室仪器（图2，步骤2-4），并允许处理更大的样品量。

本文介绍了BTE高通量柑橘树皮组织处理、核酸提取和病原体检测验证数据，包括分别来自CCPP Rubidoux检疫设施和Lindcove基金会设施的所有适当的阳性和阴性对照。我们还介绍了与当前实验室程序相比的吞吐量和处理时间变化（图2）。此外，这项工作为柑橘病原体检测实验室提供了详细的分步协议，并展示了BTE如何支持病原体清洁苗圃，调查和根除计划的功能。

figure-introduction-3584
图 1:接穗组织提取器。 BTE包括一个用于电源和控制的基本组件，以及一个用于加工柑橘接穗木的可拆卸室。BTE腔室由一个砂轮组成，专门设计用于从柑橘接穗中剥离富含韧皮部的树皮组织。切碎的树皮组织通过滑口快速喷射到注射器中，过滤，并准备好进行核酸提取和纯化，无需任何额外的处理或准备。缩写:BTE = 接穗组织提取器。 请点击此处查看此图的大图。

figure-introduction-4054
图 2:传统手工切碎实验室程序与 BTE 处理之间的分步比较。 BTE 处理涉及高通量柑橘树皮组织处理、核酸提取和病原体检测。每个步骤的时间在括号中表示。 请点击此处查看此图的大图。

研究方案

1. 收集柑橘接穗样品进行运输

  1. 向技术演进解决方案发送树信息电子表格，以便他们加载到他们的 Web 服务器中（最终，用户将创建新树）。
  2. 使用手机应用程序 TES 跟踪器 选择一棵树，并将近场通信 （NFC） 项圈标签握在手机上，以将树信息加载到标签中。
  3. 将三到四个柑橘接穗样品插入兼容 BTE 的塑料袋托架中，并盖上盖子。
    1. 确保接穗的长度不超过 8 英寸且不小于 5 英寸。
      1. 如果长度大于 8 英寸，请使用无菌一次性剃须刀片或用 10% 漂白剂溶液（1% 次氯酸钠）净化的修剪剪使其更短。
      2. 如果长度小于 5 英寸，请收集不同的接穗样品放入袋中。
    2. 确保用手或使用 10% 漂白消毒的切割工具（1% 次氯酸钠）去除任何腋窝生长或大刺。
      注意:此步骤很重要，以便接穗在腔室开口时更容易操纵。
    3. 确保没有具有弯曲特征的接穗样品。如果是这样，请使用 10% 漂白消毒的切割工具（1% 次氯酸钠）将其去除，并仅将样品的直部分放入 BTE 袋中。
      注意:弯曲的接穗很难操纵到仪器中，导致树皮条纹不均匀。
  4. 使用手机应用程序 TES跟踪器 扫描树的NFC项圈标签，并将其与样品袋上的NFC夹标签链接。
  5. 注意接穗的厚度，因为这决定了操作员如何在 BTE 腔内剥离富含韧皮部的接穗树皮。
    1. 如果接穗的厚度低于 0.20 英寸，则剥离接穗时要小心，因为腔室中的高速纺线会将整个接穗粉碎到其核心，超出树皮层并进入富含韧皮部的木材和髓组织。
    2. 选择较厚的接穗，因为更容易剥离树皮组织，同时避免富含韧皮部的接穗组织。
  6. 将样品放入带有几个冰袋的绝缘运输容器中。

2. 设置在通风橱中

注意:最好在通风橱内操作BTE。这将降低植物组织交叉污染和实验室污染的风险。

  1. 使用10%（1%次氯酸钠）喷雾瓶消毒。
    1. 喷洒罩子表面，让漂白剂静置约 1 分钟，然后用纸巾擦拭。
    2. 用漂白剂溶液喷洒纸巾。擦拭 TE 底座、体重秤组件（秤、空气防护罩和塔）和记号笔。
  2. 打开用于处理样品数量的注射器组，并将它们放在有盖的纸板箱中。
  3. 在引擎盖外准备一包拭子，以备不时之需。
  4. 准备体重秤。
    1. 从秤上取下配重塔，然后按住电源按钮将其打开。在刻度显示 0 后，将塔放在刻度的中心。
    2. 将体重秤空气防护罩滑过秤的前部。
  5. 通过翻转背面的开关来准备组织提取器底座。确保按下盒子左侧的开关顶部。等待闪烁的绿色 LED，表示腔室已准备就绪。

3. 设置清洁站（补充图S1）。

  1. 将1升水放入超声波清洗机中。
  2. 将两个垃圾袋包裹在超声波清洗机的顶部。
  3. 将~5升10%漂白剂（1%次氯酸钠溶液）倒入超声波清洗机中。
  4. 在水桶中装满足够的水以淹没房间。
  5. 打开空压机，打开阀门。
  6. 设置一个背景，以便在腔室干燥时捕获液体。

4. 柑橘接穗树皮剥离用BTE材料加工

  1. 将腔室装载到BTE底座上。
    1. 准备BTE室。
      1. 将一个空样品袋连接到腔室的背面。使用两个 O 形圈将空袋固定到 BTE 室的后喷嘴上。
      2. 检查刀片是否有磨损或损坏的迹象，例如刀片上形成的切口，然后继续进入塑料或尖端形成切口。确保刀片上的箭头与单个锁定符号对齐。
      3. 确保腔室底部的空气释放转向 O 符号。将透明盖子放在腔室开口上，然后使用腔室右侧的轨道将透明BTE滑轨滑到腔室上。将腔室底部的锁推入滑块。确保柱塞盖安装在滑块顶部。
    2. 将腔室放在 BTE 底座上，BTE 底座的喷嘴突出到腔室的背面。等待蓝色 LED 闪烁，表示放置成功。
  2. 通过将 NFC 剪辑标签上的白色贴纸移动到盒子右侧的 Z 轴上，将样品加载到 BTE 底座上。在 Z 轴上以缓慢的圆周运动移动标签，直到黄灯开始闪烁。将样品连接到BTE底座上，并确保样品袋上没有孔;如果有孔，请用胶带修补。将 O 形圈放在样品袋上，将其固定在 BTE 喷嘴的前面。
  3. 装入未使用的注射器组。
    1. 去皮注射器组。将未使用的注射器装置放在秤塔上。当红灯开始闪烁或刻度显示0时，取出注射器组。
    2. 用过滤器从注射器中取出柱塞。确保液体在底部（非过滤器）注射器中。将柱塞放在纸巾上或黑色柱塞不接触任何表面的塔上。
    3. 通过将出口口按入注射器并旋转 90°，将注射器连接到滑动出口端口。
  4. 处理接穗样品。
    注意:BTE具有高速运动部件。所有操作都需要在通风橱内进行。所有用户都应使用防护眼镜、耳罩（耳塞）和所有其他个人防护设备 （PPE），例如手套和实验室外套。
    1. 按顶部的黑色按钮启动机器。在处理过程中随时按第二次以停止电机。
      注意:盒子具有速度和温度感应功能，以确保其正常工作。
    2. 从袋子里拿一根接穗棒，然后把它穿过BTE喷嘴的 顶部 。
    3. 用另一只手抓住腔室另一侧的接穗棒，慢慢地向下插入刀片。聆听轻微的嗡嗡声，表明接穗正在剥去树皮。在旋转接穗的同时慢慢来回移动接穗。
      1. 如果听到响亮的剧烈切碎声，请快速将树枝移动到顶部和/或按顶部按钮停止电机。要停止电机，请使用右侧开关完成处理（见步骤4.4.3.2）。
      2. 如果在切割时没有材料从出口出来，则腔室有堵塞。关闭电机，取下滑动柱塞盖，然后使用棉签的塑料将堵塞物推出机器出口。使用右侧开关完成加工:向上 = 正向切割;中间 = 电机关闭;向下 = 反向切割。
    4. 对其余分支重复步骤 4.4.2 和步骤 4.4.3。
      注意:当注射器的25%已充满植物组织时，已剥离足够接穗树皮的一般指标。柑橘的嫁接传播病原体可能在树中分布不均匀。因此，从柑橘树冠周围收集了三到四个接穗样品。BTE手提袋中的每个接穗样品都必须有助于最终的研磨组织样品，以确保对具有代表性的完整树木样品进行病原体检测。
    5. 按顶部的黑色按钮停止处理。等待指示灯再次开始闪烁黄色。
  5. 验证样品重量。
    1. 将注射器旋转90°，然后将其向下拉以分离。将柱塞放回注射器上，然后将注射器放在塔上。
    2. 等待秤自动检测样品，并确定其是否在适当的重量范围内（0.25 ± 0.05 g）。如果样品重量太低（<0.20 g），重复步骤4.4;红色 LED 将开始闪烁。如果样品重量过高（>0.30 g），请去除一些样品材料;黄色 LED 将开始更慢地闪烁。如果样品在该范围内，绿色 LED 将开始闪烁。
  6. 均质化接穗样品
    1. 从装有样品的注射器中取出柱塞，将液体与样品一起推入注射器中，然后重新添加柱塞。柱塞将缓冲液和植物汁液推过网状过滤器（保留任何大的树皮组织碎片），并通过橡胶管 进入 空注射器。
    2. 通过将缓冲液和植物汁液从一个注射器来回推到另一个注射器来混合样品。重复~3x-4x，直到样品变成均匀的绿色液体混合物。
    3. 一旦充分均质化，将植物汁液样品推入没有网状过滤器的注射器中，并将橡胶管和带有过滤器的注射器与带有样品的注射器分离。
    4. 将植物汁液样品从注射器中排出到2mL无菌微量离心管中，并储存在-20°C直至进一步使用。使用永久性记号笔在样品上贴上袋号标签。
      注意:步骤4.6.5中的植物样品汁液现在可以使用任何可用的核酸，RNA或DNA，基于苯酚 - 氯仿，硅胶柱或磁珠9,25,26,27的提取方法进行处理，用于核酸提取和纯化（见步骤7）和下游检测柑橘的移植传播病原体（见步骤8）。

5. 对 BTE 可拆卸腔室进行消毒

注意:如果注射器组中的缓冲液进入腔室或载玻片，请在清洁前冲洗并遵循实验室的所有安全规则。注射器组含有硫氰酸胍。如果注射器组中的缓冲液与漂白剂接触，则会产生氰化物气体。

  1. 在腔室中处理第 10 个样品后，执行以下步骤。请注意，绿色 LED 将继续闪烁，而不是变为蓝色闪烁。
  2. 拆卸BTE室以清洁所有可能的污染物;取下透明塑料盖，清除腔室滑块，并清除腔室载玻片上的堵塞端口。
  3. 将腔室底部的空气释放阀转到打开位置（打开挂锁标记）。将腔室组件放入设置的超声波清洗器中（参见步骤3.1）。将盖子放在腔室下方以防止其漂浮。运行超声波清洗机15分钟。
    注意:超声波清洗槽（5 L）最多可容纳两个腔室。
  4. 在水浴（步骤3.4）中冲洗腔室组件至少30秒。将腔室组件移至干燥站。
    注意:干燥会导致腔室内部件快速移动、噪音大（~85 分贝 [dB]）和可能的飞溅。所有用户都应使用防护眼镜、耳罩（耳塞）、实验室外套和操作实验室安全规则要求的所有其他个人防护装备。
  5. 干燥BTE室。
    1. 将气枪与腔室上部开口的凹槽（滑块通常位于的位置）对齐。按下喷枪的扳机分配空气~30秒。
      注:确保开口远离用户朝向背景。这应该旋转刀片组以去除捕获在其下方的液体。
    2. 将气枪朝向腔室的顶部喷嘴。按下气枪的扳机，慢慢地描摹每个喷嘴入口的三个完整圆圈。
    3. 将气枪放置在BTE的中心。从最内侧开始，按住扳机，然后移动直到气枪指向滑块的位置。
    4. 快速将空气流过整个腔室，前后，以去除外部的地表水。
  6. 干燥BTE载玻片。
    1. 将气枪放入滑块的柱塞槽中，然后按下扳机将水从滑块出口中排出。
    2. 沿着载玻片的内表面运行气枪以使其干燥。
    3. 沿着滑动槽运行气枪以推出水。
    4. 快速将空气流过整个外部，以去除地表水。
  7. 干燥组件。
    1. 握住滑动柱塞盖和 O 形圈，然后按下扳机。
    2. 将气枪放在盖子的内表面上。
    3. 将组件放入腔室并滑动以继续干燥或重新组装它们。
      注意:对于具有多个功能性BTE的高组织处理环境，可以提供能够同时对10个腔室进行净化的批量消毒系统。

6. 处理和消毒

  1. 将注射器和橡胶管丢弃在指定的胍废物容器中。
  2. 将任何植物材料丢弃在生物危害废物容器中。
  3. 从 BTE 底座上拆下 BTE 室。
  4. 拆卸BTE室并进行净化，如步骤5中所述。

7. 评估从BTE柑橘接穗提取物中纯化的RNA的组织处理和质量

注意:在该协议中，我们使用来自255棵柑橘树的接穗木样品来比较柑橘接穗组织加工所需的时间以及从BTE制备的树皮组织提取物中纯化的RNA的质量（图2，右侧，步骤1，步骤5和步骤6）与在法规批准的柑橘接穗组织处理方法之后制备的RNA，使用手工去皮和切碎， 树皮组织的冷冻干燥，粉碎和离心，如Dang等人23 所述（图2，左侧，步骤1-6）。

  1. 目前的实验室程序:根据法规批准的方法23制备用于组织处理的接穗样品。
    1. 如Dang等人23 所述，对树皮组织进行手工剥皮和切碎，冷冻干燥，粉碎，离心并将植物汁液转移到RNA提取管中（图2，左侧，步骤1-6）。
    2. 从每棵被测树上手工剥出三到四个接穗样品后，将所有接穗放入与BTE兼容的塑料袋载体中，并储存在4°C直至BTE处理（步骤7.2）。
  2. BTE程序:启动BTE柑橘接穗组织加工（第4节，步骤4.1-4.6; 图 2，右侧，步骤 1、步骤 5 和步骤 6）。
    1. 使用步骤7.1.2中储存在BTE手提袋内的接穗样品。
  3. 使用监管批准的基于磁珠的半自动磁珠方法8,23,28从当前实验室程序（步骤7.1.1）和BTE程序（步骤7.2.2）获得的植物汁液中提取和纯化RNA。
  4. 通过测量其浓度、纯度和完整性来评估 RNA 质量 8,23,24,29,3 3,31。
    1. 要计算浓度，请使用分光光度法和波长为260nm的光密度（OD）。
    2. 要评估纯度，请使用260/280的分光光度OD比。
    3. 要检查完整性，请使用靶向 NADH 脱氢酶柑橘基因24,32 的 mRNA 的逆转录 （RT） 定量聚合酶链反应 （qPCR） 反应。

8. 使用从BTE柑橘接穗提取物中纯化的RNA评估柑橘病毒和类病毒的交叉污染和检测

注意:在该协议中，我们使用来自72棵未感染的柑橘树和一棵混合感染病毒和类病毒的树的接穗样品来评估BTE处理时样品之间交叉污染的可能性（图2，右侧，步骤1，步骤5和步骤6）以及从BTE制备的树皮组织提取物中纯化的RNA的适用性，可用作柑橘病毒和类病毒RT-qPCR检测的模板。

  1. 第一次BTE样本处理:对72个未感染的样本进行基线实验。
    1. 准备三个 （A-C） BTE 室（步骤 4.1.1）。
    2. 在BTE手提袋中制备所有未感染的柑橘接穗样品（1-72），并在双注射器BTE样品收集系统中制备相同数量的（72），每个样品有一个注射器系统（步骤2.4）。
    3. 将样品袋和样品收集注射器分成六批 （I-VI），每批 12 个样品。
    4. 按照下面的顺序（步骤8.1.4.1-8.1.4.6）开始BTE柑橘接穗组织处理（步骤4）（见 表1，第一次BTE样品处理）。
      1. 对于批次 I/样品 1-12，使用腔室 A 处理 12 个样品.在样品 12 之后对腔室 A 进行消毒（步骤 5）。
      2. 对于批次II/样品13-24，使用腔室B处理12个样品，在样品24（步骤5）后对腔室B进行消毒。
      3. 对于批次 III/样品 25-36，使用腔室 C 处理 12 个样品，在样品 36 后对腔室 C 进行消毒（步骤 5）。
      4. 对于批次IV/样品37-48，使用消毒室A处理12个样品（步骤8.1.4.1）。
      5. 对于批次 V/样品 49--60，使用消毒室 B 处理 12 个样品（步骤 8.1.4.2）。
      6. 对于批次VI/样品60-72，使用消毒室C处理12个样品（步骤8.1.4.3）。
    5. 将装有所有样品的BTE手提袋储存在4°C，直到在步骤8.2中使用。
    6. 使用监管批准的基于磁珠的半自动方法8,23,28从步骤8.1.4.1-8.1.4.6中生成的72个植物汁液样品中提取和纯化RNA。
    7. 执行RT-qPCR以检测柑橘病毒和类病毒，如前所述8,33。
  2. 对于第二次BTE样品处理，对70个未感染样品和两个混合感染样品进行交叉污染实验。
    1. 准备三个 （A-C） BTE 室（步骤 4.1.1）。
    2. 将混合感染的柑橘接穗样品（73）准备在两个BTE手提袋（步骤1.3）中，总共有两个感染的样品。
    3. 收集装有步骤8.1.5中未感染的柑橘接穗样品的BTE手提袋，除了样品3-批次I和样品51-批次V（见步骤8.2.4中的样品更换），总共有70个未感染的样品。
    4. 包括第一个BTE手提袋，其中混合感染的样品73代替批次I中的样品3，第二个载体袋代替批次V中的样品51，总共72个样品。
    5. 在双注射器BTE样品收集系统中制备相同数量（72），每个样品有一个双注射器系统（步骤2.4）。
    6. 将 72 个样品载体袋和样品收集注射器分成六批 （I-VI），每批 12 个样品。
    7. 按照与步骤8.1.4.1-8.1.4.6相同的顺序启动BTE柑橘接穗组织加工（步骤4）。
      注意:唯一的区别是用受感染的样品73替换批次I中的样品3和批次V中的样品51（步骤8.2.4）（表1，第二次BTE样品处理）。
    8. 如步骤8.1.6所示，从步骤8.2.7中生成的72种植物汁液样品中提取并纯化RNA。
    9. 执行RT-qPCR以检测柑橘病毒和类病毒，如步骤8.1.7所示。

结果

使用 BTE 加工的接穗柑橘组织进行 RNA 提取、纯化和质量，并评估组织处理时间
我们使用来自255棵代表性柑橘树的接穗样品进行此测试，以比较BTE与标准程序的RNA质量。样品由接穗组织提取器（BTE）（方案步骤4.1-4.6和图2，右侧，步骤1，步骤5和步骤6）处理或按照法规批准的柑橘接穗组织处理方法制备，该方法利用手工去皮和切碎，冷冻干燥，粉碎和树皮组织的离心，如Dang等人所述...

讨论

随着HLB柑橘病的出现，为了减少损失，柑橘行业、监管机构和诊断实验室被敦促依靠高通量核酸提取方法与低通量手动样品处理和病原体检测分析相结合，如qPCR34 ，结合疾病管理实践35对单个树木进行测试35.加州的HLB阳性率从2012年的0.01%上升到2020年的1.2%。尽管qPCR是一种强大而可靠的病原体检测工具，但目前可用的技术不允许对足够数量的植物组织进行采样和?...

披露声明

作者声明没有相互竞争的经济利益。

致谢

作者承认Cahuilla人是完成实验工作的土地的传统监护人。我们感谢加州大学河滨分校的Norman Ellstrand教授提供实验室空间，以便在UCR加州农业和食品企业（CAFÉ）倡议下为该项目开展研究活动。这项研究得到了CDFA-特种作物整笔拨款计划（拨款号18-0001-055-SC）的支持。CRB项目6100也提供了额外的支持;美国农业部国家食品和农业研究所，哈奇项目1020106;以及国家清洁植物网络-美国农业部动植物卫生检验局（AP17PPQS&T00C118，AP18PPQS&T00C107，AP19PPQS&T00C148和AP20PPQS&T00C049授予乔治斯·维达拉基斯。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.08" Hex Trimmer linePowerCareFPRO07065Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressorCalifornia Air Tools8010Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tubeGlobe Scientific111558BStore sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe SetTechnology Evolving SolutionsTE006-F1-10A-G1000-E1Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach
12" RulerWestcott‎16012To measure trimmer line before cutting
12% Sodium HypochloriteHasa1041Disinfects chambers after processing
-20 C FreezerInsigniaNS-CZ70WH0Store sample after processing
4" x 12" plastic bagsPlymorFP20-4x12-10Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton SwabPuritan806-PCLSwab to remove clogs
7 Gallon Storage ToteHDX206152Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gunJASTIND‎JTABG103ADirects air into the chambers at high pressure
Black SharpieSharpie S-19421Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top DispensorBrandZ627569Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE ChamberTechnology Evolving SolutionsTE002BB-A05-E1Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish SoapDawn57445CTSurfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filterAir ScienceP5-36XT-AFume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping containerPolarTech261/J50CInsulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coatRed KapKP14WH LN 46Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
LaptopMicrosoftSurfaceWifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable PhoneSamsungGalaxy S9Phone to download and use TES phone app
NFC clip tagTechnology Evolving SolutionsTE005-Clip-E1Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar TagTechnology Evolving SolutionsTE005-Collar-E1Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile GlovesUsa Scientific3915-4400Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff3M90565-4DC-PSProtect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air HoseFYPower‎510019Attaches air gun to compressor
Saftey glassesSolidworkSW8329-USProtect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottleJohnBeeB08QM81BJVSpray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor BaseTechnology Evolving SolutionsTE001-A-E1System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight ScaleTechnology Evolving SolutionsTE003-A05-200g-01-E1200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield 
VermiculiteEasyGoProductsB07WQDZGRPNeeded to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire CutterBoenfu‎BOWC-06002-USWire cutters to cut trimmer line

参考文献

  1. Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
  2. Vernière, C., et al. Citrus viroids: Symptom expression and effect on vegetative growth and yield of clementine trees grafted on trifoliate orange. Plant Disease. 88 (11), 1189-1197 (2004).
  3. Zhou, C., Talon, M., Caruso, M., Gmitter, F. G., et al. Chapter 19 - Citrus viruses and viroids. The Genus Citrus. , 391-410 (2020).
  4. Trends and issues facing the U.S. citrus industry. Choices Magazine Online Available from: https://www.choicesmagazine.org/choices-magazine/theme-articles/trends-and-challenges-in-fruit-and-tree-nut-sectors/trends-and-issues-facing-the-us-citrus-industry (2021)
  5. Fruit and Tree Nuts Outlook. United States Department of Agriculture-Economic Research Service Available from: https://www.ers.usda.gov/webdocs/outlooks/98171/fts-370.pdf?v=5697 (2020)
  6. Forsyth, J., Fruits Damiani, J. C. i. t. r. u. s. Citrus Fruits. Types on the market. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. , 1329-1335 (2003).
  7. Bostock, R. M., Thomas, C. S., Hoenisch, R. W., Golino, D. A., Vidalakis, G. Plant health: How diagnostic networks and interagency partnerships protect plant systems from pests and pathogens. California Agriculture. 68 (4), 117-124 (2014).
  8. Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).
  9. Wang, J., et al. Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale. Frontiers in Microbiology. 4, 366 (2013).
  10. Gergerich, R. C., et al. Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization. Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).
  11. Moreno, P., Ambrós, S., Albiach-Martí, M. R., Guerri, J., Peña, L. Citrus tristeza virus: A pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology. 9 (2), 251-268 (2008).
  12. Yokomi, R. K., et al. Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California. Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).
  13. Selvaraj, V., Maheshwari, Y., Hajeri, S., Yokomi, R. A rapid detection tool for VT isolates of Citrus tristeza virus by immunocapture-reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay. PLoS One. 14 (9), 0222170 (2019).
  14. Babcock, B. A. Economic impact of California's citrus industry in 2020. Journal of Citrus Pathology. 9, (2022).
  15. Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).
  16. Yokomi, R., et al. Molecular and biological characterization of a novel mild strain of citrus tristeza virus in California. Archives of Virology. 163 (7), 1795-1804 (2018).
  17. Fuchs, M., et al. Economic studies reinforce efforts to safeguard specialty crops in the United States. Plant Disease. 105 (1), 14-26 (2021).
  18. The real cost of HLB in Florida. Citrus Industry Magazine Available from: https://citrusindustry.net/2019/07/30/the-real-cost-of-hib-in-florida/ (2019)
  19. McRoberts, N., et al. Using models to provide rapid programme support for California's efforts to suppress Huanglongbing disease of citrus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1776), 20180281 (2019).
  20. Albrecht, C., et al. Action plan for Asian citrus psyllid and huanglongbing (citrus greening) in California. Journal of Citrus Pathology. 7 (1), (2020).
  21. Navarro, L., et al. The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the period 1975-2001. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15 (15), (2002).
  22. Vidalakis, G., Gumpf, D. J., Polek, M. L., Bash, J. A., Ferguson, L., Grafton-Cardwell, E. E. The California Citrus Clonal Protection Program. Citrus Production Manual. , 117-130 (2014).
  23. Dang, T., Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G., et al. High-throughput RNA extraction from citrus tissues for the detection of viroids. In Viroids: Methods and Protocols. 2316, (2022).
  24. Osman, F., Vidalakis, G., Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. Real-time detection of viroids using singleplex and multiplex quantitative polymerase chain reaction. Viroids: Methods and Protocols. 2316, (2022).
  25. Li, R., et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Saponari, M., Manjunath, K., Yokomi, R. K. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 147 (1), 43-53 (2008).
  27. Damaj, M. B., et al. Reproducible RNA preparation from sugarcane and citrus for functional genomic applications. International Journal of Plant Genomics. 2009, 765367 (2009).
  28. Dang, T., et al. First report of citrus leaf blotch virus infecting Bearss lime tree in California. Plant Disease. 104 (11), 3088 (2020).
  29. Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques. 20 (6), 968-970 (1996).
  30. Teare, J. M., et al. Measurement of nucleic acid concentrations using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques. 22 (6), 1170-1174 (1997).
  31. Imbeaud, S. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 56-56 (2005).
  32. Menzel, W., Jelkmann, W., Maiss, E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods. 99 (1-2), 81-92 (2002).
  33. Vidalakis, G., Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G., et al. SYBR Green RT-qPCR for the universal detection of citrus viroids. Viroids: Methods and Protocols. , 211-217 (2022).
  34. Arredondo Valdés, R., et al. A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus. Canadian Journal of Microbiology. 62 (10), 803-811 (2016).
  35. Li, S., Wu, F., Duan, Y., Singerman, A., Guan, Z. Citrus greening: Management strategies and their economic impact. HortScience. 55 (5), 604-612 (2020).
  36. . CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019)

Erratum


Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

to:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

194 CLas HLB CTV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。